一測多評法測定三顆針中4種生物堿類成分的含量

田妮娜 ，封士蘭 ，周 麗

（1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學藥學院，寧夏 銀川 750004）

一測多評法測定三顆針中4種生物堿類成分的含量

田妮娜1，2，封士蘭1，周 麗3

（1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學藥學院，寧夏 銀川 750004）

目的建立三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺一測多評法，驗證該方法的可行性和技術適應性。方法 以小檗堿為指標，計算巴馬汀、尖刺堿、小檗胺與小檗堿的相對校正因子，并用該校正因子進行巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量計算，同時采用外標法測定三顆針中該4種生物堿的含量，并比較外標法與一測多評法的結果，以驗證一測多評法的準確性和可行性。結果 外標法與一測多評法的結果無顯著性差異（RSD＜5.0%）。結論 以一測多評法測定三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量是準確可行的。

一測多評法；三顆針；生物堿；外標法

三顆針為常用中藥，是小檗科植物擬獠豬刺、小黃連刺、細葉小檗或匙葉小檗等同屬數(shù)種植物的干燥根，主要用于濕熱瀉痢、黃疸、濕疹、咽痛目赤等癥，小檗堿的含量是目前對三顆針藥材、飲片質量控制的主要依據(jù)[1]。但隨著對三顆針生物活性及化學成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)巴馬汀、小檗胺、尖刺堿均具有較為顯著的生物活性，且含量較高[2～4]，在多個品種中均有分布，亦可納入三顆針藥材質量控制體系。目前雖有用高效液相色譜法測定三顆針中小檗堿、巴馬汀的含量[5]，但因某些對照品（如尖刺堿提純難度較大）難以獲得或分析成本過高等，還未見用外標法同時測定三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺含量的文獻報道，這對三顆針藥材進行多指標質量控制造成了較大困難。

一測多評法（QAMS）以樣品中某一成分為內(nèi)參物，建立該成分與其他成分間的相對響應因子，通過相對響應因子計算其他成分含量。該方法能有效解決多指標質量控制面臨的對照品短缺和檢測成本高昂等問題，實現(xiàn)了多成分同步測定[6]，目前已應用于黃連、補骨脂、虎杖等中藥的質量評價[7～9]，其中黃連一測多評的含量測定方法已收入2010年版《中華人民共和國藥典》。

針對三顆針中生物堿類對照品外缺現(xiàn)狀，為滿足對三顆針進行全面質量監(jiān)控的迫切需求，筆者應用一測多評法對三顆針中小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量進行測定，從而對三顆針進行多指標質量控制。以價廉易得的小檗堿作為內(nèi)參物，通過建立其與巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的相對校正因子進行含量計算，并考察該方法的耐用性及系統(tǒng)適用性，探討一測多評法在三顆針藥材多指標質量評價中的適用性和準確性。

1 儀器與材料

Thermo U3 000高效液相色譜系統(tǒng)，Chromeleon 7.1工作站，Agilent 1 260高效液相系統(tǒng)，Agilent chemstation工作站；AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK

C18 MG II(4.6 mm×250 mm，5μm)；KQ-100 超聲儀（ 40 KW）；乙腈、甲醇為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。鹽酸小檗堿（110 713-201 212）和鹽酸巴馬?。?10 732-201 309）購自中國藥品生物制品檢定所，鹽酸尖刺堿（1 745-1）和鹽酸小檗胺（A0 619）購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，三顆針藥材和飲片購自四川、貴州、云南等地，經(jīng)蘭州大學藥學院封士蘭教授鑒定為細葉小檗的干燥根。

2 方法與結果

2.1 一測多評方法學考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，CAPCELL PAK C18 MG II(4.6 mm ×250 mm，5μm)；流動相為乙腈 -0.02mol／L磷酸二氫鉀溶液(25∶75)，柱溫30℃，流速0.6ml·min-1，檢測波長232 nm。在上述色譜條件下，各組分離度良好，見圖1。

圖1 三顆針藥材中4種生物堿色譜圖

2.1.2 對照品溶液的制備 取小檗堿、巴馬汀、尖刺堿與小檗胺4 種生物堿，精密稱定，分別為 7.63、8.04、16.38、11.28 mg 置于10m l量瓶中，用甲醇定容至刻度，精密移取上述4個對照品溶液各1m l，置于50 m l量瓶中，加甲醇定容至刻度，為混標溶液。將上述混標保存于4℃冰箱中，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品三顆針藥材粉末（過40目篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇—鹽酸（ 90∶1）50 m l，密塞，稱定重量，水浴回流 30 min，再超聲處理(功率250W，頻率40 kHz)1h，放冷，再稱定重量，用甲醇—鹽酸（90∶1）補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm濾膜，5μl進樣。

2.1.4 線性范圍 精密吸取上述混合對照品溶液40、30、20、10、8、6、4、2、1μl，進樣分析，每個濃度進樣 3 次，取平均值。以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理，得巴馬汀、尖刺堿、小檗胺與小檗堿的回歸方程（見表1）。

表1 三顆針藥材中4種生物堿的回歸方程

2.1.5 校正因子計算 以小檗堿為內(nèi)標物，計算小檗堿對巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的校正因子，見表2。

表2 三顆針藥材中各生物堿的相對校正因子

2.1.6 精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液5μl，于同一天內(nèi)連續(xù)進樣5次，記錄小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的峰面積，得出日內(nèi)精密度分別為0.9%、0.8%、0.6%、1.3%；精密吸取同一供試品溶液5μl連續(xù)進樣3 d，每天3次，記錄峰面積，以上4個生物堿成分的日間精密度分別為 2.1%、1.5%、1.4%、2.8%。表明儀器較為穩(wěn)定。

2.1.7 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液5μl，分別于配制后的 0、2、4、8、12、24 h 測定面積積分值，小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺穩(wěn)定性的RSD分別為1.3%、1.1%、2.2%、0.9%。表明處理后的樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復性實驗 稱取三顆針（產(chǎn)地四川）藥材粉末（40目）約0.1 g共6份，精密稱定，按“2.1.3”項下制備樣品，測定小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的平均含量分別為34.14、16.32、10.74、11.56 mg·g-1，RSD 分別為 2.1%、1.9%、2.6%、2.7%、表明該方法的重復性良好。

2.1.9 加樣回收率 精密稱取適量已知含量的三顆針藥材粉末（40目）6份，加入一定量的“2.1.2”項下（小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺）對照品溶液各1m l，按“2.1.3”項下制備樣品，測定，計算加樣回收率，小檗堿、巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的加樣回收率分別為100.5% 、99.8%、101.1%、102.6%，RSD分別為2.2%、1.8%、1.9%、2.4%、表明該方法的回收率良好。

2.2 校正因子的重現(xiàn)性考察

2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，進樣 10、5、2、1、0.5 μl測定，按“ 2.1.5”項下計算小檗堿對巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的校正因子。實驗考察了Thermo U3000和Agilent1 260兩種高效液相色譜系統(tǒng)，AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK C18 MG II(4.6 mm×250mm，5μm)兩種色譜柱，結果見表3。

2.2.2 同一品牌儀器不同實驗室的考察 對不同實驗室同一品牌儀器建立的一測多評方法進行復核，儀器為Thermo U 3 000，色譜柱為 AcclaimTM 120 C18（ 4.6mm×250mm，5μm），以10、5、2、1、0.5μl進樣測定個各成分相對校正因子，結果見表4。

表3 不同儀器和色譜柱測得相對校正因子

表4 不同實驗室測得相對校正因子

在建立小檗堿與其余3種生物堿類成分間的相對校正因子的評價中，我們考察了不同色譜柱、液相色譜系統(tǒng)和實驗室對校正因子的影響，結果表明，以上建立的校正因子具有較好的可信度。

2.2.3 待測組分色譜峰的定位 據(jù)文獻報道,可通過保留時間差和相對保留值進行峰定位，結果見表5。據(jù)結果可知，兩種定位方法的RSD≤5.0%，說明這兩種方法均能準確判斷巴馬汀、尖刺堿、小檗胺色譜峰的位置。但因保留時間差波動較為明顯，相對保留值波動較小，所以選擇相對保留值來定位待測組分色譜峰。

表5 不同儀器和色譜柱測得的相對保留值

2.3 一測多評法與外標法結果比較研究

分別精密吸取供試品溶液各5μl注入高效液相色譜儀，測定。采用外標兩點法和一測多評法計算三顆針藥材中巴馬汀、尖刺堿、小檗胺的含量，結果見表6。

由表6可知，常規(guī)的外標法實測含量值與一測多評計算含量值比較無顯著性差異(RSD＜5.0%)。由此說明一測多評法可用于三顆針藥材的多指標成分質量評價研究。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本實驗選用超聲、回流和回流后超聲等不同提取方法，考察不同提取方法對三顆針中生物堿提取效率的影響，得出結論：水浴回流30min，再超聲處理(功率250W，頻率40 kHz)1h，藥材中的生物堿提取效率較高。

3.2 提取溶劑的選擇

本實驗選用甲醇、乙醇和丙酮3種提取溶劑，以及加酸與否和加酸的比例，得出結論：用甲醇—鹽酸（90∶1），藥材中的生物堿提取較為完全。

表6 外標法和一測多評法（內(nèi)標法）測定三顆針中生物堿含量的比較 (%，n=3)

3.3 流動相的選擇

比較甲醇、水、磷酸不同用量和流動相不同pH值對鹽酸小檗堿的保留時間及其相鄰峰分離度的影響。結果表明乙腈-0.02mol／L磷酸二氫鉀溶液(25∶75)，保留時間適當分離效果較好，與其它方法相比，該方法所采用的流動相具有簡便、柱污染小、分離度好的優(yōu)點。

3.4 內(nèi)標物的選擇

本實驗選用小檗堿為內(nèi)標物進行一測多評法的理由是：小檗堿不僅是三顆針中主要藥效成分，而且是2010年版《中華人民共和國藥典》中三顆針質量控制的指標性成分，并且其含量較高，性質穩(wěn)定，價廉易得。

3.5 小結

本研究初步建立了一測多評法，通過測定12個批次三顆針中4種生物堿類成分，結果表明，一測多評法與外標法得到的含量值之間沒有顯著性差異（RSD＜5.0%)，說明建立的校正因子具有較好的可信度，可在對照品外缺時，通過一測多評技術實現(xiàn)同步測定三顆針藥材中生物堿類成分的多個指標成分，為三顆針藥材多指標質量控制體系提供了更加便捷、科學的檢測方法。

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1671-1246（2015）15-0113-04