玉米賴氨酸相關(guān)基因opaque-2及其修飾基因研究進展

史慶玲, 董永彬, 周 強, 馬智艷, 喬大河, 鄧 飛, 李玉玲

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 鄭州 450002

玉米是世界三大糧食作物之一，不僅為人類提供糧食和工業(yè)原料，而且是動物的優(yōu)質(zhì)飼料。玉米品質(zhì)的好壞不僅關(guān)系到玉米的收獲加工，更加關(guān)系到人畜的營養(yǎng)健康。賴氨酸是人類和單胃動物必需的氨基酸，大約5%的賴氨酸含量才能滿足人類的需求，但是普通禾本科植物只能提供1.5%～2%的賴氨酸[1]。高賴氨酸玉米又稱為優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(quality protein maize,QPM)，即玉米籽粒中賴氨酸的含量在0.4%以上，較普通玉米高1倍左右。其主要特點是營養(yǎng)價值高、生物效價比普通玉米高，因此高賴氨酸玉米對于改善人們的營養(yǎng)狀況，促進畜牧業(yè)發(fā)展都有著重要作用。

已有研究表明opaque-2(簡稱o2)突變基因能夠顯著提高玉米籽粒的賴氨酸和色氨酸含量[2]。目前基于分子輔助育種技術(shù)，利用o2基因及其修飾基因培育優(yōu)質(zhì)蛋白玉米是提高其胚乳中的谷蛋白含量和賴氨酸含量的一個有效方法。高賴氨酸玉米育種有廣闊的發(fā)展前景，具有較好的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。本文綜述了玉米o2基因及其修飾基因的研究進展，并對當前育種家利用這兩種基因相互作用培育優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的研究進展進行了分析，以期為高賴氨酸玉米育種提供參考。

1 opaque-2基因的研究進展

早在20世紀20年代，Singleton和Jones首次發(fā)現(xiàn)玉米opaque-2突變體，并將該基因定位在第7染色體上，在純合隱性狀態(tài)下，它能抑制醇溶蛋白的合成，而形成不透明、軟質(zhì)的胚乳表型被廣泛用作遺傳標記[3]。1964年，Mertz等[2]在玉米胚乳缺陷型突變分析中，發(fā)現(xiàn)o2突變體的胚乳蛋白質(zhì)組分中，醇溶蛋白比例為22.9%，比正常籽粒(55.1%)低；谷蛋白比例為50.1%，比正常籽粒(31.8%)高；賴氨酸含量比正常籽粒高69%，按全籽粒計算則增加一倍。隨后o2基因及其等位基因通過轉(zhuǎn)座子標簽策略相繼被克隆[4,5]。1993年Aukerman等[6]利用spm/en轉(zhuǎn)座子分離到了一個穩(wěn)定的o2突變體：o2-23。Opaque-2是DNA類綁定蛋白，形成同源二聚體結(jié)合到保守的DNA序列上，這個保守序列一般為目標基因啟動子的ACGT序列[7]。o2基因編碼了一個48 kDa的蛋白，屬于玉米胚乳中特異表達的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，一般在授粉后10～45 d的胚乳中表達[8]，可轉(zhuǎn)錄激活很多基因家族的表達并涉及多種代謝途徑。o2基因激活的第一類基因家族是編碼22 kDa的α類醇溶蛋白家族，其次還有b-32基因家族(32 kDa的清蛋白)、cyPPDK1(cytoplasmic pyruvate orthophosphate dikinase)基因家族、LKR/SDH基因家族和Ask1(lysine-sensitive aspartate kinase)[9～11]。

在活體細胞中，絕大多數(shù)的生理活動主要依靠蛋白與蛋白的互作實現(xiàn)。Opaque-2作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子參與了多種調(diào)控反應(yīng)，合成、轉(zhuǎn)運、功能轉(zhuǎn)變及降解等反應(yīng)都依靠蛋白之間的互作來完成。目前，不少研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)OHP1作為bZIP轉(zhuǎn)錄因子，可以與Opaque-2互作形成二聚體發(fā)生作用，PBF作為鋅指類轉(zhuǎn)錄因子可以與22 kDa的醇溶蛋白啟動子結(jié)合， GCN5和ADA2與Opaque-2形成蛋白復(fù)合體直接或間接的調(diào)節(jié)Opaque-2的表達，Taxilin能通過改變Opaque-2的亞細胞分布來改變Opaque-2的活性[12～15]。

對于轉(zhuǎn)錄因子來說，轉(zhuǎn)錄后修飾是保證其功能的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄后的蛋白磷酸化修飾作用可以改變轉(zhuǎn)錄因子的活性并調(diào)節(jié)其進入細胞核。2009年Locatelli等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在胚乳中o2的轉(zhuǎn)錄活性分為兩個狀態(tài)：潛在狀態(tài)和激活狀態(tài)。在潛在狀態(tài)時，對稱位點發(fā)生了去甲基化，DnaseI敏感性增加；在激活狀態(tài)時o2目標基因的mRNA與o2等一起積累，一些位點的去甲基化和DnaseI敏感性增加。研究還發(fā)現(xiàn)，不同的o2目標基因招募的共激活因子不同，他們有不同的染色體修飾模式。

關(guān)于o2位點的研究較多、較廣，也比較清楚，而且o2突變材料可以顯著的降低醇溶蛋白的含量，增加了有益氨基酸賴氨酸的含量，o2位點對醇溶蛋白的調(diào)控給高等植物的表達調(diào)控提供了一個模式系統(tǒng)，因此該基因是玉米遺傳改良的重要資源。但是Zhao等[16]通過分子標記輔助選擇將opaque-2基因?qū)氲搅?2個優(yōu)良骨干自交系中構(gòu)建了o2近等基因系(near isogenic line,NIL)，大部分的近等基因系表現(xiàn)了比骨干自交系高的賴氨酸含量，但是在Dan598o2和Liao2345o2中，賴氨酸的含量并沒有增加，他們分析認為在一些玉米遺傳背景中可能有別的基因控制賴氨酸的含量。2014年，該研究小組在CA339和Liao2345構(gòu)建的NIL系中又發(fā)現(xiàn)了兩個表型不同的NIL，liao2345/o2-1有著透明胚乳，liao2345/o2-2有著粉質(zhì)胚乳，通過分析發(fā)現(xiàn)是由于在liao2345/o2-2中啟動子序列被rbg轉(zhuǎn)座子插入而抑制了其轉(zhuǎn)錄[17]。

2 opaque-2基因的修飾基因

修飾基因是指本身對玉米表型性狀不具有任何效應(yīng)，但卻可以與優(yōu)質(zhì)蛋白突變體相互作用，并對o2基因的表達起到修飾作用的基因，該修飾基因包含多個復(fù)雜的基因遺傳位點。富含賴氨酸和色氨酸的o2不透明粉質(zhì)胚乳玉米籽粒硬度比較低，易受病蟲菌危害，產(chǎn)量較低，籽粒成熟時脫水緩慢，機械脫粒時破碎率高、出渣率高，這些缺點妨礙了高賴氨酸和色氨酸玉米在生產(chǎn)上的應(yīng)用。利用修飾基因的作用可以在不改變蛋白質(zhì)品質(zhì)的基礎(chǔ)上，有效地控制o2的粉質(zhì)胚乳向透明胚乳發(fā)展。自1969年P(guān)aez等[18]發(fā)現(xiàn)o2的修飾基因后，玉米育種家就不斷地將修飾基因引入粉質(zhì)胚乳玉米中；1972年Vasal等[19]首先改良了o2型玉米的籽粒硬度和農(nóng)藝性狀，同時又維持了其營養(yǎng)價值，培育成了半硬質(zhì)、硬質(zhì)胚乳修飾型o2玉米，其產(chǎn)量水平接近于相同遺傳背景的普通玉米。

早在1995年，Lopes等[20]組配了W64Ao2×Pool 33、Pool 33×W64o2和Pool33×W22o2的分離群體，利用RFLP標記定位到2個玉米修飾基因的位點，分別位于7號染色體的著絲粒和端粒附近，盡管這兩個位點都位于7號染色體，但是兩者之間沒有連鎖且共顯性。

2008年，Holding等[20]利用兩套獨立的QPM系定位到7個主效o2修飾位點的QTL，分別位于第1、7和9號染色體，7號染色體著絲粒附近為主效QTL(30%)，其他6個效應(yīng)比較小(5%～12%)。通過微陣列分析重組自交系(recombinant inbreed lines,RIL)群體中透明和不透明的籽粒性狀，找到一些差異表達的基因，這些基因位于o2修飾位點的QTL上或是在其附近。一些基因與乙烯和ABA信號有關(guān)系，表明o2胚乳修飾位點可能與細胞程序化死亡有關(guān)系[21]。

2010年，Gutiérrez-Rojas等[22]利用B73o2和CML161 QPM構(gòu)成的RIL系，在第3、5、6、8號染色體上定位到與胚乳質(zhì)地相關(guān)的QTL位點，將氨基酸含量的性狀定位在了7號和8號染色體上，并且對o2修飾基因與必需氨基酸含量的機理提供了有價值的信息。2011年，Holding等[23]通過粉質(zhì)胚乳突變體W64Ao2與K0326Y QPM比較發(fā)現(xiàn)，K0326Y QPM中有16個基因表達量比o2突變體顯著上調(diào)，將這些基因列為胚乳修飾基因進行進一步研究。在K0326Y QPM ×W64Ao2組配的314個RIL系中，通過實時定量的方法研究發(fā)現(xiàn)有6個基因在透明胚乳RIL系中比不透明胚乳RIL系中有穩(wěn)定的上升表達。

3 優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的研究現(xiàn)狀

優(yōu)質(zhì)蛋白玉米是指包含純合隱性的o2位點，賴氨酸和色氨酸的含量高，且通過加入一些修飾基因使得籽粒的胚乳足夠堅硬的玉米品種[24]。優(yōu)質(zhì)蛋白玉米含有的一些相關(guān)突變基因在染色體上的分布如圖1所示。

我國研究優(yōu)質(zhì)蛋白玉米起步比國外略晚，20世紀70年代，在李竟雄的倡導(dǎo)下引入了高賴氨酸玉米種質(zhì)資源，開始了優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的選育工作，培育了一批賴氨酸含量高、產(chǎn)量相當于當?shù)赝茝V普通品種的優(yōu)質(zhì)玉米雜交種。中單206、魯玉13和長單58、中單9409等品種已經(jīng)通過審定，并進行了示范推廣。

圖1 優(yōu)質(zhì)蛋白玉米含有的突變基因在染色體上的分布[25]Fig.1 Distrubution of mutation genes of QPM on chromosome[25].

育種家一般都是利用高賴氨酸種質(zhì)，通過回交轉(zhuǎn)育的方法來培育高蛋白質(zhì)玉米的近等基因系，但是不同的遺傳背景導(dǎo)入o2后的效果不同。2005年，齊建雙等[26]利用o2基因內(nèi)的SSR分子標記技術(shù)結(jié)合表型分析，將純合性基因o2o2導(dǎo)入到了Z58和C72中，在QZ58家系有3種表型，而在QC72中有6種表型。2011年，陳亮等[27]報道了利用18個o2近等基因系與18個普通玉米自交系組配33個雜交組合對產(chǎn)量和配合力進行分析，發(fā)現(xiàn)o2在不同的遺傳背景下影響不同，其中CAL58×丹598(o2/norma1)、196×遼2345(o2/normal)、196×803(o2/norma1)、CAL58×吉477(o2/norma1)、CA156×196(o2/norma1)這5對組合的產(chǎn)量沒有受o2影響。

由于o2基因等位變異比較豐富，包括多種類型的顯性和隱性等位基因，在利用分子標記回交轉(zhuǎn)育優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的過程中，o2供體的選擇直接影響選擇效率。2011年，趙剛等[28]利用國內(nèi)常用的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米自交系CA335、CA339、山東2548和齊205 4個自交系分析發(fā)現(xiàn)，4個自交系屬于兩類不同的o2突變體類型，CA335和CA339為一類，山東2548和齊205為一類。而且這兩類突變體作為o2供體選擇效果有較大差異，CA335和CA339是優(yōu)良供體。因此，在優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的育種中供體選擇是關(guān)鍵因素之一。

目前我國廣泛使用的是CIMMYT的QPM種質(zhì)，它屬于熱帶、亞熱帶種質(zhì)，它的光周期敏感性阻礙了其在中國的擴增和改良，限制了我國QPM的發(fā)展速度。育種家要充分利用我國現(xiàn)有的o2種質(zhì)資源來發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權(quán)的QPM種質(zhì)資源。QPM的應(yīng)用進展比較緩慢，一部分原因是由于導(dǎo)入多個o2修飾位點比較復(fù)雜，另一部分原因是使o2位點純合，檢測氨基酸的成分比較困難[29]。但是找到o2修飾位點，研究這些位點的數(shù)量、染色體位置和作用機理是培育高賴氨酸玉米的關(guān)鍵。

4 展望

目前，opaque-2被認為可以改變玉米胚乳蛋白的表達模式，增加籽粒賴氨酸的含量。但在2011年，Zhao等[16]研究證明除了opaque-2以外，還有其他基因可以控制醇溶蛋白的合成，而且在個別的玉米遺傳背景下賴氨酸的含量不一定能夠提高。因此，我們應(yīng)該更加深入的從分子水平上探究opanque-2基因自身的表達規(guī)律及其轉(zhuǎn)錄激活的結(jié)構(gòu)基因家族的表達調(diào)控機制。

胚乳修飾基因的發(fā)掘進展緩慢，而且大部分研究集中在國外，研究僅限于利用傳統(tǒng)的育種方法聚合優(yōu)良基因及利用分子輔助育種選育高蛋白含量的品系?，F(xiàn)代基因工程技術(shù)快速發(fā)展，借助分子生物學(xué)技術(shù)來發(fā)展高品質(zhì)的玉米品種將會起到良好的效果。

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