干旱脅迫對肋果沙棘(Hippophae neurocarpa)試管苗葉片黃酮類化合物代謝的影響

孫　坤,張宏濤,陳　紋,李小偉,蘇　雪

(西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州　730070)

干旱脅迫對肋果沙棘(Hippophaeneurocarpa)試管苗葉片黃酮類化合物代謝的影響

孫坤,張宏濤,陳紋,李小偉,蘇雪

(西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州730070)

摘要：為了探討干旱脅迫對沙棘葉片黃酮類化合物代謝的影響，以肋果沙棘試管苗為材料，研究了不同濃度PEG-6000(0%,10%,20%,30%)對葉片類黃酮積累及其合成過程中相關酶PAL、C4H和4CL活性的影響.結果顯示：(1)隨干旱脅迫程度的增強，總黃酮、槲皮素、山奈酚和楊梅素含量均表現為先下降后上升的趨勢，20% PEG-6000脅迫下其含量最低，比對照分別下降了20.36%,12.84%,47.81%,63.22%；在不同濃度PEG-6000脅迫下異鼠李素含量與對照相比均有升高，10% PEG-6000脅迫下其含量最高，比對照升高了79.99%.(2)干旱脅迫顯著影響肋果沙棘試管苗葉片PAL、C4H和4CL的活性(P<0.05).隨著脅迫程度的增加，PAL活性顯著升高；C4H和4CL活性呈先升高后降低的趨勢，在20% PEG-6000脅迫下達到最高.(3)楊梅素、槲皮素、山奈酚及總黃酮含量均與PAL、C4H和4CL活性負相關.盡管干旱脅迫促進了相關酶的活性，但肋果沙棘試管苗葉片中總黃酮含量并沒有顯著變化.

關鍵詞：肋果沙棘；PEG-6000；干旱脅迫；黃酮類化合物；PAL；C4H；4CL

中圖分類號：Q 945.78

文獻標志碼：A

文章編號：1001-988Ⅹ(2015)03-0072-07

Effects of drought stress on flavonoids metabolism involved

in test-tube plantlets leaves ofHippophaeneurocarpa

SUN Kun,ZHANG Hong-tao,CHEN Wen,LI Xiao-wei,SU Xue

(College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu，China)

Abstract:Taking test-tube plantlets of Hippophae neurocarpa as materials，the current study is carried out to investigate the effect of drought stress on the flavonoids accumulation and activities of Enzymes．There are four drought levels：the control(without adding PEG-6000)，10% PEG-6000，20% PEG-6000，30% PEG-6000．The result show that：(1)With the serious of drought stress，the contents of quercetin，kaempferol，myricetin and total flavonoids contents decreased at first，and then increased，which reachs the lowest value under 20% PEG-6000,and the values are 20.36%，12.84%，47.81%，63.22% lower than that of control,respectively．The content of isorhamnetin is increased under PEG-6000 stress compared with control，and it reachs the highest value under 10% PEG-6000,and the value is 79.99% higher than that of control;(2)A significant difference for PAL，C4H and 4CL is found in test-tube plantlets leaves of H.neurocarpa under the drought stress(P<0.05)．With the serious of drought stress，the activity of PAL is significantly increased．The activity of C4H and 4CL increased at first，and then decreased，which reachs the highest value under 20% PEG-6000;(3)Linear regression analysis shows that the contents of kaempferol，myricetin，the total flavonoids and the activities of PAL，C4H，4CL present negative correlation．Although the related enzyme activities are increased by drought stress，the contents of total flavonoids in test-tube plantlets leaves of H.neurocarpa is not significantly changed．

Key words:Hippophae neurocarpa；PEG-6000；drought stress；flavonoids；PAL；C4H；4CL

黃酮類化合物又名生物類黃酮，是一種廣泛分布于植物體內的次生代謝產物，是現代醫(yī)藥、食品等工業(yè)的重要原料，且在植物自我保護及適應環(huán)境方面起重要作用[1].對大多數植物而言，類黃酮等次生代謝產物的合成往往受到所處環(huán)境的影響，并且以此決定其次生代謝產物合成的種類及數量[2]，往往表現為環(huán)境越惡劣其次生代謝物含量就越高[3].在眾多的環(huán)境因素中，干旱脅迫是影響植物次生代謝的最重要因子之一[4].目前，干旱脅迫對植物葉片黃酮類化合物含量的影響已有較多研究，但結果不盡相同[1,5-10].有研究表明銀杏、女貞和酸棗在干旱脅迫下葉片中類黃酮合成與積累沒有明顯變化[1,5,9,10]，而朱燦燦等研究表明，適度干旱脅迫有利于葉片黃酮類物質的合成[8].類黃酮等次生代謝產物的生物合成與積累又受苯丙烷代謝途徑的調控[11]，其中，苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase,PAL),內桂酸4-羥基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)，4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)是苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶[11-13]，可有效調節(jié)與之相應的植物次生代謝產物的合成與積累[14-18].圓柏屬植物葉片黃酮類化合物含量隨PAL活性升高而增加，證實了PAL在其黃酮類化合物合成中具有重要作用[19].但也有研究認為銀杏葉片黃酮類化合物含量隨PAL、C4H和4CL活性升高而降低[18]，木質素含量隨PAL、C4H和4CL活性升高而增加[20,21].因此，PAL、C4H和4CL對黃酮類化合物積累的影響因不同植物而異.

沙棘屬(HippophaeL)植物各器官均富含黃酮類等多種天然化學成分，具有重要的生態(tài)效益和社會效益[22],其黃酮類化合物的研究主要集中在優(yōu)化提取工藝、醫(yī)藥研究和不同器官及種間的含量差異等方面[23-26].肋果沙棘(Hippophaeneurocarpa)為沙棘屬中一個僅生長在青藏高原高海拔地區(qū)的類群，然而，干旱脅迫對肋果沙棘黃酮類化合物的積累及其合成代謝相關酶活性變化有怎樣的影響呢？本研究通過PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，探究該脅迫對肋果沙棘試管苗葉片黃酮類化合物積累以及PAL,C4H和4CL活性變化的影響，探討其黃酮類化合物積累與苯丙烷代謝關鍵酶PAL,C4H和4CL的關系，同時為深入認識肋果沙棘與環(huán)境的相互關系提供依據.

1材料與方法

1.1試管苗的培養(yǎng)

將肋果沙棘種子去皮后用70%的酒精浸泡2 min，2%的次氯酸鈉消毒30 min，無菌水沖洗5次后放在培養(yǎng)皿中，并置于光照培養(yǎng)箱(20 ℃、光周期12 h、光強2 000 lx)中培養(yǎng).7 d后根長2 cm左右時接種于MS+0.5 mg·L-16-BA培養(yǎng)基中誘導叢生芽，繼代培養(yǎng)接種于MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IAA+30 g·L-1蔗糖+7.8 g·L-1瓊脂，pH 5.8，150 mL廣口三角瓶中進行試管苗叢生芽增殖培養(yǎng)，每隔15 d左右繼代1次，繼代3～4次后，將試管苗轉接于不含任何激素的MS培養(yǎng)基中，用于實驗.

1.2試劑與儀器

對照品楊梅素(批號 529-44-2)、槲皮素(批號117-39-5)、山奈素(批號520-18-3)和異鼠李素(批號480-19-3)均購自西亞試劑公司；色譜純甲醇、雙蒸水，其余所用試劑均為分析純；高效液相色譜儀(Agilent 1100，USA)，RE52AA型旋轉蒸發(fā)器(北京成萌偉業(yè)科技有限公司)，AR-2140 型分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，DH-120DTN型超聲清洗器(上海狄昊實業(yè)發(fā)展有限公司)，高速冷凍離心機(Beckman，TGL-16M，USA)，島津紫外分光光度計(UV1800，Japan).

1.3實驗方法及測定指標

選擇大小一致、長勢旺盛的幼芽接種于150 mL廣口三角瓶中，采用固液培養(yǎng)法進行干旱脅迫處理.5 d后收集分別用0%(CK),10%(10 g·kg-1),20%(20 g·kg-1),30%(30 g·kg-1)濃度PEG-6000處理的試管苗葉片用于PAL,C4H,4CL活性和類黃酮化合物含量的測定.所有試驗均重復三次.

1.3.1PAL,C4H和4CL活性

1)PAL活性的測定.PAL活性測定參照陳雷[18]等的方法.稱取肋果沙棘葉片0.2 g，加入少許石英砂研碎，加入0.1 mol·L-1pH 8.8硼酸緩沖液(10%甘油、巰基乙醇5 mmol·L-1,1 mmol·L-1EDTA)2 mL，在冰浴中研磨勻漿，勻漿于4 ℃ 下12 000 r·min-1離心20 min，取上清液用于酶活力檢測.反應液包括上清液0.1 mL，3 mL 0.02 mol·L-1苯丙氨酸緩沖液，對照不加苯丙氨酸緩沖液.混勻后于45 ℃恒水浴中反應30 min，加入6 mol·L-1鹽酸0.5 mL溶液終止反應.在290 nm處測定吸光度OD值.以每小時每毫升酶液在290 nm處吸光度變化0.1 OD所需的酶量為一個酶活單位U(相當于1 mL反應混合物形成1 μg肉桂酸).

2)C4H活性的測定.C4H活性測定按照陳雷[18]等的方法.稱取試管苗葉片0.2 g，加入5 mL 4 ℃下預冷的pH 7.6的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(含0.5 mmol·L-1EDTA,0.25 mol·L-1蔗糖、2 mmol·L-1巰基乙醇)，冰浴下研磨勻漿，4 ℃下12 000 r·min-1離心30 min，上清液用于酶活性檢測.測定系統(tǒng)含有酶液0.2 mL,4.0 mg·mL-1NADPH 3 mL,50 mmol·L-1肉桂酸0.2 mL,0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.6)3 mL.對照不加酶液，用磷酸緩沖液代替.反應液在30 ℃保溫30 min，加入6 mol·L-1鹽酸0.2 mL終止反應，取上清液用NaOH調pH=11，340 nm下測定吸光度，以每分鐘OD值變化0.01為一個酶活單位U.

3)4CL活性的測定.4CL活性測定按照陳雷[18]等的方法.稱取0.5 g試管苗葉片，加液氮迅速磨成粉末，放入預冷的0.2 mol·L-1pH 8.0的Tris-HCl緩沖液5 mL(含15 mmol·L-1的巰基乙醇及10%的甘油)，充分混合，4 ℃ 10 000 r·min-1離心20 min，上清液用于酶活性測定.反應體系包括：3 mL 0.1 mol·L-1pH 8.0的Tris-HCl緩沖液(含5 mmol·L-1ATP，0.2 mmol·L-1對香豆酸，5 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.3 mmol·L-1CoA)，加入150 μL粗酶液開始反應.對照不加CoA.40 ℃反應10 min后，加入6 mol·L-1鹽酸0.5 mL終止反應，在333 nm處測定OD值.OD值每分鐘變化0.01為一個酶活性單位U.

1.3.2黃酮類化合物含量

1)檢測波長的確定與專屬性試驗.配制槲皮素、山奈酚、異鼠李素、楊梅素對照品溶液，以甲醇為空白，在200～500 nm的范圍內做紫外掃描，結果顯示：槲皮素、山奈酚和異鼠李素、楊梅素在甲醇中的最大吸收波長分別為370 nm,364 nm,369.5 nm和 375 nm，因此選擇370 nm作為檢測波長.

2)供試樣品溶液的制備.將肋果沙棘試管苗葉片烘干、磨細，并且過100目篩，石油醚過夜除脂.干燥后精確稱取樣品0.50 g，加入75%的乙醇，功率100 KHZ，70 ℃水浴，液料比為1∶30的條件下超聲回流30 min，重復三次，合并濾液并濃縮濾液至約15 mL.按1∶2精密量取濾液與2 mol·L-1鹽酸，在95 ℃條件下加熱回流45 min后冰浴，冷卻后加入Isoamylalkohol(IAA，異戊醇)11.25 mL萃取，吸取上相液體(含有水解的黃酮類物質)，甲醇定容于50 mL的容量瓶中，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液.

3)標準曲線的制作.精確稱取10 mg槲皮素、2.5 mg山奈素、10 mg異鼠李素和10 mg楊梅素對照品于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別配制0.2 mg·mL-1,0.05 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1和0.02 mg·mL-1的對照品溶液,并稀釋為不同濃度梯度溶液.進樣量10 μL，這4種黃酮苷元楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素均呈良好的線性關系(表1).線性關系中,y為色譜峰面積，x為對照品濃度(μg·mL-1)

表1　4種對照品的線性關系

1.4數據統(tǒng)計與分析

數據統(tǒng)計分析和圖表由Microsoft Excel 2003,SPSS 21.0,CoreDraw 9.0和Origin Pro 7.5軟件系統(tǒng)完成BFQ，用Duncan多重比較法進行差異顯著性檢驗，用Pearson法進行相關性分析，檢驗顯著性水平為0.05.

2結果與分析

2.1干旱脅迫對肋果沙棘試管苗葉片黃酮類化合物組成及含量的影響

肋果沙棘試管苗葉片總黃酮含量隨干旱脅迫程度的增強主要表現為先下降后上升的趨勢(圖1A).槲皮素、山奈酚和楊梅素含量的變化與總黃酮類似，均表現為先下降后上升的趨勢(圖1B,C,D)，且在20% PEG-6000脅迫下其含量最低，與對照相比，總黃酮、槲皮素、山奈酚、楊梅素含量分別下降了20.36%,12.84%,47.81%,63.22%.與對照相比，10%,20%和30%的PEG-6000脅迫下異鼠李素含量均有所升高(圖1E)，其含量分別增加了79.99%,2.82%,42.52%，說明干旱脅迫有利于異鼠李素含量的積累.

肋果沙棘試管苗葉片槲皮素含量最高，其次是山奈酚.對照組中，楊梅素含量高于異鼠李素，而在不同濃度的PEG-6000脅迫下表現為異鼠李素含量高于楊梅素.說明干旱脅迫不利于楊梅素含量的積累，但能促進異鼠李素含量增加.

2.2干旱脅迫對肋果沙棘試管苗葉片PAL,C4H,和4CL活性的影響

干旱脅迫顯著影響肋果沙棘試管苗葉片PAL,C4H和4CL活性(P<0.05)，不同酶的活性變化存在一定差異.PAL活性隨脅迫程度的增強而升高，在30%的PEG-6000脅迫下其活性最高，比對照升高了66.68%(圖2A)；C4H和4CL活性隨脅迫程度的增強均呈先升高后下降的趨勢，20%的PEG-6000脅迫下其活性最高，比對照分別升高了49.46%,110.42%.但在30% PEG-6000脅迫下，C4H活性與對照差異不顯著(圖2B)，而4CL活性比對照顯著增加了62.64%(圖2C).

以上結果說明，肋果沙棘試管苗葉片PAL、C4H和4CL對干旱脅迫較為敏感.干旱脅迫下，肋果沙棘試管苗加強了苯丙烷類代謝途徑，提高了三個關鍵酶的活性.

2.3回歸分析

回歸分析表明，楊梅素、槲皮素、山奈酚及總黃酮含量均與PAL,C4H和4CL活性呈負相關關系，主要表現為楊梅素含量與PAL活性呈顯著負相關關系，山奈酚和楊梅素含量均與4CL活性呈極顯著負相關關系，總黃酮含量與4CL活性呈顯著負相關關系(表2).

圖中不同字母表示各處理差異顯著性(P<0.05)，下同

Different letters indicate significant differences among treatmentsP<0.05;The same as below.

圖1干旱脅迫對肋果沙棘試管苗黃酮類化合物含量的影響

Fig 1Effect of drought stress on the contents of flavonoids

in test-tube plantlets leaves ofH.neurocarpa

圖2　干旱脅迫對肋果沙棘試管苗PAL,

3討論

植物在適應環(huán)境脅迫過程中，通過產生數目龐大的次生代謝產物，形成對逆境脅迫的一種特殊響應.實驗室常以試管苗為試材模擬環(huán)境脅迫[27,28]，其遺傳基礎具有同質化特征、便于管理和控制實驗條件等優(yōu)點，并且能較好地避免野外取樣的生長年限、生育期和生長狀態(tài)不一致的影響.有研究發(fā)現多數植物在干旱、傷害、紫外輻射等逆境脅迫下，防衛(wèi)系統(tǒng)尤其是苯丙烷類代謝被激活，催化體內多種具有防御功能的次生代謝物質合成[29,30]，表現為PAL、C4H和4CL等相關酶活性升高[18,19,29]，并且影響著植物體內次生代謝產物的積累[18,19,30].

干旱脅迫對植物體內次生代謝產物含量的影響通常與干旱程度有關.李繼泉等[31]研究表明，在適度干旱脅迫下，植物可利用體內的氮素和碳素促使次生化合物的合成，進而使其含量增加.朱燦燦等[8]研究表明，適度干旱脅迫可以促進銀杏黃酮類物質的合成，尤其是中度干旱脅迫能促進其葉片黃酮類物質合成.謝寶東等[32]的研究證實適度干旱脅迫能有效提高銀杏黃酮類化合物含量，而在充足供水和淹水條件下，其黃酮類化合物含量均沒有明顯增加.也有研究表明酸棗、女貞和銀杏在干旱脅迫下其葉片黃酮類化合物的積累沒有明顯變化[1,5,9,10].就肋果沙棘來看，試管苗葉片總黃酮含量在20% PEG-6000脅迫下含量明顯下降外，其他濃度的PEG-6000脅迫對總黃酮含量均沒有顯著影響.由于不同植物中黃酮成分的種類和含量各槲皮素、山奈酚、異鼠李素和楊梅素是沙棘葉片的主要黃酮苷.以往的研究表明，沙棘葉片中槲皮素含量最高，其次是山奈酚，再次是異鼠李素，而楊梅素含量甚微，經常檢測不到[24,25].本實驗通過高效液相色譜法檢測了肋果沙棘試管苗葉片的四種主要黃酮苷；槲皮素含量最高，其次是山奈酚，這與以往的研究結果一致[24,25].在水分充足的對照組中楊梅素含量高于異鼠李素，而在PEG-6000脅迫下異鼠李素含量均高于楊梅素.說明干旱脅迫能使肋果沙棘葉片異鼠李素含量增加，但不利于楊梅素的積累；并且，干旱脅迫對異鼠李素含量的影響最大，其次是楊梅素，再次是山奈酚，對總黃酮含量影響較小，而對槲皮素含量沒有顯著影響.

表2　干旱脅迫下肋果沙棘試管苗葉片酶活性及黃酮含量的相關系數(r2)

*P<0.05；**P<0.01異，所以不同學者對各種植物的黃酮成分受干旱脅迫的研究結果不盡相同.

肋果沙棘試管苗葉片PAL,C4H和4CL對干旱脅迫較為敏感，隨PEG-6000脅迫程度的增加，這三種酶活性較對照顯著升高.總黃酮、槲皮素、山奈酚、楊梅素含量的變化趨勢與PAL、C4H和4CL活性的變化趨勢正好相反.回歸分析也顯示這三種酶的活性與葉片黃酮類化合物含量存在負相關關系，這與在銀杏葉片中的研究結果一致[18].其主要原因在于：苯丙烷類代謝的產物除黃酮類化合物外，還包括木質素等次生代謝物質[33]，而黃酮類化合物含量的高低除了與相關酶活性有關外還與次生代謝的中間產物向木質素、類黃酮等化合物中的分配有關.有研究顯示，PAL、C4H和4CL活性與木質素含量呈顯著正相關[20,21].當植物受到外界環(huán)境脅迫時，苯丙烷類代謝被激活，PAL和C4H活性升高，產生更多的木質素等能夠減少外界環(huán)境脅迫對植物組織造成傷害的物質，進而保護植物組織[34].肋果沙棘試管苗在干旱脅迫下，苯丙烷類代謝被激活，PAL、C4H和4CL活性升高，而黃酮類化合物含量并沒有提高，可能與更多中間代謝產物用于木質素等次生代謝產物的生物合成有關.

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(責任編輯俞詩源)

作者簡介：孫坤(1965—)，男，甘肅民勤人，教授，博士，博士研究生導師．主要研究方向為系統(tǒng)與進化植物學．

基金項目:國家自然科學基金資助項目(30160046，30960029)

收稿日期：2015-01-08;修改稿收到日期:2015-03-03

E-mail:kunsun@nwnu.edu.cn