埃博拉病毒疫苗研究進展及相關(guān)專利淺析

李有朝, 蔡玉品, 郝 佳

國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心, 北京 100086

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)疫情從2014年2月開始在西非肆虐，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)在2014年9月4日發(fā)布消息稱，截止到2014年8月31日，幾內(nèi)亞、利比亞和塞拉利昂衛(wèi)生部在本次EBOV疫情中報告發(fā)生了3 865例(可能、確診和疑似)病例及1 841例死亡；此外，尼日利亞和塞內(nèi)加爾分別出現(xiàn)了21例(其中7例死亡)和1例[1]，為控制疫情的蔓延，EBOV疫苗開發(fā)得到前所未有的關(guān)注。葛蘭素史克(GlaxoSmithKline Plc，GSK)與美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)共同開發(fā)EBOV候選疫苗的首個人體試驗啟動以來，該項目取得重大突破，疫苗已運抵疫區(qū)開展臨床試驗[2]。

埃博拉病毒屬于絲狀病毒科(Filoviridae)，可引起人及靈長類動物的出血熱癥狀，如急性發(fā)熱、肌肉酸痛、出血、嘔吐和腹瀉，腎功能及肝功能損傷，致死率高達88%[3]。EBOV有5種亞型，分別是扎伊爾型(Zaire)、蘇丹型(Sudan)、科特迪瓦型(Cote d’Ivoire)、萊斯頓型(Reston)和本迪布焦型(Bundibugyo)[4]。EBOV基因組為單鏈、負鏈RNA，編碼7個蛋白，分別為包膜糖蛋白(glycoprotein，GP)、衣殼蛋白(nucleoprotein，NP)、基質(zhì)蛋白(matrix protein)VP24、VP40，非結(jié)構(gòu)蛋白VP30、VP35，以及聚合酶L(polymerase L)[5]。

EBOV侵染細胞的過程部分細節(jié)已經(jīng)明了，EBOV的GP蛋白可能是細胞膜表面受體的配體，與病毒進入細胞有關(guān)[6]。通過對GP蛋白及其編碼基因的研究發(fā)現(xiàn)，該基因含有兩個讀碼框，首先被翻譯表達的是一段小肽(sGP)，其以兩個二硫鍵組成二聚體，用來抵御免疫細胞對病毒的殺傷作用，如抑制干擾素的釋放[7]，隨后該基因通過移碼的方式編碼出GP，該GP含有GP1和GP2兩個亞基，同樣是以二硫鍵形成三聚體[8]，其中GP1負責識別細胞受體，GP2負責誘導宿主細胞的內(nèi)吞作用，完成侵染[9]。

正是基于GP蛋白在侵染過程中的重要作用，針對EBOV的研究大多集中在GP蛋白上，比如利用GP可以引起機體的免疫反應(yīng)，GP的肽段被用來制備抗原、抗體，并利用酶聯(lián)免疫吸附實驗診斷EBOV的感染[10]；利用重組桿狀病毒表達EBOV的GP蛋白，制備成疫苗，該疫苗可以保護干擾素α/β受體被敲除小鼠免受EBOV的感染[11]；利用有復(fù)制活性、無復(fù)制活性或化學失活的致病狂犬病毒作為載體表達EBOV的GP，利用所述的重組病毒制備疫苗，制得的疫苗可以誘導體液免疫，并保護小鼠免受致病性狂犬病毒以及小鼠侵染型EBOV的侵染[12]。

至今尚未有疫苗和特效藥物上市，WHO已經(jīng)將EBOV列為生物安全第四級(biosafety level-4)。但是，已經(jīng)有研究機構(gòu)或醫(yī)藥公司對EBOV的疫苗的開發(fā)提前進行了專利申請以及專利布局。專利申請很大程度上反應(yīng)理論結(jié)果向?qū)嶋H應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。對已有的專利申請進行分析可以獲知申請量的消長與何種因素相關(guān)；知曉不同國家對埃博拉病毒的關(guān)注程度及投入力度；了解各國科研人員關(guān)注埃博拉病毒的技術(shù)點及其發(fā)展趨勢；最后對重點專利的剖析將為目前的研究提供相應(yīng)的啟示，為科研機構(gòu)或醫(yī)藥企業(yè)研究有效疫苗或藥物提供必要信息。

雖然目前仍未有有效藥物或疫苗上市，但是就專利申請而言，已有不少專利獲得授權(quán)，也已經(jīng)有產(chǎn)品在進行臨床試驗，其中在疫情發(fā)展過程中便出現(xiàn)了成功治愈被感染者的“ZMapp”，本文將就上述內(nèi)容進行具體分析。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

本報告的專利文獻數(shù)據(jù)主要來自國家知識產(chǎn)權(quán)局的專利檢索與服務(wù)系統(tǒng)，其中數(shù)據(jù)庫為CNABS數(shù)據(jù)庫以及DWPI數(shù)據(jù)庫，檢索截止時間為2014年8月31日。以關(guān)鍵詞和IPC代碼為主，對EBOV疫苗以及抗體技術(shù)相關(guān)分類號的檢索范圍進行檢索，檢索關(guān)鍵詞為：“埃博拉”(伊波拉、依波拉、埃波拉)，Ebola virus，EBOV，疫苗，抗體，vaccine，antibod+；分類號為A61K39+，C07K16+。

經(jīng)過初步檢索，發(fā)現(xiàn)中文文獻低于150篇，外文文獻低于600篇，總體文獻數(shù)量不是很大，通過人工閱讀的方式將疫苗注射方法、通用載體、非以EBOV為主要研究對象以及以佐劑為主題的申請作為噪音排除。

對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，對申請年代分布，技術(shù)產(chǎn)出地、申請人，申請量與授權(quán)量的對比進行分析，最后針對重點申請人的重點申請進行分析，得出目前針對EBOV的專利的關(guān)注技術(shù)點。

2 結(jié)果與分析

2.1 申請量年代分析

圖1實線顯示了與EBOV密切相關(guān)的專利申請年代分布，雖然總體數(shù)量不多，但是仍然可以看出，在申請量方面有3個小高峰，分別出現(xiàn)在2003年、2008年和2011年，其中，2001-2005年申請量有一個小平臺期，申請量處在高位，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，其與全球的埃博拉疫情爆發(fā)息息相關(guān)，世界衛(wèi)生組織的網(wǎng)站數(shù)據(jù)[13]表明，EBOV在2000-2007年間共出現(xiàn)了規(guī)模較大的3次爆發(fā)，首先是2000年在烏干達爆發(fā)的蘇丹型埃博拉疫情，感染人數(shù)為425例，死亡224例，死亡率為53%，其次在2003年在剛果有143例感染扎伊爾型EBOV，其中死亡128例，死亡率為90%，而在2007年，分別在烏干達和剛果民主共和國又出現(xiàn)了本迪布焦型和扎伊爾型的病例，分別為149例和264例，死亡率分別為25%和71%。在2003-2007年間，除2006年外，每年都有十幾例的病例報告(參見圖1中虛線，數(shù)據(jù)來源為世界衛(wèi)生組織官方網(wǎng)站[13])。由圖1可以看出，申請量的小高峰與疫情的爆發(fā)年份重合或出現(xiàn)在疫情爆發(fā)后1～2年，即2000年和2007年的集中爆發(fā)導致全球?qū)Π２├牟《娟P(guān)注度提升，科研機構(gòu)以及醫(yī)藥公司對該病毒的研究投入便會相應(yīng)增加，表現(xiàn)在申請量上即為在疫情爆發(fā)年后1～2年的專利申請小高峰。

2014年的EBOV爆發(fā)是1976年以來感染數(shù)量以及死亡人數(shù)最多的一次，這次疫情將引起人類對EBOV更高的關(guān)注度，相信研發(fā)投入也會相應(yīng)提高，因此，預(yù)測未來1～2年內(nèi)，對以EBOV為關(guān)鍵研究對象的專利申請量將會大幅提升，這對我國科研機構(gòu)和醫(yī)藥公司而言是一個機遇。

圖1 申請量與疫情爆發(fā)相關(guān)性分析Fig.1 Correlation between applications and the outbreak of the EBOV epidemic.

2.2 技術(shù)產(chǎn)出地以及申請人分析

圖2中顯示了EBOV專利申請的技術(shù)產(chǎn)出地所占比例，在64篇文獻中，91.67%的申請技術(shù)產(chǎn)出地為美國，而其他國家如俄國(包含一個蘇聯(lián)時代申請)僅有3件申請，而中國、日本僅有1件專利申請。這與EBOV的研究難度以及所需的資金投入有較大關(guān)系?；诎踩缘目紤]，對實驗室的安全級別要求較高，且相對于普通微生物研究相比，其設(shè)備、人員的投入也有較高的要求，美國在對埃博拉研究的技術(shù)基礎(chǔ)以及資金投入上具有優(yōu)勢。

圖2 技術(shù)產(chǎn)出地分析Fig.2 Analysis of technical output.

圖3顯示了該領(lǐng)域的重點申請人，略去了申請量少于3個的申請人，通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，目前對EBOV研究較多的仍是一些非營利性的結(jié)構(gòu)，比如美國衛(wèi)生與人類發(fā)展服務(wù)部( United States Department of Health and Human Development Services)以及美國軍方，如美國陸軍部(The United States of America as Represented by the Secretary of the Army)和美國陸軍傳染病醫(yī)學研究所(United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases)，世界較著名的生物制藥公司AVI生物醫(yī)藥公司(AVI Biopharma Inc)也僅僅只有3件申請與EBOV相關(guān)?？深A(yù)期的低投入產(chǎn)出比可能是各大醫(yī)藥公司遲遲未進入EBOV藥物研究的重要考慮因素，因此，目前為止，對埃博拉的研究還是在以政府主導的機構(gòu)中進行，就軍方背景的申請人推斷，EBOV可能是國家層面生物安全方面的重點預(yù)防對象。

圖3 重點申請人分析Fig.3 Analysis of key applicants.US DEPT：美國衛(wèi)生與人類發(fā)展服務(wù)部；US SEC SEC：美國陸軍部；US ARMY：美國陸軍傳染病醫(yī)學研究所；BAVARI S：Bavari Sina；WARFIELD：Kelly L .Warfield；WISCONSIN：威斯康星校友研究基金會；SCHMAL：Schmal Jone；SANCHEZ：Sanchez Anthony；NABEL GJ：Nabel Gary J； FUNCTIONAL：功能遺傳學股份有限公司；AVI BIO：AVI生物醫(yī)藥公司；AMAN：Aman Mohammad Javad。

目前國內(nèi)相關(guān)申請僅為6件，其中只有1件是國內(nèi)申請人在2014年3月份的申請，其余5件均為國外來華申請。國內(nèi)申請人為中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所，雖然數(shù)量較少，但是申請人與美國的重點申請類似，同樣具有軍方背景，由此可見，EBOV在國家生物安全方面是全球關(guān)注的焦點。

2.3 申請授權(quán)比例及重點申請分析

2.3.1申請授權(quán)比例 圖4顯示了在美國獲得授權(quán)的申請量與申請量的對比分析，其中美國陸軍部(US SEC)和美國陸軍傳染病醫(yī)學研究所(US ARMY)的授權(quán)量較多，幾乎占到其申請量的70%以上；AVI生物制藥公司的3個申請同樣全部獲得了授權(quán)；而美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部(US DEPT)的申請量雖然最多，但其獲得授權(quán)的量卻僅占36.3%。通過查閱相關(guān)申請的申請人后發(fā)現(xiàn)，美國陸軍部和美國陸軍傳染病醫(yī)學研究所的申請大部分是作為共同申請人提出的。

2.3.2重點申請技術(shù)點分析 通過閱讀美國陸軍部(US Sec Of Army)在美國的授權(quán)專利以及中國的1個申請可以看出最近幾年EBOV專利申請的重點關(guān)注的技術(shù)難點。從事Ebola病毒疫苗研究的相關(guān)機構(gòu)中，美國陸軍部授權(quán)量最多，為6件(表1)：其中2篇涉及針對EBOV GP蛋白的多克隆抗體；1篇涉及在GP蛋白中發(fā)現(xiàn)一個新的CTL抗原表位；1篇涉及GP蛋白和VP40蛋白組成的病毒樣顆粒；1篇涉及與VP35結(jié)合的抗病毒復(fù)合物；還有1篇涉及EBOV GP1蛋白與Marburg病毒GP2蛋白構(gòu)建嵌合疫苗。

圖4 申請授權(quán)比分析Fig.4 Analysis of authorization ratio for application.注：圖中申請人名稱縮寫含義與圖3中相同。

授權(quán)號發(fā)明點1US7731975B220100608嵌合GP蛋白疫苗2US7736656B220100615新的GP蛋白抗原表位3US6630144B120031007針對GP蛋白的多克隆抗體4US7682618B220100323包含GP蛋白和基質(zhì)蛋白VP40的病毒樣顆粒5US7507196B220090324與VP35蛋白結(jié)合的核酸類似物作為抗病毒復(fù)合物6US6875433B220050405針對GP蛋白的多克隆抗體

中國僅有1篇涉及EBOV疫苗的專利申請，處于在審階段，利用了暴露于GP蛋白表面的中部區(qū)域(aa393～556)或其截短體進行誘導。

自本次埃博拉疫情爆發(fā)以來，被感染的醫(yī)護人員中，兩名美國醫(yī)療援助人員在感染后，在使用名為ZMapp的試驗性生物藥物后病情好轉(zhuǎn)，通過治療，兩名患者于2014年8月21日康復(fù)出院。這引發(fā)了人們對ZMapp極大的好奇。通過檢索發(fā)現(xiàn)，所謂的ZMapp為MApp(Mapp Biopharmaceutical，Inc.)公司研發(fā)，包括多種單抗，其中一組單抗為MB-003；另一組單抗則為Defyrus有限公司授權(quán)的Zmap-p。

首先，MB-003能夠生產(chǎn)上市是因獲得了美國陸軍傳染病醫(yī)學研究所的授權(quán)，能夠使用其專利，通過檢索發(fā)現(xiàn)，所述的專利為表1中的專利3以及專利6，其公開號分別為US6630144 B1以及US6875433 B2。

精讀所述的專利發(fā)現(xiàn)，專利US6630144 B1涉及識別埃博拉病毒糖蛋白的特異性保護抗體，所述抗體是由細胞系EGP 13F6-1-2(ATCC登錄號PTA 373)、EGP 6D3-1-1 (ATCC登錄號PTA 374)、EGP 13C6-1-1 (ATCC登錄號PTA 375)、 EGP 6D8-1-2 (ATCC登錄號PTA 376)和細胞系EGP 12B5-1-1(ATCC登錄號PTA 436)分泌的5種單克隆抗體13F6、6D3、13C6、6D8和12B5，雖然所述的專利未公開抗體的序列，但是公開了其針對的抗原序列，具體為：6D8識別GP1 389～405位的氨基酸序列，即 HNTPVYKLDISEATQVE；13F6識別GP1 407～417位氨基酸序列，即EQHHRRTDN；13C6識別SEQ ID NO：10中的保守序列。授權(quán)專利US6875433 B2則公開了13F6、6D8、13C6、12B5和6D3的序列信息，包括重鏈可變區(qū)、重鏈CDRs，輕鏈可變區(qū)以及輕鏈的CDRs，同時該專利還給出了上述3個抗體的建議中和濃度。

Zmap-p同樣也是含有3種單克隆抗體(鼠源單克隆抗體1H3、2G4、4G7)的混合物，在其申請的專利中，公開了所述單抗的識別序列以及抗體氨基酸序列。其中，授權(quán)專利US8513391B2公開了1H3的識別序列為sGP蛋白的267～280位，即SNTTGKLIWKVNPEI；2G4識別GP2中的502～516位，即REAIVNAQPKCNPNL；4G7識別GP2中的502～516位，即REAIVNAQPKCNPNL。所述的專利中還公開了上述3株抗體的氨基酸序列信息。

由上述簡要分析可知，目前成功的案例MB-003與ZMAb所包含的6種單克隆抗體，其結(jié)合位點均針對GP上的表位，其中5種結(jié)合線性表位，1種結(jié)合構(gòu)象表位；且表位廣泛分布于GP中的sGP、GP1和GP2。因此開發(fā)單克隆抗體的針對表位區(qū)域應(yīng)以GP為主，且應(yīng)盡量采用混合抗體，覆蓋多種GP。

目前，MB-003中的單克隆抗體顯示GP1序列中的第389～417氨基酸區(qū)域是開發(fā)結(jié)合抗體的較佳區(qū)域。此外，融合亞基GP2序列的502～507殘基決定不同類型埃博拉病毒的傳染性[14]，而ZMAb中的兩種單克隆抗體2G4和4G7結(jié)合位點也位于GP2序列的502～516位，因此該區(qū)域是GP2上一個較好的開發(fā)阻斷埃博拉病毒傳染的單克隆抗體結(jié)合的較佳選擇區(qū)域。

3 討論

隨著對EBOV的基因組、病毒結(jié)構(gòu)的研究深入，其侵染細胞的過程也逐漸明朗，糖蛋白GP是識別細胞膜受體的主要結(jié)構(gòu)，并可能由其介導細胞的內(nèi)吞作用引發(fā)侵染細胞的過程，因此，GP蛋白便成為攻克EBOV的重點關(guān)注點。

通過對相關(guān)專利的分析可以發(fā)現(xiàn)，專利的發(fā)明點與最近新發(fā)表的非專利科技文獻的關(guān)注點相同，同樣是利用GP蛋白作為抗原，而相對比較成功的案例則具體到以GP1序列中的第389～417位氨基酸區(qū)域和GP2序列的502～5016位氨基酸殘基制備抗體或者疫苗，且就目前來看，其趨勢是由全長蛋白作為抗原制備多克隆抗體到通過植物等宿主以GP蛋白制備病毒樣顆粒(VLP)用于疫苗制備，再到利用腺病毒載體表達截斷蛋白，用于抗體制備。目前還沒有效果特別好的單克隆抗體出現(xiàn)。而疫苗的制備不僅需要抗原，還有相應(yīng)的佐劑，這可能將會是未來幾年的發(fā)展方向。

我國雖然申請量較少，起步較晚，為了不重復(fù)過往有效藥物被國外巨頭壟斷的老路，我國研究機構(gòu)或醫(yī)藥公司還需要提高對知識產(chǎn)權(quán)的重視程度，在國外巨頭形成技術(shù)壁壘之前尋找突破口。

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