2型糖尿病基因診斷的研究進(jìn)展*

吳斌 吳鏗

2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，臨床表現(xiàn)包括口渴、多飲、多食、多尿、消瘦等，主要是由于胰島素分泌和/或作用缺陷所引起。T2DM的發(fā)展是多因素、多基因參與的過程，其致病機(jī)制復(fù)雜，包括遺傳因素和環(huán)境因素，現(xiàn)有的診斷標(biāo)準(zhǔn)并不能從遺傳學(xué)的角度解釋病因及發(fā)病機(jī)制，難以從基因的整體表達(dá)譜全面地觀察2型糖尿病發(fā)病時(shí)基因的反應(yīng)模式，并且具有一定的滯后性，因而研究起來(lái)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、進(jìn)度緩慢。然而，越來(lái)越多的研究表明，遺傳因素在T2DM的發(fā)病過程中占據(jù)更為主要的地位，全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）證實(shí)，T2DM有眾多的遺傳易感基因[1-2]。因此，基因診斷就顯得尤為重要，從基因角度分析2型糖尿病，對(duì)2型糖尿病的診治將會(huì)提供更多的幫助。本文就基因診斷在2型糖尿病中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 基因診斷的研究現(xiàn)狀

1.1 基因診斷概述 基因診斷是一項(xiàng)在重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的應(yīng)用技術(shù)，其檢測(cè)原理是對(duì)受檢者的某一特定基因（DNA）和/或其轉(zhuǎn)錄物（RNA）進(jìn)行分析和檢測(cè)，進(jìn)而對(duì)相應(yīng)的疾病做出診斷，從基因水平闡明疾病的病因所在。目前，基因診斷技術(shù)已經(jīng)廣泛的被應(yīng)用于諸多領(lǐng)域[3]?；诓煌臋z測(cè)內(nèi)容，基因診斷可以分為DNA診斷和RNA診斷兩部分。前者主要分析基因的結(jié)構(gòu)如DNA序列的缺失、插入、點(diǎn)突變等；后者側(cè)重分析基因的功能，如mRNA量的變化、外顯子變異以及間接加工缺陷等。按照檢測(cè)策略，基因診斷也可以分為兩大類：一類為直接基因診斷，指直接對(duì)致病基因本身進(jìn)行檢查。通常應(yīng)用基因本身或鄰近的DNA序列作為探針，也可以利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因探查，以檢測(cè)有無(wú)點(diǎn)突變、缺失等異常并且判斷其性質(zhì)；另一類為間接基因診斷，主要用于當(dāng)基因結(jié)構(gòu)不清、復(fù)雜或突變過多而導(dǎo)致無(wú)法一一檢測(cè)時(shí)，對(duì)被檢者及其家系進(jìn)行遺傳連鎖分析，通過鑒定遺傳標(biāo)記的存在，進(jìn)而確定患者是否獲得帶有致病基因的染色體[4]。

1.2 基因診斷的研究技術(shù)及相關(guān)技術(shù) （1）Southern blot和Nouthern blot：檢測(cè)特定的DNA、RNA主要的核酸雜交技術(shù)有Southern blot和Nouthern blot，該技術(shù)主要有3個(gè)步驟：核酸的分離與純化、探針的制備和分子雜交。（2）聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR） 及 相 關(guān) 技 術(shù)：PCR是 一 種對(duì)指定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的技術(shù)方法。在PCR基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了包括多重PCR（multiplex PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）、 序 列 特 異 引 物PCR（Sequence Specific Primer，PCR-SSP）、 逆 轉(zhuǎn) 錄PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）等。（3）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：RFLP是第一代DNA分子標(biāo)記技術(shù)，被用于基因組遺傳圖譜的構(gòu)建、基因的定位以及生物進(jìn)化和分類等眾多領(lǐng)域的研究。利用同一種限制性內(nèi)切酶切割不同物種DNA序列時(shí)，可獲得不同長(zhǎng)度、大小、數(shù)量的限制性酶切片段，再將這些片段電泳、轉(zhuǎn)膜、變性，并且與標(biāo)記過的探針進(jìn)行雜交、洗膜，便可分析其多態(tài)性結(jié)果。（4）變性高效液相色譜分析（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）：DHPLC是一項(xiàng)新的雜合雙鏈突變檢測(cè)技術(shù)，能自動(dòng)檢測(cè)單堿基替代以及小片段核苷酸的插入或缺失，可檢測(cè)基因的變異情況。（5）基因芯片技術(shù)：基因芯片是通過微量點(diǎn)樣技術(shù)等方法，對(duì)DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效的解讀和分析，從而對(duì)基因序列及其功能進(jìn)行大規(guī)模高通量的研究，迅速而準(zhǔn)確的解讀遺傳信息。（6）新一代基因測(cè)序技術(shù)：新一代基因測(cè)序技術(shù)是一種和基因芯片技術(shù)互相補(bǔ)充的新的高通量測(cè)序方法，通常是指一個(gè)技術(shù)群，不同的新一代基因測(cè)序技術(shù)，在原理上存在較大的差別。主要包括：全基因組測(cè)序（Whole-Genome Sequencing，WGS）、全外顯子組測(cè)序（Whole-Exome Sequencing，WES）和目標(biāo)區(qū)域測(cè)序（Targeted Regions Sequencing，TRS）等。（7）熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）：FISH是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)，利用非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛）標(biāo)記探針，按照堿基配對(duì)原則進(jìn)行雜交，借助熒光素偶聯(lián)的抗原抗體檢測(cè)系統(tǒng)，在鏡下對(duì)組織、細(xì)胞及染色體DNA或RNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。

2 2型糖尿病基因診斷的研究進(jìn)展

2.1 單基因突變型糖尿病 單基因突變型糖尿病約占所有糖尿病患者的2%~5%，這種類型糖尿病的外顯率（即某人攜帶突變基因并發(fā)展成糖尿病的可能性）很高，為研究其發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。（1）青少年發(fā)病的成人型糖尿?。∕aturity-Onset Diabetes of the Young，MODY）：MODY是單基因突變型糖尿病首先發(fā)現(xiàn)的類型，是一組遺傳異質(zhì)性的臨床疾病，其共同特征包括存在非酮癥糖尿病、常染色體顯性遺傳模式、胰島β細(xì)胞功能缺陷。根據(jù)突變基因可分為MODY1（HNF4A）、MODY2（GCK）、MODY3（TCF1）、MODY4（IPF1）、MODY5（TCF2）、MODY6（NeuroD1）、MODY7（KLF11）、MODY8（CEL），此外還包括由酶參與底物代謝所引起的突變型MODY及轉(zhuǎn)錄因子型MODY[5]。（2）線粒體糖尿?。∕itochondrial Diabetes）：線粒體糖尿病是母系遺傳性糖尿病，常伴有輕中度神經(jīng)性耳聾，常由編碼亮氨酸的tRNA的A3243G點(diǎn)突變引起。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體基因突變可導(dǎo)致胰島素的利用障礙[6-7]。（3）脂肪萎縮性糖尿?。褐疚s性糖尿病常與缺乏或缺少脂肪組織、重度胰島素抵抗、高脂血癥、脂肪肝等有關(guān)。脂肪萎縮性糖尿病有若干類型。其中，部分脂肪萎縮類型是由核纖層蛋白基因A/C（LMNA）突變引起的一種常染色體為主要形式的遺傳病。這類患者通常有過多的脂肪堆積在顏面和上半身，然而在軀干和下肢的脂肪含量卻逐漸減少。另外，小鼠胸腺瘤癌基因（AKT2）的突變參與了胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，鋅金屬蛋白酶（ZMPSTE24）參與了脂肪萎縮的過程，也被認(rèn)為引起部分脂肪萎縮性糖尿病的原因之一[8]。（4）過氧化物酶體增生物激活受體（PPARγ）基因突變：PPARγ是核受體的PPAR的一種亞型。它是調(diào)控脂質(zhì)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪組織中高度表達(dá)，也在胰島β細(xì)胞中表達(dá)。其與配體結(jié)合后和維甲酸X受體形成異源二聚體，結(jié)合特定的DNA，起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。PPARG基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性脂肪萎縮綜合征并伴有早期糖尿病的癥狀。例如，Barroso與其同事在對(duì)重度胰島素抵抗和早期糖尿病的研究中，發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了兩個(gè)顯性負(fù)突變基因（p467l和v290m），其突變體具有降低轉(zhuǎn)錄并抑制野生型PPARγ的作用。在對(duì)加拿大的一個(gè)患有家族性脂肪代謝障礙的家族的研究中發(fā)現(xiàn)，位于PPARγ配體結(jié)合域的雜合基因P388L存在突變[9-12]。

2.2 多基因突變型糖尿病 與單基因突變型糖尿病相比，多基因突變型糖尿病更為常見，過去的二三十年中，筆者在鑒定2型糖尿病基因突變的領(lǐng)域中付諸了巨大努力。候選基因分析法在三種基因（PPARG，KCNJ11，WFS1）中成功鑒定出增加2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的常見變異位點(diǎn)。全基因組連鎖分析在多個(gè)患有2型糖尿病的家族中鑒定出CAPN10和TCF7L2等基因。近期，全基因組關(guān)聯(lián)分析法（GWAS）對(duì)大量的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行基因分型，成功鑒定出更多的與2型糖尿病相關(guān)的基因或染色體位點(diǎn)。目前，GWAS已成功鑒定出14個(gè)基因或位點(diǎn)，這些基因或位點(diǎn)的序列變異在人群中很常見，并且每個(gè)基因或位點(diǎn)變異都可增加2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)。

2.2.1 候選基因關(guān)聯(lián)分析法 目前已研究出上百個(gè)候選基因，其中可高度復(fù)制的候選基因有以下幾種。（1）內(nèi)向整流鉀通道亞家族11（KCNJ11）：ATP敏感性鉀通道（KATP）在胰島β細(xì)胞表達(dá)并且是調(diào)節(jié)胰島素分泌的關(guān)鍵因子。它由一個(gè)內(nèi)向整流鉀通道Kir 6.2與磺酰脲類受體（由ABCC8編碼）組成，Kir 6.2是染色體11p15.1上的KCNJ11基因編碼，KCNJ11突變屬罕見的激活突變。谷氨酸（E）的一個(gè)常見的錯(cuò)義突變ABCC8取代賴氨酸（K）的23位點(diǎn)即（E23K）常被認(rèn)為與2型糖尿病有關(guān)。有證據(jù)顯示，攜帶K23基因的患者有很大的可能性對(duì)磺脲類藥物產(chǎn)生繼發(fā)性失效[10-11]。（2）過氧化物酶體增生物激活受體（PPARγ）：PPARG的一個(gè)常見變異是脯氨酸被丙氨酸在12密碼子位點(diǎn)替換（P12A），丙氨酸的等位基因頻率在白種人中很高（0.11-0.19），而在非洲裔美國(guó)人中卻相對(duì)較低（0.02）。有研究表明，PPARG的丙氨酸12位點(diǎn)與降低2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，而脯氨酸12位點(diǎn)增加了胰島素抵抗及2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[12]。（3）其他候選基因：WFS1突變導(dǎo)致的Wolfarin氏綜合征，可引起尿崩癥、糖尿病、視神經(jīng)萎縮和耳聾；HNF4A突變可引起MODY1等。

2.2.2 全基因組連鎖分析法 （1）轉(zhuǎn)錄因子7類似物2（TCF7L2）：利用全基因組連鎖分析法精細(xì)定位標(biāo)記后，發(fā)現(xiàn)在染色體10q25上，TCF7L2的四核苷酸DG10S478與T2DM的發(fā)生密切相關(guān)，其中TCF7L2是T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)含子3上的rs7903146是一個(gè)高度可復(fù)制的變異位點(diǎn)，rs7903146等位基因增加了約1.4倍的2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)，TCF7L2在信號(hào)通路（WNT）中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和變異，在腸內(nèi)分泌細(xì)胞，信號(hào)通路通過TCF7L2影響胰高素血糖樣肽-1（GLP-1）的分泌[13]。（2）鈣蛋白酶10（CAPN10）：通過全基因組連鎖分析法，在CAPN10上鑒定出3個(gè)常見的可增加2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)的變異位點(diǎn)。CAPN10編碼鈣調(diào)節(jié)的半胱氨酸蛋白酶，并在多個(gè)組織廣泛表達(dá)。有研究證實(shí)，該基因上的變異與2型糖尿病有關(guān)。然而，CAPN10是如何影響2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)還不得而知，但鑒于此酶的廣泛表達(dá)，其可能是通過影響胰島素抵抗和胰島素分泌發(fā)揮作用[14]。

2.2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析法（GWAS） Sladek和同事首次報(bào)道了一個(gè)存在于染色體8q24.11上的基因SLC30A8，其可增加2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)，還可編碼鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8（ZNT8），而ZTN8主要表達(dá)于胰島β細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)隨后也在其他的GWAS研究中被證實(shí)[15]。GWAS研究證實(shí)，葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白基因GCKR與空腹血清甘油三酯水平有關(guān)，位于GCKR上的一個(gè)突變基因P336L與甘油三酯水平、降低空腹血糖水平及降低2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。有研究表明，位于染色體3q27的胰島素樣生長(zhǎng)因子2結(jié)合蛋白2（IGF2BP2）的基因突變與2型糖尿病有關(guān)，可增加2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)[16]。FTO是一個(gè)與脂肪量和肥胖相關(guān)的基因，位于染色體16q12，其在2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)方面的作用基于身體質(zhì)量指數(shù)的高低[17]。最近，GWAS研究鑒定出一個(gè)新的亞洲人口的2型糖尿病易感基因KCNQ1，位于染色體11p15.5，主要表達(dá)于心臟，少量表達(dá)在其他組織如胰腺、肝臟和脂肪組織等，其在增加2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)還可引起長(zhǎng)QT間期綜合征[18]。其他一些GWAS研究也分別證實(shí)了一些與2型糖尿病有關(guān)的基因，包括CDKAL1、CDKN2A、CDKN2B、HHEX、KIF11、IDE 等[19-20]。

3 討論

自從1993以來(lái)，筆者對(duì)于糖尿病的遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)有了顯著進(jìn)步，一些在人群中相對(duì)罕見的包含突變點(diǎn)的基因，在基因表型上起重要作用，可以引起單基因型糖尿病。攜帶這些突變基因的人群有很高的糖尿病發(fā)病率。然而，這類人群也僅占糖尿病總?cè)藬?shù)的一小部分，這些基因的發(fā)現(xiàn)揭示了葡萄糖穩(wěn)態(tài)新的通路和機(jī)制。

目前GWAS芯片對(duì)2型糖尿病基因變異的檢測(cè)，多數(shù)局限于白種人。未來(lái)，GWAS、外顯子組和全基因組測(cè)序研究還需要兼顧分析其他人群和其他種類的遺傳變異。隨著高通量、低成本以及樣本量的增加，人類在解開2型糖尿病復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)的進(jìn)程中將會(huì)呈現(xiàn)前所未有的飛越。

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