加格略(重樓)蒸制前后HPLC 指紋圖譜對比研究*

張 敏，李 瑋，黃穎雪，何蘭蘭，王 令，鄭繼廣，王小波

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

重樓為百合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七葉一枝花ParispolyphyllaSmith ar.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖。具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，主要用于咽喉腫痛、跌打傷痛、毒蛇咬傷、驚風(fēng)抽搐等癥[1]。苗醫(yī)學(xué)記載加格略又名重樓、七葉一枝花、燈臺七、獨角蓮，具有補虛的作用[2]?，F(xiàn)代研究表明，加格略主要化學(xué)成分為甾體皂苷、甾醇、黃酮類等[3-6]。其主要應(yīng)用于抗腫瘤、止痛鎮(zhèn)靜、抑菌消炎、抗病毒、心腦血管、免疫調(diào)節(jié)、胃腸疾病等的治療[7-9]。

《貴州苗藥·興仁卷》記載，采用加格略蒸制品治療胃潰瘍，臨床上尚未見報道。本課題組前期開展的加格略蒸制前后抗胃潰瘍藥效研究發(fā)現(xiàn)，蒸制前后抗胃潰瘍作用具有一定的差異，有關(guān)其存在差異的具體原因尚不清楚，因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以蒸制前后指紋圖譜對比研究，從整體上判斷蒸制前后指紋圖譜是否具有差異，以闡明加格略蒸制前后抗胃潰瘍藥效差異的原因。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀(型號：LC-16，島津儀器(蘇州)有限公司)；超聲波清洗機(型號：HS10260D，天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；萬分之一電子分析天平(型號：ME204E，上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；十萬分之一電子分析天平(型號：AUW220D，蘇州島津儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(型號：LDP-150，浙江永康市紅太陽機電有限公司)；真空干燥箱(型號：DZ-2BC，天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

重樓皂苷Ⅰ(批號GDZZ-0605)、重樓皂苷Ⅶ(批號GDZZ-0609)、重樓皂苷Ⅵ(批號GDZZ-0608)、重樓皂苷Ⅱ(批號GDZZ-0606)，均來自貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司。甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.9%，批號20180820)；乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.9%，批號20180223)；提取所用甲醇為分析純(天津市富宇精細化工有限公司，質(zhì)量分數(shù)≥99.5%，批號20171115)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈有限公司授權(quán)貴陽娃哈哈昌盛飲料有限公司制造，批號20180829)；其余試劑均為分析純。

加格略藥材購自安順市寶林科技中藥飲片有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定為百合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz的新鮮根莖。具體來源見表1。

表1 10批加格略藥材來源表

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

加格略生品的制備：取加格略藥材，洗凈，于60 ℃烘箱烘干。

加格略蒸品的制備：取加格略鮮藥材，洗凈，放置蒸鍋內(nèi)蒸制透心，取出，放涼，于60 ℃烘箱烘干。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取加格略皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品適量，于容量瓶中，加入甲醇，制成含加格略皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ濃度分別為0.5 mg·mL-1的混合對照品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.3 供試品溶液的制備

取過3號篩的加格略粉末約0.5 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密稱定，加入甲醇10 mL，稱重，超聲提取30 min，冷卻至室溫，用甲醇補重，過濾，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱：InerSustain C18(5 μm，4.6×250 nm)，流動相：乙腈(B)-水(A)，梯度洗脫程序見表2；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm；進樣量10 μL。

表2 流動相洗脫程序

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗

取同一供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。通過指紋圖譜相似度評價軟件，進行色譜峰匹配，所得圖譜之間相似度在0.999～1.000之間，均大于0.900，其共有色譜峰相對保留時間RSD值均小于3%，表明該儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、18 h、24 h進行測定。通過指紋圖譜相似度評價軟件，進行色譜峰匹配，計算圖譜相似度在0.996～1.000之間，均大于0.900，其共有色譜峰相對保留時間RSD值均小于3%，表明該樣品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗

取同一批次藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下的色譜條件進行測定，計算相似度在0.996～1.000之間，其共有色譜峰相對保留時間RSD值均小于3%，結(jié)果表明該實驗方法重復(fù)性良好。

2.6 樣品HPLC指紋圖譜的建立及技術(shù)參數(shù)

2.6.1 生品指紋圖譜共有模式的建立及共有色譜峰的標定

取10批加格略生品樣品粉末適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進行測定，記錄譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)計算相似度并建立10批加格略生品指紋圖譜共有模式。

對不同的供試品色譜圖的檢測結(jié)果進行比較，共標定了11個共有指紋圖譜色譜峰。以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對照品對色譜峰進行定性分析，標示出特征峰，確認了7號峰為加格略皂苷Ⅵ、8號峰為加格略皂苷Ⅶ、9號峰為加格略皂苷Ⅱ、10號峰為加格略皂苷Ⅰ。因重樓皂苷Ⅶ為加格略主要有效成分之一，與其他色譜峰相比其分離度和峰型較好，理論塔板數(shù)較高，故將其設(shè)定為內(nèi)參物，其色譜峰標記為S。結(jié)果見表3、圖1。

表3 10批加格略生品相似度

7重樓皂苷Ⅵ 8重樓皂苷Ⅶ 9重樓皂苷Ⅱ 10重樓皂苷Ⅰ

2.6.2 蒸制加格略指紋圖譜

取蒸制品加格略樣品粉末，按“2.3”項最佳提取工藝方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進行測定，記錄譜圖。見圖2。

圖2 蒸制加格略指紋圖譜

2.6.3 蒸制前后指紋圖譜對比

通過蒸制品與生品共有模式及同一批次蒸制品與生品相比較，從整體上判斷蒸制前后指紋圖譜的差異，得出加格略蒸制品與生品色譜峰數(shù)量及峰高具有一定的差異，結(jié)果見圖3。

S1蒸制品 S2生品

3 討論

通過對提取方法、提取溶劑、溶劑質(zhì)量分數(shù)、料液比、提取時間等進行考察，最終優(yōu)化的最佳提取工藝為：取0.5 g粉末，加入質(zhì)量分數(shù)為100%甲醇10 mL，超聲提取30 min。

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統(tǒng)(2012版(國家藥典委員會))對10個批次的加格略藥材的色譜圖進行比較研究，發(fā)現(xiàn)不同批次的加格略藥材整體色譜峰峰型相似，其相似度在0.812～0.951之間，說明不同產(chǎn)地加格略藥材的化學(xué)組成一致性較好?？捎糜诩痈衤运幉牡馁|(zhì)量評價。

以生品共有模式與蒸制品及同一批次生品與蒸制品相比較，從整體上得出蒸制品和生品指紋圖譜間具有明顯的差異，因此初步判斷加格略蒸制前后化學(xué)成分及含量發(fā)生了一定的變化。本研究為前期加格略蒸制前后抗胃潰瘍藥效差異提供了一定的依據(jù)。該試驗方法簡單易行，重復(fù)性較好，可為加格略藥材質(zhì)量分析和后期抗胃潰瘍藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進一步研究奠定一定的基礎(chǔ)。