基于高分辨率熔解曲線技術(shù)的CYP2C19、IL-1β基因多態(tài)性檢測(cè)*

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基于高分辨率熔解曲線技術(shù)的CYP2C19、IL-1β基因多態(tài)性檢測(cè)*

洪軍波#劉東升舒徐祝蔭汪安江謝川謝勇張焜和呂農(nóng)華&

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(330006)

*基金項(xiàng)目：江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20113BCB24019)

#Email: allen2005066@sohu.com

背景：細(xì)胞色素P450同工酶2C19(CYP2C19)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)基因多態(tài)性是幽門螺桿菌(Hp)感染根除率的重要影響因素，明確其基因多態(tài)性對(duì)根除治療方案的制定具有指導(dǎo)意義。目的：采用高分辨率熔解曲線(HRM)技術(shù)鑒別CYP2C19、IL-1β基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)基因型。方法：采集200名健康體檢者外周血，提取基因組DNA，以HRM技術(shù)確定CYP2C19*2、*3和IL-1β-31/-511引物的最佳Mg2+濃度，并檢測(cè)相應(yīng)SNPs位點(diǎn)基因型，檢測(cè)結(jié)果以基因測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：CYP2C19*2、*3和IL-1β-31/-511引物的最佳Mg2+濃度分別為3.0、3.0、2.5、2.5 mmol/L。HRM技術(shù)能精確鑒別CYP2C19*2、*3和IL-1β-31/-511基因型，與基因測(cè)序結(jié)果有良好的一致性(κ=0.985和0.968)。結(jié)論：HRM技術(shù)能精確鑒別CYP2C19、IL-1β基因多態(tài)性，可用于指導(dǎo)Hp根除治療方案的藥物選擇。

關(guān)鍵詞高分辨率熔解曲線；細(xì)胞色素P450 CYP2C19；白細(xì)胞介素1β；多態(tài)性，單核苷酸；

幽門螺桿菌

Polymorphism, Single Nucleotide;Helicobacterpylori

含質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)的根除治療方案是目前國內(nèi)外共識(shí)推薦的幽門螺桿菌(Hp)感染處理方法[1]，方案中的PPIs主要由肝臟細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP)同工酶2C19(CYP2C19)代謝，因此CYP2C19基因多態(tài)性引起的酶活性差異可通過影響PPIs代謝而影響Hp根除治療方案的療效[2]。促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)可通過下調(diào)H+/K+ATP酶表達(dá)抑制壁細(xì)胞分泌胃酸[3]，其基因多態(tài)性亦為Hp根除治療效果的影響因素之一。建立有效的檢測(cè)方法以明確上述基因多態(tài)性，對(duì)提高Hp感染根除率具有臨床指導(dǎo)意義。高分辨率熔解曲線(high-resolution melting curve, HRM)技術(shù)是基于有序列變化的擴(kuò)增子之間微弱的DNA熔解溫度(Tm值)差異，通過DNA片段熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測(cè)，方法簡單，易于操作，能快速、精確地檢測(cè)大量樣本，并具有成本優(yōu)勢(shì)[4-12]。本研究采用HRM技術(shù)鑒別CYP2C19、IL-1β基因單核 苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點(diǎn)基因型，以期指導(dǎo)Hp根除治療方案的制定，提高Hp感染根除率。

材料與方法

一、標(biāo)本來源和主要試劑

選取南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年6月1日—30日健康體檢者200名，其中男127名，女73名，平均年齡(44.2±11.8)歲。采集受檢者外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，4 ℃保存待測(cè)。

人外周血總DNA提?。篧izard?基因組DNA純化試劑盒(Promega Corporation)；HRM技術(shù)鑒定SNPs：LightCycler?480 High Resolution Melting Master(Roche Diagnostics)；基因測(cè)序：Platinum?Taq DNA聚合酶、SYBR?Safe DNA Gel Stain(Thermo Fisher Scientific Inc.)。

二、方法

1. 基因組DNA提?。喝?00 μL外周血，加入900 μL細(xì)胞裂解液，混勻，孵育10 min，14 000×g室溫離心20 s至出現(xiàn)白色沉淀；沉淀以300 μL核裂解液重懸，加入100 μL蛋白裂解液，劇烈震蕩20 s，加入300 μL異丙醇，14 000×g室溫離心1 min，加入300 μL乙醇析出白色絮狀DNA，離心，加入100 μL DNA水化液。

2. HRM技術(shù)確定各引物最佳Mg2+濃度：CYP2C19、IL-1β HRM引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成，具體信息見表1。1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L Mg2+對(duì)應(yīng)的體積分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 μL。在1.5 mL反應(yīng)管(置于冰上)中制備20 μL的PCR Mix，內(nèi)含2×Master Mix 10 μL、20×Primer Mix 2 μL、相應(yīng)體積MgCl2和ddH2O共3 μL、6 ng/μL DNA模板5 μL，以ddH2O為模板作為陰性對(duì)照。以LightCycler?480薄片封蓋微孔板，將微孔板置于離心機(jī)上，1 500×g離心2 min，置于LightCycler?480系統(tǒng)，開始PCR程序。反應(yīng)條件：預(yù)孵育(95 ℃ 10 min)→擴(kuò)增(95 ℃ 10 s，引物溫度15 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán))→HRM程序(95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，95 ℃持續(xù))→冷卻(40 ℃ 10 s)。以LightCycler?480 Gene Scanning軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3. HRM技術(shù)檢測(cè)CYP2C19、IL-1β SNPs位點(diǎn)基因型：以基因測(cè)序方法鑒定出CYP2C19*2、*3和IL-1β-31/-511標(biāo)本作為陽性對(duì)照，根據(jù)已確定的各引物最佳Mg2+濃度制備15 μL的PCR Mix，分別加入陽性對(duì)照標(biāo)本和待測(cè)標(biāo)本各5 μL，其余方法同步驟2.。

4. 基因測(cè)序驗(yàn)證(上海英俊生物技術(shù)有限公司)：PCR引物信息見表2，25 μL反應(yīng)體系中含10×PCR緩沖液2.5 μL、Mg2+0.8 μL(50 mmol/L)、上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、Platinum?Taq DNA聚合酶0.2 μL(5 U/μL)、DNA模板1 μL和ddH2O 19.5 μL，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

表1　CYP2C19、IL-1β HRM引物信息

表2　CYP2C19、IL-1β PCR引物信息

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)CYP2C19、IL-1β基因多態(tài)性的HRM技術(shù)檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)(kappa檢驗(yàn))，κ≥0.75表示兩者一致性較好，0.75>κ≥0.4表示兩者一致性一般，κ<0.4 表示兩者一致性較差。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、各引物最佳Mg2+濃度

HRM技術(shù)顯示，CYP2C19*2、*3和IL-1β-31/-511引物的最佳Mg2+濃度分別為3.0、3.0、2.5、2.5 mmol/L。

二、CYP2C19、IL-1β基因多態(tài)性檢測(cè)

1. CYP2C19：HRM技術(shù)能精確鑒別CYP2C19*2、*3等位基因(圖1、圖2)，與基因測(cè)序結(jié)果比較，共有2例結(jié)果不一致，κ=0.985(P<0.001)，表明兩種技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的一致性非常好。

2. IL-1β：HRM技術(shù)能精確鑒別IL-1β-31/-511基因型(圖3、圖4)，與基因測(cè)序結(jié)果比較，分別有4例結(jié)果不一致，κ=0.968(P<0.001)，表明兩種技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的一致性非常好。

討論

藍(lán)色曲線：CYP2C19*1*1；紅色曲線：CYP2C19*1*2；綠色曲線：CYP2C19*2*2

圖1CYP2C19*2(164 bp)HRM技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

CYP2C19和IL-1β基因多態(tài)性分別可影響PPIs代謝和改變胃內(nèi)pH值，是Hp感染根除率的重要影響因素[1-3]。CYP2C19基因型可分為快代謝型(extensive metabolizer)、中間代謝型(intermediate metabolizer)和慢代謝型(poor metabolizer)三種，研究發(fā)現(xiàn)快代謝型等位基因(CYP2C19*1、*17)攜帶者的Hp感染根除率顯著低于慢代謝型等位基因(CYP2C19*2、*3)攜帶者[13-14]，IL-1β-511 CC基因型攜帶者的Hp感染根除率顯著低于CT 和 TT 基因型攜帶者，IL-1β-511為CC基因型且CYP2C19為快代謝型的個(gè)體，根除治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)是非CC基因 型且CYP2C19為慢代謝型者的11.15倍[15]。CYP2C19和IL-1β基因多態(tài)性具有較明顯的地域和種族差異，因此在制定Hp根除治療方案前明確患者上述基因的SNPs位點(diǎn)基因型具有重要臨床指導(dǎo)意義。亞洲人群中CYP2C19*2、*3等位基因較常見[16]，CYP2C19*17等位基因的流行率則低于5%，白種人和非洲人的CYP2C19*17流行率為亞洲人的4倍[14]，提示CYP2C19*17在亞洲人群中的臨床價(jià)值較小，因此本研究未檢測(cè)該等位基因。

藍(lán)色曲線：CYP2C19*1*1；紅色曲線：CYP2C19*1*3；綠色曲線：CYP2C19*3*3

藍(lán)色曲線：IL-1β-31TT；紅色曲線：IL-1β-31CT；綠色曲線：IL-1β-31CC

藍(lán)色曲線：IL-1β-511TT；紅色曲線：IL-1β-511CT；綠色曲線：IL-1β-511CC

HRM技術(shù)具有簡單、快速、精確、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，并可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)[4-12]，總體敏感性、特異性和準(zhǔn)確性可達(dá)99%以上，與DNA測(cè)序相當(dāng)[5，8-10]，目前該技術(shù)主要用于SNPs分型[4-5,7-8,12]、突變檢測(cè)[9-10]以及甲基化檢測(cè)[11]等，在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用日益廣泛。既往研究結(jié)果顯示，HRM技術(shù)能很好地鑒別CYP2C19*2、*3、*17等位基因以及IL-1β-31/-511 基因型[4,7-8,12]。有研究[17]指出HRM技術(shù)能精確檢出雜合子，準(zhǔn)確性高達(dá)99.7%，但鑒別純合子的準(zhǔn)確性僅為70.3%，在檢測(cè)純合子時(shí)，其準(zhǔn)確性依賴于檢測(cè)模式、分析軟件、PCR產(chǎn)物大小以及純合子間熔解溫度的差異等。本研究結(jié)果表明HRM技術(shù)能對(duì)CYP2C19(*2、*3)和IL-1β(-31/-511)的SNPs進(jìn)行精確分型，與基因測(cè)序結(jié)果有良好的一致性(κ=0.985和0.968)。

綜上所述，本研究成功建立了能精確鑒別CYP2C19、IL-1β基因多態(tài)性的HRM技術(shù)，臨床實(shí)踐中可應(yīng)用該技術(shù)明確Hp感染者的PPIs代謝類型和胃內(nèi)酸分泌情況，從而指導(dǎo)根除治療方案中PPIs的選擇，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，提高Hp感染根除率。

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(2015-04-27收稿；2015-06-03修回)

Identification of CYP2C19 and IL-1β Polymorphisms Based on High-resolution Melting Curve AnalysisHONGJunbo,LIUDongsheng,SHUXu,ZHUYin,WANGAnjiang,XIEChuan,XIEYong,ZHANGKunhe,LüNonghua.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang(330006)

Correspondence to: Lü Nonghua, Email: lunonghua@163.com

Background: The eradication rate ofHelicobacterpylori(Hp) infection is strongly influenced by cytochrome P450 2C19 (CYP2C19) and interleukin-1β (IL-1β) polymorphisms, identification of these gene polymorphisms may provide a guidance for the selection of eradication regimen. Aims: To identify the genotypes of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in CYP2C19 and IL-1β genes by using high-resolution melting curve (HRM) analysis. Methods: Peripheral blood was obtained from 200 healthy subjects and the genomic DNA was extracted. The optimal concentrations of Mg2+for primers of CYP2C19*2, *3 and IL-1β-31/-511 were determined by HRM analysis. Then, the genotypes of SNPs in CYP2C19 and IL-1β were identified by HRM analysis and verified by gene sequencing. Results: The optimal concentrations of Mg2+for primers of CYP2C19*2, *3 and IL-1β-31/-511 were 3.0, 3.0, 2.5 and 2.5 mmol/L, respectively. CYP2C19 *2, *3 and IL-1β-31/-511 genotypes could be accurately identified by HRM analysis, which had excellent consistency with the results of gene sequencing (κ=0.985 and 0.968, respectively). Conclusions: CYP2C19 and IL-1β polymorphisms can be accurately identified by HRM analysis, which might be used as a reference for the selection of Hp eradication regimen.

Key wordsHigh-Resolution Melting Curve;Cytochrome P-450 CYP2C19;Interleukin-1beta;

通信作者&本文，Email: lunonghua@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.12.005