人參多糖對(duì)腦出血模型大鼠的干預(yù)效果及對(duì)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

鄭希院,翟潔敏，李會(huì)琪，趙龍斌，高章代

腦出血是非外傷性腦組織內(nèi)血管破裂引起的出血，是一種常見疾病、多發(fā)疾病，發(fā)病率與病死率呈上升趨勢(shì)，屬于急性腦血管病中的危重類型，嚴(yán)重危害人類的身體健康[1]。 患者在腦出血時(shí)，不但會(huì)出現(xiàn)血腫性病變，還會(huì)繼發(fā)腦水腫、缺血、炎性反應(yīng)、血腫周圍組織能量代謝紊亂等一系列腦損傷[2]。腦出血患者發(fā)病年齡逐漸年輕化，即使幸存者亦會(huì)遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響，帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。腦出血造成的腦損傷，主要由血腫擴(kuò)大導(dǎo)致的機(jī)械性壓迫所致周圍組織缺血及在血塊形成過程中和形成后導(dǎo)致[4]?，F(xiàn)觀察人參多糖對(duì)腦出血模型大鼠的干預(yù)效果及對(duì)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物：健康雄性SD大鼠50只，月齡6～10(8.8±0.7)月，體質(zhì)量340～480(360.0±58.6)g，由北京科奧力飼料有限公司提供[合格證號(hào)：京動(dòng)(2000)第015號(hào)]。大鼠均生活于(24.0±2.1)℃的環(huán)境、無病原菌的飼養(yǎng)籠中，予高溫及高壓消毒的食物和水喂養(yǎng)。(2)試劑：人參多糖(陜西斯諾特生物科技有限公司)，水合氯醛[生工生物工程(上海)股份有限公司]，酶聯(lián)免疫試劑盒(北京維德維康生物技術(shù)有限公司)，TBARS試劑盒(江蘇江萊生物科技有限公司)。(3)儀器：光鏡(美國(guó)Ted Pella)；冰箱(Eppendorf艾本德中國(guó)有限公司，型號(hào) ep000000)；電子天平(北京金達(dá)陽光科技有限公司，型號(hào) CP153)；恒溫干燥箱(東菀市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司，型號(hào) SPCC)；SuperMaze Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置(上海欣軟信息科技有限公司，型號(hào) XR-XM101)；BD FAC SCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(北京德利卡生物科技有限公司，型號(hào) DLK0002051)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年5—7月于西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 人參多糖提取物制作： 人參50 g加入蒸餾水100 ml中，冷浸過夜后，加熱煮沸30 min,留取清亮液體小火加熱濃縮到10 ml，制成含生藥2 g/ml的藥液，陰涼后以濾紙過濾藥液，再用一次性針頭濾器過濾后，分裝于安瓿滅菌后放入冰箱備用。

1.2.2 大鼠腦出血模型建立：隨機(jī)選取大鼠10只作為正常組， 余大鼠40只使用Rosenberg法制作腦出血模型[5]，以10%水合氯醛400 mg/kg于大鼠腹部注射麻醉，固定在立體儀上，在頭部正中進(jìn)行縱行切口，剝離骨膜，使冠狀縫和前囟裸露；在前囟前中線右側(cè)2.0～3.0 mm處鉆直徑>1.0 mm小孔。使用微量注射器抽取股動(dòng)脈50 μl血液，在鉆孔處垂直進(jìn)針6.0 mm左右，注入10 μl血液，2 min后以10 μl/min的速度將剩余的40 μl血液注入，留針10 min后，將針退出，并用消毒針將切口縫合，完成建模。大鼠腦橫斷面中出現(xiàn)明顯血腫，血液無針道反流情況，無蛛網(wǎng)膜下腔出血，無血腫破入腦室視為造模成功。

1.2.3 分組及用藥：將建模成功的大鼠40只以隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組及人參多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組，各10只。人參多糖低劑量組給予2 mg/kg人參多糖，中劑量組4 mg/kg，高劑量組8 mg/kg，均灌胃3周。正常組及模型組大鼠均給予同等體積的無菌生理鹽水灌胃。治療期間所有大鼠均自由飲食。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 大鼠腦出血組織觀察： 大鼠在最后1次給藥后4 h進(jìn)行麻醉斷頭處理，取腦組織放置于4℃冰箱固定48 h，石蠟包埋切片、常規(guī)脫蠟、乙醇浸水，HE染色，光鏡下常規(guī)組織學(xué)檢查。

1.3.2 腦含水量、神經(jīng)缺損評(píng)分及學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分測(cè)定：(1)腦組織含水量：使用干濕質(zhì)量法檢測(cè)，用精確度0.1 mg的電子天平分別測(cè)量5組大鼠的腦組織濕重，放在100℃的恒溫干燥箱烘24 h至腦組織不再減輕為止，然后測(cè)量烘培后大鼠腦組織質(zhì)量。腦組織含水量=(腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量)/腦組織濕重×100%。(2)神經(jīng)功能評(píng)分：使用Longa評(píng)分法[6]，分為0～4級(jí)即為0～4分，無體征為0級(jí)，記0分；大鼠不能完全伸直前肢為1級(jí)，記1分；大鼠一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象為2級(jí)，記2分；大鼠不能打滾或者站立為3級(jí)，記3分；無自發(fā)性活動(dòng)，有意識(shí)障礙為4級(jí)，記4分。分值越高說明大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。(3)學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分：參照彭璇等[7]介紹的方法采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)行動(dòng)態(tài)圖像采集，分析大鼠學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分。大鼠在Morris水迷宮中訓(xùn)練5 d后，在第6天記錄時(shí)間均值作為最終測(cè)定效果。

1.3.3 大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率檢測(cè)： 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，以37 ℃、5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)傳代至5孔板中的細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，使用2 000 r/min的離心機(jī)處理海馬區(qū)細(xì)胞5 min后使用PBS緩沖液清洗2次，在避光常溫環(huán)境中收取離心的海馬區(qū)細(xì)胞，加入PI染液1 ml，放置1 h，然后用特異熒光標(biāo)記后，使用鞘液包裹，在高速流動(dòng)條件下，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀操作說明檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

涂料生產(chǎn)過程中VOCs的產(chǎn)生量取決于溶劑種類、生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)工藝等。一般而言，涂料生產(chǎn)過程中低沸點(diǎn)溶劑的用量越多，涂料生產(chǎn)過程為開放式、生產(chǎn)溫度較高、生產(chǎn)時(shí)間越長(zhǎng)，并且因生產(chǎn)自動(dòng)化程度低而需要頻繁清洗設(shè)備，那么VOCs的產(chǎn)生量就越多。

1.3.4 腦勻漿TNF-α、MDA含量檢測(cè)： 取大鼠血腫周圍的新鮮腦組織200 mg加入PBS緩沖液，離心處理15 min后棄去清液，待測(cè)。使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)TNF-α濃度，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書操作。將采集后的腦組織勻漿使用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，嚴(yán)格按照TBARS試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5 大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白Bcl-2、Akt、PI3K表達(dá)檢測(cè)： 采用Western-blot法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中Bcl-2、Akt、PI3K表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 5組大鼠腦出血組織觀察比較 與正常組比較，模型組出現(xiàn)腦出血組織細(xì)胞間隙增大，神經(jīng)細(xì)胞固縮，膠質(zhì)細(xì)胞增生等變化。與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組腦組織的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等均減輕。與低劑量組、中劑量組比較，高劑量組腦組織排列規(guī)整，間質(zhì)水腫、膠質(zhì)細(xì)胞腫脹等明顯消退，見圖1。

2.2 5組大鼠腦含水量、腦神經(jīng)缺損評(píng)分及學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分比較 模型組大鼠腦含水量、腦神經(jīng)缺損評(píng)分及學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分高于正常組(P均<0.05)，低劑量組、中劑量組、高劑量組低于模型組(P均<0.05)，中劑量組低于低劑量組，高劑量組低于中劑量組(P均<0.05)，見表1。

表1 5組大鼠腦含水量、腦神經(jīng)缺損評(píng)分及學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)分比較

2.3 5組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較 模型組細(xì)胞凋亡率高于正常組(P均<0.05)，低劑量組、中劑量組、高劑量組低于模型組(P均<0.05)；中劑量組低于低劑量組，高劑量組低于中劑量組(P均<0.05)，見表2。

表2 5組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較

圖1 5組大鼠腦出血組織形態(tài)觀察(HE染色，×400)

表3 5組大鼠腦勻漿TNF-α、MDA含量比較

2.5 5組大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K/Akt表達(dá)比較 模型組大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K/Akt表達(dá)均低于正常組(P均<0.05)，低劑量組、中劑量組、高劑量組均高于模型組(P均<0.05)，中劑量組高于低劑量組，高劑量組高于中劑量組(P均<0.05)，見表4。

表4 5組大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K/Akt表達(dá)比較

3 討 論

腦出血屬于一種急性疾病，發(fā)病率、病死率、致殘率均較高，是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病，近年來我國(guó)腦出血的發(fā)病率逐漸升高，發(fā)病年齡也逐漸年輕化[8]。腦出血是重要的腦卒中類型，全世界范圍的發(fā)病人數(shù)每年約有200萬，腦出血占腦卒中的30%左右，病死率極高，即使幸存下來也會(huì)發(fā)生非常嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[9]。腦出血是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡在病理生理過程中極其重要[10]。

人參在中醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用歷史悠久[11]。研究發(fā)現(xiàn)，人參除了根以外，莖、葉、花及果中都含有比例各異、組分不同的生物活性分子[12]。人參中主要有人參皂甙、人參多肽、人參多糖和人參花揮發(fā)油等生物活性物質(zhì)，降解分離可以獲得多種必需的氨基酸、脂肪酸及微量元素等[13]。人參多糖是最早研究的多糖類生物活性成分，主要作用是對(duì)免疫功能的影響及所產(chǎn)生的免疫性抗腫瘤活性[14]，還能增加免疫力、降血糖、促進(jìn)造血、抗衰老、抗菌、抗炎等[15]。

TNF-α可在組織損傷中增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的毒性作用，增加血管內(nèi)皮的通透性，破壞血腦屏障，使血管源性腦水腫加重。TNF-α可以趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞從而導(dǎo)致白細(xì)胞聚集阻塞微血管，導(dǎo)致繼發(fā)性缺血缺氧，從而使腦水腫和繼發(fā)性腦損傷加重[16]?；谌藚⒍嗵蔷哂锌寡?、增強(qiáng)免疫力的藥理作用，在本研究中分析人參多糖對(duì)腦出血大鼠腦勻漿TNF-α含量的影響，結(jié)果顯示，人參多糖干預(yù)后，腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α含量顯著降低，且劑量越高腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α含量越趨近于正常。此結(jié)果說明，人參多糖可通過降低腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α含量，來抵抗大鼠機(jī)體炎性反應(yīng)，增強(qiáng)免疫力，修復(fù)大鼠腦損傷。MDA屬于自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，反映氧自由基含量的指標(biāo)[17]。腦出血患者發(fā)病后血腫周圍存在組織損傷和水腫區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)腦組織會(huì)發(fā)生復(fù)雜的病理變化，對(duì)腦出血患者病情程度及預(yù)后造成了嚴(yán)重影響，在病理因素中，自由基的作用非常重要[18]。腦出血發(fā)生后，大鼠腦組織勻漿中MDA含量顯著增加，其增加實(shí)質(zhì)為自由基所引起的神經(jīng)細(xì)胞過氧化，而人參多糖可增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，降低MDA含量，進(jìn)而減輕腦損傷。本研究結(jié)果顯示，運(yùn)用人參多糖干預(yù)的腦出血大鼠腦勻漿中MDA含量均顯著降低，且劑量越高腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α、MDA含量越趨近于正常，此結(jié)果說明，人參多糖可通過降低自由基所引起的神經(jīng)細(xì)胞過氧化，來抑制MDA表達(dá)，降低腦損傷程度。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生與氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載及興奮性氨基酸毒性等因素引起線粒體的損傷等有關(guān)，通過抗氧自由基、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載等措施來減少細(xì)胞凋亡能起較好的神經(jīng)保護(hù)作用。而人參多糖可降低自由基所引起的神經(jīng)細(xì)胞過氧化。本結(jié)果顯示，人參多糖干預(yù)腦出血模型大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率相對(duì)較低，并隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞凋亡率不斷下降，說明使用人參多糖干預(yù)腦出血模型大鼠對(duì)海馬區(qū)細(xì)胞起到抑制凋亡的作用。PI3K不僅具有脂類激活酶活性，還具有蛋白激酶的活性。腦出血后，機(jī)體釋放一些具有酪氨酸激酶受體激活物質(zhì)，激活PI3K從而磷酸化細(xì)胞膜上的肌醇。Akt屬于PI3K下游的效應(yīng)分子，活化后可通過控制凋亡的方式，促進(jìn)細(xì)胞存活生物效應(yīng)并實(shí)現(xiàn)調(diào)控生長(zhǎng)因子來誘發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。Bcl-2屬于重要的抗凋亡基因。本結(jié)果顯示，人參多糖對(duì)腦出血模型大鼠進(jìn)行干預(yù)后，腦出血模型大鼠Bcl-2、Akt、PI3K表達(dá)量相對(duì)較高，說明人參多糖能夠促進(jìn)海馬區(qū)細(xì)胞的增殖，進(jìn)而修復(fù)腦損傷。

綜上所述，人參多糖治療腦出血，能夠改善大鼠記憶能力，減少腦含水量，抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，降低腦出血后繼發(fā)性損傷，為臨床治療腦出血提供理論依據(jù)。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

鄭希院、翟潔敏：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；李會(huì)琪、趙龍斌：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;高章代：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改