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    低劑量米諾環(huán)素對腦缺血再灌注大鼠RGMa表達(dá)的影響☆

    2015-02-06 07:59:29陶濤秦新月馮金洲
    中國神經(jīng)精神疾病雜志 2015年3期
    關(guān)鍵詞:軸突米諾環(huán)素

    陶濤秦新月馮金洲

    ·論 著·

    低劑量米諾環(huán)素對腦缺血再灌注大鼠RGMa表達(dá)的影響☆

    陶濤*秦新月*馮金洲*

    目的探討靜脈用低劑量米諾環(huán)素對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)及排斥性導(dǎo)向分子(repulsive guidance molecule A,RGMa)表達(dá)的影響。方法成年雄性Sprague-Dawley大鼠54只,隨機(jī)分為假手術(shù)組,缺血再灌注組和米諾環(huán)素組。采用大腦中動脈線栓法制作局灶性腦缺血再灌注模型。再灌注第2周,分別采用免疫組織化學(xué)及Western blot法檢測缺血腦組織內(nèi)RGMa及生長相關(guān)蛋白-43(growth associated pro?tein-43,GAP-43)蛋白的表達(dá)。缺血再灌注第2、7、14和28天,采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(modified neu?rological severity score,mNSS)及樓梯實(shí)驗(yàn)(staircase test)評估大鼠神經(jīng)功能。結(jié)果同缺血再灌注組相比,低劑量米諾環(huán)素使缺血側(cè)大腦皮層RGMa蛋白表達(dá)降低(0.53±0.08 vs.1.17±0.15,P<0.05),GAP-43蛋白表達(dá)明顯增高(0.94±0.10 vs.0.57±0.09,P<0.05),大鼠mNSS評分顯著下降并改善大鼠的前肢運(yùn)動功能(P<0.05)。結(jié)論靜脈用低劑量米諾環(huán)素(3 mg/kg)能促進(jìn)大鼠缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù),其機(jī)制可能與下調(diào)RG?Ma蛋白及上調(diào)軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)有關(guān)。

    米諾環(huán)素再灌注損傷大鼠

    lated to the down-regulation of RGMa expression and up-regulation of GAP-43 expression.【Key words】Minocycline Reperfusion injury Rats

    米諾環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類抗生素,在臨床上被廣泛用于抗炎及抗感染治療。近期大量研究表明米諾環(huán)素在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型中具有保護(hù)作用[1]。盡管米諾環(huán)素發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體分子機(jī)制尚不明確,但目前最新的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)顯示米諾環(huán)素對人體是安全且可能是有益的[2],并且是目前最有潛力的神經(jīng)保護(hù)劑之一。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠大腦中動脈閉塞模型觀察米諾環(huán)素對大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)、排斥性導(dǎo)向因子(repulsive guidance molecule A,RGMa)及生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein-43,GAP-43)蛋白表達(dá)的影響,從而探討其潛在的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)方法

    1.1.1 動物分組及給藥 54只清潔級雄性SD大鼠,體質(zhì)量250~280 g,購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)和米諾環(huán)素干預(yù)組(I/R+MC組),每組18只,分別進(jìn)行免疫印跡、免疫組化及大鼠神經(jīng)功能評分。干預(yù)組在再灌注的同時按1 mL/ l00 g的比例尾靜脈注射米諾環(huán)素(3 mg/kg,Sigma公司),每日2次,持續(xù)14 d。

    1.1.2 大鼠腦缺血再灌注模型的制作參照我們課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[3],用線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈阻塞/再灌注模型。術(shù)前12 h禁食不禁水。

    1.1.3 動物取材術(shù)后2周,選取18只大鼠用水合氯醛麻醉,經(jīng)心臟多聚甲醛灌流固定后,斷頭取腦,取缺血側(cè)大腦中動脈供血區(qū)腦組織(距額葉最前端5 mm到8 mm),石蠟包埋后制作成4 μm厚的冠狀切片,用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。另取18只大鼠,深度麻醉后直接斷頭取腦,取缺血腦組織,置于凍存管中放入-80℃長期保存,用于Western blot檢測。

    1.1.4 免疫組化檢測蛋白的表達(dá)選取4 μm厚的石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,微波加熱修復(fù)表面抗原后參照S-P法試劑盒說明書(北京中杉金橋公司)進(jìn)行免疫染色。DAB顯色陽性結(jié)果在光鏡下可見棕黃色顆粒。每只動物隨機(jī)選取10張非連續(xù)切片,每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)選擇5個視野,然后用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析。

    1.1.5 Western blot檢測蛋白的表達(dá) 將預(yù)存腦組織參照膜蛋白提取試劑盒說明書(南京凱基公司)提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,封閉1 h后加入特異性兔抗RGMa多克隆抗體(Cell Signaling公司)及兔抗GAP-43(武漢博士德公司)4℃孵育過夜,室溫孵育二抗2 h,凝膠成像儀中顯影拍照,用Quantity One軟件分析各條帶平均光密度值,以待測蛋白/β-actin光密度的比值表示蛋白表達(dá)水平。

    1.1.6 行為學(xué)評分參照改良神經(jīng)功能評分(mNSS)[4]及Montoya設(shè)計(jì)[5]的“樓梯測試”對術(shù)后第2、7、14及28天的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能、前肢運(yùn)動功能評價。

    1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均(±s)表示,多組間比較運(yùn)用AVO?NA分析,兩兩比較行LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 米諾環(huán)素對腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響假手術(shù)組在各時間點(diǎn)未出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀。缺血再灌注第2天,米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能評分與模型組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(10.67±1.03 vs.10.50±1.05,P>0.05),而缺血再灌注第1、2和4周,米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠mNSS評分明顯低于缺血再灌注組(6.33±1.03 vs.7.50±1.22; 4.67±1.03 vs.6.83±0.75;3.33±0.52 vs.5.83±0.75;P<0.05);術(shù)前各組大鼠樓梯測試左前肢運(yùn)動功能無明顯差異(P>0.05),術(shù)后第2及4周,米諾環(huán)素干預(yù)組大鼠左前肢抓取食物粒明顯多于缺血再灌注組(8.83±1.47 vs.6.33±1.75;9.33±1.21 vs.6.67± 1.03,P<0.05,表1)。

    2.2 米諾環(huán)素對腦缺血大鼠RGMa蛋白表達(dá)的影響

    2.2.1 免疫組化檢測大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa蛋白的表達(dá) 免疫組化檢測結(jié)果顯示RGMa蛋白均陽性

    表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞膜,呈棕色顆粒。假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)可見少量RGMa表達(dá),陽性細(xì)胞數(shù)為(22.00±6.32)。與正常組相比,缺血再灌注2周后,模型組(74.75±9.64)RGMa表達(dá)明顯增多(P<0.05),米諾環(huán)素干預(yù)后RGMa表達(dá)量明顯降低(49.75±4.50,P<0.05)(圖1)。

    2.2.2 Western blot檢測大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa蛋白的表達(dá) 免疫印跡檢測結(jié)果顯示,假手術(shù)組RG?Ma蛋白表達(dá)量相對值為(0.31±0.29),缺血再灌注組為(1.17±0.15),米諾環(huán)素干預(yù)組為(0.53±0.08),模型組RGMa的表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05),米諾環(huán)素干預(yù)組RGMa的表達(dá)明顯低于缺血再灌注組(P<0.05,圖3)。

    2.3 米諾環(huán)素對腦缺血大鼠GAP-43蛋白表達(dá)的影響

    2.3.1 免疫組化檢測大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)GAP-43蛋白的表達(dá) 免疫組化檢測結(jié)果顯示假手術(shù)組皮質(zhì)可見少量GAP-43陽性細(xì)胞(19.25±3.40),GAP-43蛋白主要位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿,呈棕褐色,陽性細(xì)胞散在分布。缺血再灌注第2周,缺血再灌注組缺血側(cè)皮質(zhì)GAP-43(30.50±4.66)的表達(dá)同假手術(shù)組相比明顯降低(P<0.05),米諾環(huán)素干預(yù)組GAP-43(59.25±8.22)的表達(dá)顯著增加,同缺血再灌注組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.3.2 Western blot檢測大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)GAP-43蛋白的表達(dá) Western blot檢測結(jié)果顯示,缺血再灌注第2周,模型組GAP-43蛋白的表達(dá)(0.57±0.09)高于假手術(shù)組(0.27±0.09),同缺血再灌注組相比,米諾環(huán)素干預(yù)組(0.94±0.10)GAP-43蛋白的表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

    3 討論

    缺血性卒中患者殘留嚴(yán)重而持久的神經(jīng)功能障礙是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)可塑性差,受損的軸突再生困難。目前的研究表明CNS軸突再生障礙的關(guān)鍵因素并不是因?yàn)樯窠?jīng)元完全喪失了內(nèi)源性再生的能力,而是因?yàn)樗鼈兲幱谝粋€不利于生長的抑制性微環(huán)境[6]。CNS存在多種軸突再生抑制分子包括:硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs),No?go-A,髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG),少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp),Semaphorin,Ephrin及Slits等[7-8]。

    圖1 大鼠缺血再灌注2周后缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa免疫組化染色(標(biāo)尺:50 μm)A假手術(shù)組;B缺血再灌注組;C米諾環(huán)素干預(yù)組

    圖2 大鼠缺血再灌注2周后缺血側(cè)皮質(zhì)GAP-43免疫組化染色(標(biāo)尺:50 μm)A假手術(shù)組;B缺血再灌注組;C米諾環(huán)素干預(yù)組

    圖3 Western blot檢測各組蛋白的表達(dá) ①假手術(shù)組;②缺血再灌注組;③米諾環(huán)素干預(yù)組

    表1 各組大鼠樓梯試驗(yàn)結(jié)果

    RGMa是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的軸突再生抑制因子。人局灶性腦缺血和外傷性腦損傷后,病灶中

    心及其周圍RGMa蛋白的表達(dá)升高[9]。動物實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)大鼠局灶性腦缺血后RGMa基因和蛋白在缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬持續(xù)增高,給予RGMa特異性RNA干擾后可顯著促進(jìn)軸突再生,改善大鼠神經(jīng)功能[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)大鼠局灶性腦缺血后第2周,缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa表達(dá)明顯增高,而GAP-43表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低,表明RGMa可能參與腦缺血后軸突再生調(diào)節(jié)。米諾環(huán)素作為一種潛在在神經(jīng)保護(hù)劑,因其具有廣譜抗炎癥、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激及血管保護(hù)活性而得到廣泛關(guān)注[11]。以往的動物實(shí)驗(yàn)顯示腹腔注射大劑量米諾環(huán)素可以促進(jìn)鼠腦缺血后神經(jīng)功能的改善[12-13],Xu[14]等首次報道低劑量米諾環(huán)素也可以降低腦梗死體積。本研究前期研究也發(fā)現(xiàn),尾靜脈給予低劑量米諾環(huán)素(3 mg/ kg)對大鼠缺血性腦損傷具有保護(hù)作用,可以減少腦梗死體積,降低血腦屏障的通透性,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及促炎因子HMGB1的釋放[15]。Kitaya?ma等[16]研究發(fā)現(xiàn),大鼠脊髓損傷后,米諾環(huán)素可以抑制病灶周圍小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,使RGMa表達(dá)下調(diào),從而促進(jìn)軸突的再生。本研究發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射3 mg/kg的米諾環(huán)素,能改善大鼠局灶性腦缺血后mNSS及大鼠的前肢運(yùn)動功能,同Xu[12]等報道一致。并進(jìn)一步采用免疫組化及免疫印跡法發(fā)現(xiàn),低劑量米諾環(huán)素可以抑制缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa的表達(dá)并促進(jìn)軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)。

    綜上所述,尾靜脈給予低劑量(3 mg/kg)米諾環(huán)素可以促進(jìn)大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù),其機(jī)制可能與抑制缺血側(cè)皮質(zhì)RGMa蛋白的表達(dá),促進(jìn)軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)有關(guān)。本研究進(jìn)一步證明低劑量米諾環(huán)素對缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。

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    Effects of low dose minocycline on the expression of RGMa in a rat model of middle cerebral artery occlu?sion and reperfusion

    .TAO Tao,QIN Xinyue,FENG Jinzhou.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China.Tel:023-89012478.

    ObjectiveTo explore the effects of low dose intravenous minocycline on neurological function and the expression of RGMa in rats after focal cerebral ischemia reperfusion.MethodsFifty-five adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group,cerebral ischemia/reperfusion(I/R)group and minocycline-treat?ed group.The cerebral ischemia/reperfusion model was established by 2 h of middle cerebral artery occlusion.At 2 weeks after ischemia reperfusion,the expression levels of RGMa and growth associated protein 43(GAP-43)were ana?lyzed by using immunohistochemistry and Western blot,respectively.Neurological functional recovery was evaluated us?ing both the modified neurological severity score(mNSS)and staircase test at 2,7,14 and 28 d after ischemia reperfusion.ResultsMinocycline at a dose of 3 mg/kg via the caudal vein significantly reduced the expression of RGMa protein(0.53± 0.08 vs.1.17±0.15,P<0.05)and enhanced the expression of GAP-43 protein(0.94±0.10 vs.0.57±0.09,P<0.05)in isch?emic cortex 2 weeks after ischemia reperfusion.Moreover,minocycline could reduce mNSS and improve forelimb motor function when compared to the I/R group(P<0.05).ConclusionsLow dose intravenous minocycline(3 mg/kg)can im?prove neurological functional recovery in a rat model of focal cerebral ischemia reperfusion and the mechanism may be re?

    R743.31

    A

    2014-04-14)

    (責(zé)任編輯:李立)

    10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.003

    ☆ 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號:30770762);四川省衛(wèi)生計(jì)生委資助項(xiàng)目(編號:140032);四川省教育廳資助項(xiàng)目(編號:15ZA0168);瀘州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號:2014S4506)

    * 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(重慶 400016)

    △ 瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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