基于納米酞菁鈷修飾的石墨烯作為過氧化物模擬酶的信號放大型免疫傳感器的研究

楊哲涵,汪 娟,卓 穎,柴雅琴

(西南大學化學化工學院,重慶400715)

基于納米酞菁鈷修飾的石墨烯作為過氧化物模擬酶的信號放大型免疫傳感器的研究

楊哲涵,汪 娟,卓 穎,柴雅琴*

(西南大學化學化工學院,重慶400715)

該文利用酞菁鈷納米粒子修飾氧化石墨烯（NanoCoPc/GO）用于構建無酶的信號放大型電化學免疫傳感器來靈敏地檢測降鈣素原（PCT）。納米酞菁鈷和氧化石墨烯都具有類似于天然過氧化物酶的性質可以催化氧化H2O2。因此，當H2O2的存在時，NanoCoPc/GO通過催化H2O2實現對電活性物質的信號的放大。NanoCoPc/GO作為模擬酶用于電化學放大時，可以避免天然酶的缺點比如價格昂貴和容易隨著環(huán)境變化而發(fā)生變性。結果表明，該免疫傳感器檢測PCT的線性范圍在0.025~5.0 ng/mL，最低檢測限為8 pg/mL。

納米酞菁鈷;氧化石墨烯;降鈣素原;電化學傳感器

基于納米酞菁鈷和石墨烯的以上性質，該文中，設計合成了具有過氧化物酶性質的納米酞菁鈷氧化石墨烯納米復合材料 （NanoCoPc/GO），并將其運用在構建一種無酶的信號放大型電化學免疫傳感器用于檢測降鈣素原。首先將納米酞菁鈷與氧化石墨烯π-π堆積得到NanoCoPc/GO復合材料。然后將電活性物質硫瑾（thi）修飾的降鈣素原的第二抗體 （Ab2）利用交聯劑固載到NanoCoPc/GO復合材料上（thi/Ab2/NanoCoPc/GO）。由于GO具有較大的比表面積,增加了納米酞菁鈷、Ab2、thi的固載量。另一方面，NanoCoPc/GO復合物催化底物中的H2O2的氧化進一步的放大了電活性物質thi的信號。本文利用了納米材料的催化作用取代了天然酶實現了無酶的信號放大。實驗結果表明，該免疫傳感器檢測PCT的線性范圍在0.025~5.0 ng/mL，最低檢測限為8 pg/mL。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑和實驗儀器

單克隆捕獲抗體Ab1（anti-PCT），PCT標準溶液，第二抗體Ab2（anti-PCT），牛血清白蛋白（BSA,96%~99%）購自鄭州Biocell生物試劑公司，抗體抗原保存在4℃冰箱中待用。氧化石墨烯（GO）購于先鋒納米科技有限公司（中國南京）。酞菁鈷,CTAB,氯金酸（HAuCl4），thi，均購自美國西格瑪有限公司。交聯劑N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC）均購自上海國藥集團化學試劑有限公司 （中國上海）。醋酸緩沖溶液 （0.1 mol/L，PBS，pH5.5）用儲備的0.1 mol/L HAc-NaAc和0.1 mol/L KCl配制，并由 NaOH溶液配成 pH為5.5。其它試劑為分析純試劑，實驗室用水為二次蒸餾水。

CHI852c電化學工作站 （上海辰華儀器公司），S-4800型掃描電子顯微鏡 （SEM，日本HITACHI公司）。AB204-S電子天平 （瑞士Mettler&Toledo公司）；BRANSONIC200超聲清洗儀（德國BRANSON UL—TRASCHALL公司）；移液槍（成都方舟科技開發(fā)公司）；JBZ-12H磁力攪拌器；三電極工作系統：免疫電極為工作電極，Ag/AgCl（飽和KCl）為參比電極，鉑絲電極為對電極。

1.2 NanoCoPc/GO的制備

根據文獻報道的方法合成納米酞菁鈷[15-16]。首先將0.015 g CoPc溶于500 μL質量分數98%的濃硫酸中待用。然后稱取0.045 g十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）于50 mL燒杯中，用28 mL蒸餾水溶解，在超聲的條件下將硫酸溶解的CoPc逐滴加入CTAB中，溶液呈藍色半透明溶液。離心，洗滌三次，得到NanoCoPc，將其用10 mL蒸餾水分散后待用。

取0.5 mg GO溶于1 mL蒸餾水中，超聲使其充分溶解。將其加入到2 mL NanoCoPc溶液中，混合液超聲48 h后，離心，洗滌三次，所得即為NanoCoPc/GO。將其用2 mL蒸餾水分散于5 mL燒杯中，并加入交聯劑EDC/NHS（摩爾比4∶1）室溫下攪拌2 h，即得到活化后的NanoCoPc/GO。冰箱中放置待用。

1.3 Thi/anti-PCT的制備

吸取100 μL PCT溶液于2 mL蒸餾水中，并加入交聯劑EDC/NHS（摩爾比4∶1），在4℃下攪拌2 h，再加入10 mg thi于其中，于4℃下攪拌12 h。通過EDC和NHS的偶聯作用，使抗體上的羧基和硫堇的氨基反應得到thi修飾的PCT第二抗體（thi/anti-PCT）。離心，洗滌三次，所得下層沉淀即為thi/anti-PCT。然后將其分散在1 mL pH7.0的PBS溶液中，置于冰箱待用。

圖1 （A）Ab2/Thi@NanoCoPc/GO生物耦合物的制備過程，（B）免疫傳感器的制備過程Fig.1 (A)Synthesized process and preparation procedure of Ab2/Thi@NanoCoPc/GO bioconjugate,(B)the preparation and fabrication of immunosensor

1.4 二抗復合物 （Ab2/Thi@NanoCoPc/GO）的制備

取500 μL Thi/anti-PCT溶液，將其加入到2 mL活化后的NanoCoPc/GO中，于4℃下攪拌12 h。離心洗滌得到Ab2/Thi@NanoCoPc/GO復合物。用1.5 mL PBS分散，置于冰箱中待用。

1.5 免疫傳感器的制備

該免疫傳感器的構建過程如圖1所示，首先用0.05 μm的Al2O3粉末反復打磨拋光玻碳電極使其成鏡面，然后用蒸餾水沖洗，并在超聲儀中超聲5 min除去物理吸附的雜質。預處理后，將電極置于氯金酸（ω=1%HAuCl4）溶液中電沉積30 s，沉積電位為-0.2 V。用二次蒸餾水淌洗，室溫下晾干。接著在電極上滴 15 μL降鈣素原抗體（Ab1），放置于冰箱中12 h。再用蒸餾水淌洗，室溫下晾干后，滴加15 μL牛血清白蛋白（BSA, 0.25%）。1 h后，用蒸餾水淌洗，晾干，滴加15 μL PBS稀釋的PCT抗原溶液，37℃烘箱中反應30 min后取出，蒸餾水淌洗，晾干，滴加15 μL Ab2/ Thi@NanoCoPc/GO復合物，于37℃烘箱中反應30 min。取出電極后，用蒸餾水淌洗兩次，在pH5.5醋酸緩沖溶液中進行試驗測定。

2 結果與討論

2.1 掃描電鏡表征GO，NanoCoPc/GO

GO的掃描電子顯微鏡（SEM）圖如圖2A所示。由圖可見，GO呈不規(guī)則片狀，且表面光滑。圖2B為NanoCoPc/GO復合物SEM圖，當將納米酞菁顆粒與GO π-π堆積后，可見片狀的GO上已覆有一層不規(guī)則形狀的顆粒。表征結果表明，成功的制備了NanoCoPc/GO復合物。

圖2 掃描電鏡圖：GO（A），NanoCoPc/GO（B）Fig.2 SEM image of GO(A)and NanoCoPc/GO(B)

2.2 H2O2對PCT的檢測信號放大的作用的研究

該文通過向電解池溶液中加入不同濃度的H2O2來考察NanoCoPc/GO是否能通過催化H2O2來放大檢測信號。結果如圖3所示，曲線a是在沒有加H2O2的電化學響應信號。曲線b是向電解池溶液中加入了6 μL H2O2的電流響應。曲線c是向電解池中加入了14 μL H2O2的電流響應。曲線d是向電解池中加入了18 μL H2O2的電流響應。隨著電解池中的H2O2濃度增加，電流響應增加，該結果表明NanoCoPc/GO通過催化H2O2的成功的使檢測的信號提高，從而證明所設計的信號放大策略是成功的。

圖3 H2O2對免疫電極的影響:曲線a-d為加入不同體積的0.35 mol H2O2的DPV響應圖（a）:0 μL，（b）:6 μL, (c)14 μL,(d)18 μLFig.3 Influence of H2O2on the current response:（a）:0 μL，（b）:6 μL,(c)14 μL,(d)18 μL

2.3 H2O2濃度的優(yōu)化

H2O2濃度對電化學信號放大的響應至關重要，因此該文對H2O2濃度的進行了優(yōu)化。依次向電解池2 mL HAc-NaAc緩沖溶液（pH5.5）中加入體積為0 μL，2 μL，6 μL，10 μL，14 μL，18 μL，20 μL的0.35 mol/L H2O2，電解池中對應的H2O2濃度分別為 0.35，1.05，1.74，2.43，3.12，3.81 mol/L。電化學信號的響應結果如圖4所示，當未加入H2O2時，即H2O2濃度為0時，電流響應值最小，隨著的H2O2加入，電流值逐漸增大，當H2O2濃度達到3.12 mol/L時，即加入H2O2的為18 μL時，電流值達到最大。當再增加電解池中H2O2的濃度時，響應電流值開始減小，這可能是由于H2O2過大時，對電極表面有一定的腐蝕作用，導致了電流的減少。因此，在該體系中，選取電解池中H2O2濃度為3.12 mol/L為最佳響應濃度。

圖4 H2O2濃度的優(yōu)化圖Fig.4 Optimization image of H2O2concentration

2.4 電極在組裝過程中的電化學表征

為了考察電極在修飾過程中是否成功，該實驗以鐵氰化鉀（pH=7.4，0.5 mmol/L）為氧化還原探針，對電極修飾過程的電極的電化學行為進行探究。在圖5中，曲線a為裸的波碳電極的CV響應圖，呈現出一對明顯Fe(CN)64-/3-的氧化還原峰。曲線b為沉積金納米粒子后的電極CV響應圖，因為金納米粒子具有很強的導電特性，能加快電子傳輸，因此，氧化還原峰電流值明顯增大。曲線c為電極修飾一抗后的CV圖，與未修飾一抗的曲線b相比，氧化還原峰電流值減小。由于PCT抗體屬于蛋白質，阻礙了電子傳遞。這種現象說明PCT抗體已成功修飾到電極。曲線d為修飾了封閉劑BSA后的CV響應圖，由于BSA同樣會阻礙電子傳遞，從而使得響應電流值進一步減小。曲線e為孵育PCT抗原后的CV圖，由于PCT阻礙電子傳遞的作用，使峰電流值減小。電極修飾的表征現象表明電極每一步的組裝過程皆為成功。

圖5 不同修飾電極在0.5 mmoL/L鐵氰化鉀溶液中（pH=7.4）的循環(huán)伏安表征圖，（a）裸玻碳電極，（b）電沉積納米金后電極，（c）抗體修飾電極，（d）經BSA封閉的電極，（e）孵育30 μg/mL PCT后的電極。掃描速度為50 mV/sFig.5 CVs of the different electrodes in 0.5 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-solution(pH=7.4).(a)bare glassy carbon electrode;(b)GCE of electrodeposion of nano-Au;(c)anti-PCT modified electrode;(d)BSA blocked electrode;(e) modified electrode incubated with 30 μg/mL PCT.The scan rate was 50 mV/s

圖6 （A）PCT的濃度從a到f（0.025,0.05,0.25,0.5,2.5,5 ng/mL）的DPV曲線圖。（B）PCT的標準校準曲線圖Fig.6 (A)PCT from a to g(0.025,0.05,0.25,0.5,2.5,5 ng/mL)in working buffer HAc-NaAc. (B)Calibration curve of the immunosensors for PCT determination

2.5 免疫傳感器對降鈣素原PCT濃度的電流響應

圖6為實驗條件優(yōu)化的條件下對不同濃度PCT的電流響應圖。首先，用pH7.4的PBS溶液配置不同濃度的PCT溶液，濃度依次為0.025，0.05，0.25，0.5，2.5，5 ng/mL。在最優(yōu)的條件下，對不同濃度的PCT進行定量分析。圖6（A）是相應的DPV曲線，隨著PCT的濃度增加，電流響應增加。圖6（B）是PCT標準的校準曲線，線性范圍在0.025~5.0 ng/mL內，最低檢測限為8 pg/mL，回歸方程為I=4.264 c+8.891，相關系數r=0.9830。

3 結論

該文構建了一種NanoCoPc/GO新型載體，巧妙地利用了氧化石墨烯和納米酞菁鈷仿酶性質，構建了納米酞菁鈷修飾的氧化石墨烯復合物。該復合物不僅可以作為模擬酶催化H2O2，實現檢測信號的放大，而且可以用作固載基質來固載Ab2。該體系利用納米材料的催化作用實現了無酶信號放大，成功的避免了天然酶用作催化的缺點。此外，該復合物本身能參與H2O2的催化，實現電子的轉移，從而實現對低濃度生物分子的放大檢測，使得實驗過程更加便捷。

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A signal amplification immunosensor based on nano-cobalt phthalocyanine modified graphene as a peroxidase simulated enzyme

Yang Zhe-han,Wang Juan,Zhuo Ying,Chai Ya-qin*
（School of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China）

In this work,a signal-amplified electrochemical immunosensor based on cobalt phthalocyanine nanoparticles decorated graphene oxide nanocomposite (NanoCoPc/GO)was proposed for sensitive detection procalcitonin (PCT).Here,both cobalt phthalocyanine nanoparticles and graphene oxide exhibited an intrinsic enzyme mimetic activity similar to natural peroxidase.In the present of H2O2,an enhanced electrochemical signal was obtained as the catalysis of NanoCoPc/GO to H2O2.Importantly,NanoCoPc/GO as peroxidase mimetic applied to electrochemical amplification system could avoid the disadvantage of nature enzymes such as expensive and easily denatured by environmental changes.The proposed immunosensor showed good sensitivity for quantitative determination of PCT.

cobalt phthalocyanine nanoparticles;graphene oxide;procalcitonin;electrochemical immunosensor

0 引言

國家自然科學基金(51473136)資助

細菌感染在我國患病新生兒中占有相當比例，早期診斷和及時治療能夠有效提高診療水平和降低新生兒病死率[1]。但是，由于細菌感染與病毒感染、非感染引起炎癥的癥狀非常相似，導致在臨床中細菌感染很難被準確的診斷出來[2]。同時，對細菌感染的錯誤診斷可能會導致治療費用的增加，抗生素的濫用以及其他過敏反應[3]。近年來，降鈣素原（PCT）被認為是診斷細菌感染性疾病的可靠標志物[4]。當患者被細菌感染后，血液中PCT的量會急劇的增加，并且與感染的嚴重程度呈一定的相關性[5]。因此，可以通過有效檢測患者血液中PCT的量從而判斷是否是細菌感染。

電化學免疫傳感器是將免疫識別和電化學分析方法相結合的一種新型的免疫分析方法。與

*通信聯系人，E-mail：yqchai@swu.edu.cn其他分析方法相比，其具有專一性強、靈敏度高、檢測快速和便于攜帶等優(yōu)點[6]。近年來，已有許多致力于通過對檢測信號的放大來進一步提高電化學免疫傳感器的檢測靈敏度的研究。常用的信號放大的方法有:利用納米材料增加信號物質的固載量[7]、酶催化放大[8]、親和素生物素系統放大[9]等。其中，酶催化放大策略運用最為廣泛。但是，酶的活性受環(huán)境的影響非常大，同時價額昂貴，因此研究者們試圖通過運用一些具有催化活性的納米材料來取代天然酶。比如Fe3O4納米顆粒[10],Pt納米粒子[11]等。酞菁[12](CoPc)是一個18個π電子共軛的大環(huán)體系具有強烈的π-π電子作用。報道指出，酞菁鈷具有過氧化物酶的模擬性質，可以催化H2O2氧化。但是，酞菁鈷分子的溶解性差，在一定程度上限制了其應用研究，因此，人們開始轉向酞菁鈷納米粒子的研究。酞菁鈷納米粒子不僅保有原有酞菁鈷的特異性質，而且具有較好的溶解性質和催化性質。它能直接溶于水中與其他物質發(fā)生鍵合而形成配合物，大大擴大了其研究范圍[13]。另外，石墨烯是目前備受矚目的研究熱點材料[14]。它是碳的二維結構，厚度只有0.335納米，在室溫下具有高速的電子遷移率。經強酸氧化后的氧化石墨烯表面引入了大量羥基，羧基和環(huán)氧基等氧基功能團。其表面的羥基，使得氧化石墨烯親水性好，且具有較大的比表面積，增大了物質的固定量，已被廣泛用于修飾電極。最近的報道指出，氧化石墨烯可以催化H2O2氧化。其這一性質還很少運用在電話學傳感器構建中。