基于IPA分析自噬對大鼠肝再生中樹突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

王棋文，靳偉，常翠芳，徐存拴

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基于IPA分析自噬對大鼠肝再生中樹突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

王棋文1,2,3，靳偉1,2,3，常翠芳1,2,3，徐存拴1,2,3

1. 河南師范大學(xué)，河南省生物工程重點實驗室，新鄉(xiāng) 453007；2. 河南師范大學(xué)，河南省-科技部共建細(xì)胞分化調(diào)控國家重點實驗室培育基地，新鄉(xiāng) 453007；3. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007

為探討自噬對大鼠肝再生中樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)的調(diào)節(jié)作用，文章通過Percoll 密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠分選分離大鼠DCs，Rat Genome 230 2.0芯片檢測大鼠肝再生中自噬相關(guān)基因表達(dá)變化，利用IPA等軟件分析自噬在DCs中的生理活動。結(jié)果表明，、、和等關(guān)鍵基因在部分肝切除后不同恢復(fù)時間段有明顯表達(dá)變化；芯片中對應(yīng)的自噬相關(guān)基因為593個，其中210個基因發(fā)生了有意義的變化。比較分析自噬生理活動情況，發(fā)現(xiàn)自噬在再生早期和晚期階段增強，增殖期減弱。與自噬相關(guān)的生理活動主要有RNA表達(dá)、RNA轉(zhuǎn)錄細(xì)胞分化和增殖，其中涉及的信號通路主要有PPARα/RXRα激活、急性期反應(yīng)、TREM1 信號通路、IL-6 信號通路、IL-8 信號通路和IL-1 信號通路等，它們在肝再生階段發(fā)生了不同程度的上調(diào)或下調(diào)。Cluster 分析還發(fā)現(xiàn)，P53和AMPK信號參與調(diào)控DCs的自噬活動，在肝再生早期主要是AMPK信號，在肝再生末期P53和AMPK信號共同參與自噬的調(diào)節(jié)。以上研究結(jié)果說明DCs自噬可能在肝再生早期激活細(xì)胞免疫反應(yīng)和后期清除DCs等方面發(fā)揮著重要作用。

肝再生；自噬；樹突狀細(xì)胞；Rat Genome 230 2.0 芯片；IPA

肝臟再生是指正常肝臟出現(xiàn)急、慢性損傷時(如手術(shù)、感染等)，肝組織重新修復(fù)的過程。正常條件下，肝細(xì)胞很少分裂，但是在手術(shù)切除、病毒或化學(xué)性損傷后，肝臟有驚人的再生能力。肝切除后早期應(yīng)激信號的發(fā)生可能是增加每單位肝臟質(zhì)量對能量需求的結(jié)果，剩余的肝組織繼續(xù)保留了肝臟特異性的功能如：糖異生、尿素合成和蛋白質(zhì)、核酸以及其他細(xì)胞成分合成所必須的ATP[1, 2]。但是目前對于肝臟切除后正常肝功能恢復(fù)的潛在機制(新陳代謝的作用、細(xì)胞成分的重組等)仍未完全闡明。

自噬，即“細(xì)胞的自我消化”，是將細(xì)胞成分(線粒體、折疊蛋白、細(xì)胞內(nèi)病原體等)通過溶酶體途徑降解的過程[3]。自噬在維持肝臟功能的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用，肝臟通過自噬消除有聚集傾向的蛋白質(zhì)、受損的線粒體以及腫脹的肝細(xì)胞。研究表明，抑制自噬會造成肝腫大，隨后是炎癥、肝炎和腫瘤發(fā)生[4]。自噬水平的降低會導(dǎo)致()的積聚。作為一種信號樞紐激活NF-κB的信號傳導(dǎo)途徑，通過的轉(zhuǎn)錄因子活化編碼抗氧化蛋白和解毒酶的基因轉(zhuǎn)錄[5]。肝臟中的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)屬于巨噬細(xì)胞系家族成員，在啟動和調(diào)節(jié)肝臟免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。2/3肝切除后，一方面DCs被激活，通過吞噬作用和凝集素介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來攝取、加工、降解抗原。另一方面，DCs從門靜脈遷移至中央靜脈，最后通過竇周間隙到達(dá)肝淋巴系統(tǒng)，捕獲抗原并通過MHC II呈遞給T細(xì)胞，啟動免疫反應(yīng)[6]。但目前對于肝再生過程中自噬在DCs中的作用尚未見文獻(xiàn)報道。本研究利用Percoll 密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠分選分離大鼠DCs，全基因組表達(dá)譜芯片Rat Genome 230 2.0檢測大鼠 2/3 肝切除后0、2、6、12、24、30、36、72、120、168 h 等10個時間點的基因表達(dá)譜，用生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等方法分析DCs中調(diào)控自噬的關(guān)鍵通路以及自噬與免疫的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 大鼠2/3肝切除及DCs分離與鑒定

SD大鼠由河南師范大學(xué)實驗動物中心提供。體重230±20 g，每組6只。9 組部分肝切除(Partial hepatectomy, PH)，9 組手術(shù)對照(Sham operation, SO)，1 組正常對照。外科手術(shù)方法切除大鼠的肝左葉和肝中葉，縫合切口，傷口外敷磺胺消炎。參考常翠芳等[7]的方法，在PH后0、2、6、12、24、30、36、72、120、168 h分離DCs(麻醉大鼠，打開腹腔，暴露肝臟，兩步灌流，Percoll離心收集非實質(zhì)細(xì)胞)。CD11c抗PE抗體4℃孵育 15 min，加入 10 μL/mL抗CD11c-PE 分選磁珠繼續(xù)孵育 15 min，然后將“細(xì)胞-磁珠”懸液加入分選柱中，讓其自然流出，PBS清洗分選柱后移去分選磁場，再將分選柱PBS下沖洗兩次，沖洗出陽性結(jié)合細(xì)胞。免疫組化檢測鑒定細(xì)胞[8]。

1.2 Rat Genome 230 2.0芯片檢測與分析

分離、純化的DCs提取RNA后，進(jìn)行Rat Genome 230 2.0 芯片檢測[9]。對基因芯片表達(dá)譜中的基因做均一化處理，用實驗組比對照組的值得到基因的比值(ratio值)。當(dāng)一個基因的ratio值≥對照3倍，或≤對照0.33倍時，該基因變化有意義。檢驗PH組與SO組的基因表達(dá)變化差異性，將差異顯著(﹤0.05)或極顯著(﹤0.01)并且PH后一個恢復(fù)時間點發(fā)生有意義表達(dá)變化的基因視為大鼠肝再生相關(guān)基因。為減少實驗操作和芯片分析誤差，每個時間點的樣品均重復(fù)檢測3次。對基因芯片檢測結(jié)果的可靠性采用qRT-PCR方法進(jìn)行確認(rèn)[8]。

1.3 自噬相關(guān)基因的確認(rèn)

根據(jù) GENEONTOLOGY 網(wǎng)站(www.geneo-nto-lo-gy.org)的生理活動分類，將“自噬”輸入NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)和RGD(rgd.mcw.edu)等網(wǎng)站查找大鼠、小鼠和人的相關(guān)基因，并通過IPA、Pathwaystudio等軟件中的自噬信號網(wǎng)絡(luò)對上述基因進(jìn)行補充，最終確定自噬調(diào)節(jié)相關(guān)基因。

1.4 大鼠肝再生DCs中自噬信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

首先將獲得的自噬相關(guān)基因分別導(dǎo)入IPA、Path-way-studio中，通過“Core Analysis”和“Enrich-ment Analysis”獲得自噬調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路和生理活動，根據(jù)-log (-value)值的大小進(jìn)行排序，初步篩選出可能的信號通路和生理調(diào)節(jié)活動。

將確認(rèn)的自噬相關(guān)基因與芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，獲得芯片中的自噬相關(guān)基因在肝再生過程中的表達(dá)情況，通過“Dataset Files”導(dǎo)入IPA，進(jìn)行“Core Analysis”和“Comparison Analyse”，在“Canonical Pathways”和“Diseases and Functions”得到相關(guān)信號通路和生理活動的-log (-value)值。將兩次獲得的自噬信號通路和生理活動進(jìn)行比較分析，結(jié)合基因在大鼠部分肝切除后不同時間段的表達(dá)，分析DCs中自噬及與自噬相關(guān)的其他生理活動變化情況，找出可能的調(diào)控信號通路，并利用Cluster 和 Treeview 等軟件繪制出相關(guān)生理活動和信號通路的表達(dá)模式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 自噬關(guān)鍵基因在芯片中的表達(dá)情況

為了分析自噬在肝再生DCs中的作用，本研究首先觀察了、、、在2/3肝切除后不同恢復(fù)時間段的變化，從圖1中可以看出、、在激活期(PH 后 0.5~6 h)和終止期(PH后72~168 h)有不同程度的表達(dá)上調(diào)，在0~168 h內(nèi)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。的表達(dá)變化最為顯著。

圖1 自噬關(guān)鍵基因在大鼠肝再生DCs中的表達(dá)變化

2.2 自噬的生理活動情況

本研究進(jìn)一步在NCBI和RGD等網(wǎng)站查找，得到與自噬相關(guān)基因814個，與芯片中對應(yīng)的基因有593個，發(fā)生有意義變化的基因210個。由圖2A可以看出，在2~168 h 等9個時間段內(nèi)，上調(diào)/下調(diào)的基因數(shù)分別為41/1、66/11、39/33、74/37、50/21、40/61、31/4、31/2、14/13。利用IPA比較分析自噬生理活動情況，自噬在再生早期和晚期階段增強，增殖期減弱(圖2B)。Cluster 分析還發(fā)現(xiàn)，P53和AMPK信號參與調(diào)控DCs的自噬活動，在肝再生早期，主要是AMPK信號，肝再生末期P53和AMPK信號共同參與自噬的調(diào)節(jié)。

2.3 與自噬相關(guān)的其他生理活動變化情況

由圖3可以看出，DCs中與自噬相關(guān)的生理活動主要有RNA表達(dá)、RNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化和增殖等，其中涉及到的信號通路主要有PPARα/RXRα激活、急性期反應(yīng)、TREM1 信號通路、IL-6 信號通路、IL-8 信號通路和IL-1 信號通路等，它們在肝再生階段發(fā)生了不同程度的上調(diào)或下調(diào)。

2.4 P53和AMPK信號通路調(diào)節(jié)肝再生中DCs自噬的途徑和方式

從IPA、RGD、KEGG和QIAGEN等網(wǎng)站分析P53信號通路與自噬的關(guān)系，結(jié)合芯片中基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在P53信號通路中，等12個基因發(fā)生了有意義的變化，可能參與了自噬的調(diào)節(jié)(表1)。用IPA軟件解析上述基因的作用途徑和方式，自噬的發(fā)生可能是通過以下途徑：自噬；自噬；→自噬。

圖2 肝再生DCs中自噬及其相關(guān)信號通路的生理活動的生物信息學(xué)分析

A：自噬相關(guān)基因的表達(dá)情況；B：自噬及相關(guān)信號通路的熱圖分析。

圖3 肝再生DCs中與自噬相關(guān)的生理活動及信號通路的生物信息學(xué)分析

A：與自噬相關(guān)的生理活動熱圖分析；B：與生理活動相關(guān)的信號通路熱圖分析。

表1 P53信號通路相關(guān)基因表達(dá)變化

從芯片中發(fā)現(xiàn)AMPK信號通路與自噬調(diào)節(jié)相關(guān)(表2)。分析得出，自噬的發(fā)生可能通過以下途徑：→自噬；→自噬。

3 討論

肝臟再生是一個非常復(fù)雜的過程，伴隨著細(xì)胞分化、增殖以及組織結(jié)構(gòu)重建等一系列生理活動。肝臟中的DCs僅占肝臟細(xì)胞總數(shù)的0.3%~0.6%，但在刺激、誘導(dǎo)靜息T細(xì)胞增殖，激發(fā)免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[10]。

表2 AMPK通路相關(guān)基因表達(dá)變化

對于自噬與肝再生的關(guān)系，國內(nèi)外已經(jīng)有少量文獻(xiàn)報道，C57BL/6小鼠肝臟切除后，自噬水平的降低一直貫穿于再生早期。而自噬的誘導(dǎo)劑卡馬西平卻能促進(jìn)肝臟再生，同時降低肝損傷[11]。在敲除的小鼠模型中，70%肝臟切除后肝再生過程受到嚴(yán)重影響，有絲分裂減少，同時代償性的肝肥大和老化肝細(xì)胞增多[12]。本研究結(jié)果表明，自噬的關(guān)鍵基因、、、在大鼠肝再生DCs中發(fā)生了不同程度上調(diào)或下調(diào)變化，有明顯的時間-依賴關(guān)系。聚類分析結(jié)果也可以看出，自噬在再生早期和晚期有明顯上調(diào)，說明其可能參與了DCs的生理活動調(diào)節(jié)。

自噬不但在維持自身穩(wěn)定方面發(fā)揮作用，而且也參與免疫、炎癥抗原遞呈、T細(xì)胞免疫反應(yīng)等生理或病理過程。敲除或基因，CD4+和CD8+周邊T淋巴細(xì)胞很快凋亡，二級淋巴器官數(shù)量減少，T細(xì)胞抗原受體刺激之后的增殖反應(yīng)受到抑制[13]。自噬還影響胞質(zhì)內(nèi)抗原的呈遞反應(yīng)，如MHC II類分子的組成[14]，T細(xì)胞發(fā)育、分化、極化和穩(wěn)態(tài)等[15]。本實驗室前期研究結(jié)果已經(jīng)指出，大鼠肝再生DCs中細(xì)胞因子分泌、免疫、防御、炎性反應(yīng)等生理活動在肝切除早期迅速升高，增殖期沒有明顯增加，但在終止期顯著降低[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝再生DCs中與自噬相關(guān)的生理活動主要有RNA表達(dá)，RNA轉(zhuǎn)錄細(xì)胞分化和增殖，主要受PPARα/RXRα激活、急性期反應(yīng)、TREM1 信號通路、IL-6 信號通路、IL-8 信號通路和IL-1 信號通路的調(diào)節(jié)，在再生早期和晚期都有一個高峰，說明DCs自噬可能在肝再生早期啟動細(xì)胞免疫反應(yīng)，后期清除DCs和誘導(dǎo)DCs凋亡等方面發(fā)揮重要作用，有待進(jìn)一步運用其他生物學(xué)方法進(jìn)行驗證。

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)依賴溶酶體，降解細(xì)胞內(nèi)的長壽命蛋白和受損的細(xì)胞器的一種降解途徑，受mTOR、AMPK、P53等信號通路的調(diào)控[16, 17]。是一種腫瘤抑制基因，主要的功能是作為轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮維持基因組穩(wěn)定的作用。此外，還參與泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解，其活性高低受靶基因的調(diào)節(jié)。在正常細(xì)胞中，處于較低水平。但是在各種應(yīng)激條件下，如DNA損傷、缺氧等，受到抑制，通過激活下游分子，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[18]。[19, 20]等分子也可以通過調(diào)節(jié)的水平進(jìn)而影響自噬進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，肝再生早期樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)雖有升高，但其下游自噬底物表達(dá)反而降低，說明此時的激活主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA 損傷識別和修復(fù)。同時的低表達(dá)有助于增強應(yīng)激條件下細(xì)胞的長期生存能力[21]，激活期p53信號可能并沒有參與早期自噬的調(diào)節(jié)。但在肝再生后期，的活化促進(jìn)了的表達(dá)，進(jìn)一步激活自噬，參與抑制DCs的增殖，防止過度免疫反應(yīng)。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是LKB1的重要底物，被認(rèn)為是真核生物的“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”，AMPK的功能可能與各亞基有密切關(guān)系，其中僅α亞基為催化單位，主要有α1/α2 兩種異構(gòu)形式，即和。上游磷酸化催化亞基，從而使活化。一方面，開啟分解代謝途徑產(chǎn)生ATP，同時關(guān)閉合成代謝途徑以減少ATP的消耗。另一方面，的激活介導(dǎo)了的活化作用，進(jìn)一步抑制的生物功能。是自噬發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，失活，導(dǎo)致去磷酸化，進(jìn)而激活，最終誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。最近的研究指出，肝臟經(jīng)過乙醇處理會通過上調(diào)磷酸酶抑制的功能，進(jìn)而抑制的活化，刺激自噬的發(fā)生。而長期的酒精暴露會降低肝自噬水平，這可能是水平降低、乙醇的囊泡運輸受到抑制所引起。肝臟缺血再灌注損傷過程中，[22]和[23]的表達(dá)也啟動了介導(dǎo)保護(hù)性的自噬反應(yīng)。從本研究結(jié)果可以看出，肝再生早期和末期AMPK信號表達(dá)均有上調(diào)，與自噬的生理活動基本一致，說明大鼠部分肝切除，引起DCs的應(yīng)激反應(yīng)，促使調(diào)節(jié)能量代謝的分子激活，誘導(dǎo)自噬過程，參與DCs的增殖、防止感染和免疫應(yīng)答；另外一方面，在肝再生后期，活化引起自噬的同時，進(jìn)一步激活A(yù)MPK信號通路[24]，兩者共同促進(jìn)自噬的發(fā)生，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，清除過度增殖的DCs，防止過度免疫反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)的表達(dá)在整個再生過程中都處于較高的水平，可能除了調(diào)節(jié)自噬活動，激活的同時還參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)翻譯等過程[25, 26]，有待于進(jìn)一步實驗驗證。

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(責(zé)任編委: 張博)

Regulation of autophagy on dendritic cells during rat liver regeneration by IPA

Qiwen Wang1,2,3, Wei Jin1,2,3, Cuifang Chang1,2,3, Cunshuan Xu1,2,3

To understand the mechanism underlying autophagy in regulating dendritic cells during rat liver regeneration, we used the method of percoll density gradient centrifugation combined with immunomagnetic bead to isolate dendritic cells, the Rat Genome 230 2.0 Array to determine the expression changes of autophagy-related genes, and Ingenuity Pathway Analysis 9.0 (IPA) to determine the autophagy activities. The results indicated that,,andgenes had significant expression changes during rat liver regeneration. There were 593 genes related to autophagy, among which 210 genes were identified as significant. We also showed that the activity of autophagy was enhanced in the priming phase and teminal phase of liver regeneration, weakened in the proliferative stage by comparative analysis method of IPA. The autophagy-related physiological activities mainly included RNA expression, RNA transcription, cell differentiation and proliferation, involving in PPARα/RXRα activation, acute phase response signaling, TREM1 signaling, IL-6 signaling, IL-8 signaling and IL-1 signaling, whose activities were increased or decreased in liver regeneration. Cluster analysis found that P53 and AMPK signaling participated in the regulation of dendritic cells autophagy, with AMPK signaling in the priming phase of liver regeneration, and both signaling pathways in the terminal phase. We conclude that dendritic cells autophagy played an important role in initiation of the immune response in priming phase and depletion of dendritic cells in late phase during rat liver regeneration.

rat liver regeneration; autophagy; dendritic cells; Rat Genome 230 2.0 Array; ingenuity pathway analysis

2014-11-13;

2015-01-12

河南省重大科技攻關(guān)項目(編號：111100910600)，河南師范大學(xué)博士啟動課題(編號：qd14175)和河南師范大學(xué)青年科學(xué)基金項目 資助

王棋文，博士研究生，研究方向：肝再生的分子機理。E-mail: wangqiwen@htu.edu.cn

徐存拴，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：肝再生的分子機理。E-mail: xucs@x263.net

10.16288/j.yczz.14-391

2015-1-28 15:17:44

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150128.1517.003.html