替加環(huán)素、多粘菌素和頭孢哌酮舒巴坦對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌體外抗菌活性的研究*

王康椿 李滿元 余曉騰 刁艷麗

鮑曼不動(dòng)桿菌是一類革蘭氏陰性、氧化酶陰性、專性需氧的條件致病菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，容易引起感染[1]。該菌有多種耐藥基因，如ESBLS、金屬酶、AMPc酶、氨基糖苷修飾酶等，在一定環(huán)境下可以對(duì)抗生素產(chǎn)生多重耐藥，甚至泛耐藥[2]。近年來，隨著抗生素的大量使用，而導(dǎo)致多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌出現(xiàn)也是常見，這給臨床的治療帶來困難，據(jù)金茜等[3]報(bào)道，碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)在全國各醫(yī)院內(nèi)廣泛傳播，并且已經(jīng)給臨床上感染性疾病的治療帶來嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。多粘菌素是通過多粘芽孢桿菌培養(yǎng)液中獲得的一種多肽類抗生素，是臨床上治療多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌常用的藥物，但是該藥物副作用較大，在上世紀(jì)80年代，因其毒性反應(yīng)及新藥的產(chǎn)生幾乎被臨床停用，其毒性作用包括神經(jīng)毒性和腎毒性，因此在用法與用量上應(yīng)注意[4]。替加環(huán)素是一類多肽類的抗生素，是臨床上用于治療多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的感染性疾病新藥物，其對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌仍保持有較高的敏感性[5]。有研究表明頭孢哌酮舒巴坦對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性有上升趨勢(shì)，這與該藥在臨床上應(yīng)用增多有關(guān)系[6]。

本研究的目的旨在觀察用替加環(huán)素、多粘菌素和頭孢哌酮舒巴坦對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌體外抗菌活性情況，為臨床上多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染性疾病的用藥提供指導(dǎo)方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月-2014年6月廣東省第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室，臨床無菌操作收集的各種標(biāo)本做一般致病菌培養(yǎng)加藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)出的細(xì)菌，經(jīng)過菌株分純培養(yǎng)、革蘭染色為陰性的細(xì)菌，用VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀、ATB革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定及藥敏卡做鑒定后的菌株50株。

1.2 抗生素類藥敏紙片 替加環(huán)素（TGC）、批號(hào)：1352109、濃度 15 UG；多粘菌素（PB）、批號(hào)：1326603、濃度：300 UNI；頭孢哌酮舒巴坦（藥物比例為1∶1）（SCF）、批號(hào)：1226100、濃度：105 UG；藥敏紙片均來自英國OXOID公司。

1.3 試劑與儀器 MH水解酪蛋白營養(yǎng)平皿由廣州迪景微生物公司生產(chǎn)、法國梅里埃公司VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀、ATB細(xì)菌鑒定及藥敏卡均由法國梅里埃公司生產(chǎn)、恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱、CO2恒溫培養(yǎng)箱。

1.4 質(zhì)量控制菌株 為大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、綠膿桿菌ATCC27853、鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606，由廣東省臨床檢驗(yàn)中心提供質(zhì)控菌株。

1.5 藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn) 藥敏試驗(yàn)用K-B紙片擴(kuò)散法，按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2007年的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。多粘菌素藥敏紙片的折點(diǎn)為敏感≥19 mm，耐藥≤13 mm（參考CLSI2012非發(fā)酵菌質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)）；參考張冀霞等[5]在中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表的研究替加環(huán)素藥敏紙片的折點(diǎn)為敏感≥14 mm，耐藥≤10 mm；頭孢哌酮舒巴坦藥敏紙片的折點(diǎn)為敏感≥21 mm，耐藥≤15 mm，參考文獻(xiàn)[7]頭孢哌酮舒巴坦藥敏紙片中的舒巴坦量對(duì)藥敏結(jié)果的影響。

1.6 方法 將2013年1月-2014年6月收集后保存在-70 ℃冰箱的50株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌取出后，放在室溫恒溫，然后用無菌鑷子夾起沾有多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的細(xì)菌保存珠，分別在血平板上分區(qū)劃線，分純轉(zhuǎn)種，然后放入37 ℃恒溫箱孵育18 h后，在平板上分離出單個(gè)菌落，用無菌接種環(huán)挑起純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，用3 mL無菌生理鹽水調(diào)成菌懸液，用無菌生理鹽水調(diào)零，用麥?zhǔn)媳葷醿x比濁，將純培養(yǎng)后的菌落調(diào)成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，相?dāng)于細(xì)菌濃度為相當(dāng)于1.5×109/L，然后用無菌棉簽，蘸取少量該菌懸液，在MH營養(yǎng)平板上密涂，最后在該MH平板上相隔一定距離，用無菌鑷子夾起藥敏紙片，貼上替加環(huán)素、多粘菌素、頭孢哌酮舒巴坦藥敏紙片在相應(yīng)位置。按上述方法操作，直至做完50株細(xì)菌為止，并按照不同藥物分成3個(gè)組，分別為替加環(huán)素組、多粘菌素B組、頭孢哌酮舒巴坦組，每組有50株細(xì)菌，然后放置37 ℃恒溫箱孵育18 h后，次日，取出MH培養(yǎng)平板，用專用游碼尺測(cè)量各個(gè)藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，將各個(gè)數(shù)值記錄在相應(yīng)表格上，根據(jù)上述替加環(huán)素藥敏紙片的折點(diǎn)為敏感≥14 mm，耐藥≤10 mm；頭孢哌酮舒巴坦藥敏紙片的折點(diǎn)為敏感≥21 mm，耐藥≤15 mm，多粘菌素B藥敏紙片的折點(diǎn)為敏感≥19 mm，耐藥≤13 mm的標(biāo)準(zhǔn)判斷出各個(gè)菌株的藥敏情況[8]。

2 結(jié)果

將上述培養(yǎng)18 h后藥敏試驗(yàn)的MH營養(yǎng)平皿，放在生物安全柜內(nèi)，經(jīng)過準(zhǔn)確測(cè)量后（測(cè)量用的游標(biāo)尺的誤差在1 mm內(nèi)），將測(cè)量結(jié)果登記在專用細(xì)菌藥敏試驗(yàn)登記表上，然后再將上述測(cè)量結(jié)果錄入電腦統(tǒng)計(jì)，由另外一人進(jìn)行核對(duì)。用每組藥物的上述藥敏折點(diǎn)進(jìn)行判斷，將50株多重耐藥鮑曼桿菌不動(dòng)桿菌分為三類，分別為敏感、中介和耐藥。以敏感≥14 mm，耐藥≤10 mm為折點(diǎn)時(shí)替加環(huán)素對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌保持較高敏感性100%，中介敏感占33%，敏感占67%，在三種藥物中敏感性最高；以敏感≥19 mm，耐藥≤13 mm為折點(diǎn)時(shí)，多粘菌素B中介敏感性為67%，耐藥性為33%，其敏感性僅次于替加環(huán)素，而敏感≥21 mm，耐藥≤15 mm為折點(diǎn)時(shí)對(duì)頭孢哌酮舒巴坦的敏感性為7%，中介敏感性為20%，耐藥性為73%，其耐藥性較高。

3 討論

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌是指對(duì)三類或三類以上的抗生素耐藥（如B內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、碳?xì)涿赶☆?、喹諾酮類、四環(huán)素類等）的鮑曼不動(dòng)桿菌。隨著臨床上抗生素廣泛被使用，加上該細(xì)菌有多種耐藥基因，導(dǎo)致多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌正在逐年上升，給臨床上治療該菌帶來較大挑戰(zhàn)[9]。研究資料表明多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染檢出率占鮑曼不動(dòng)桿菌感染檢出率中的17%，主要發(fā)生在機(jī)體抵抗力較弱的人群，如重癥監(jiān)護(hù)病房、長(zhǎng)期臥床患者、腫瘤患者、糖尿病患者等，該類患者感染前均有長(zhǎng)期住院的經(jīng)歷，大多數(shù)是下呼吸道感染為主[10]。據(jù)秦媛怡等[11]研究報(bào)道對(duì)384例鮑曼不動(dòng)桿菌感染的病例進(jìn)行分析，其主要分布在呼吸內(nèi)科，再次是重癥監(jiān)護(hù)室、神經(jīng)外科等。本研究指明該菌是從醫(yī)院獲得性感染源，且患者在感染前均使用過大劑量的抗生素，特別是對(duì)于用過的碳?xì)涿赶☆?、頭孢菌素類及喹諾酮類藥物的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率較高。本院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)率2013年1月-2014年6月總檢出593株，總檢出率18.27%，其中多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌占17%，以分布在痰液標(biāo)本為主占71.3%，其次為中段尿7.2%、血液4.3%等。其臨床科室分布特征為：主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房（48%）和呼吸科病房（18%）、針灸二區(qū)病房（11%）、心血管科病房（7%）、針灸一區(qū)病房（6%）、其他病區(qū)（12%）。根據(jù)徐一鳴等[12]回顧性分析了2008年-2012年鮑曼不動(dòng)桿菌臨床感染分布及耐藥特征分析，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)12種臨床常用抗菌藥物的耐藥率明顯升高，其中對(duì)碳青酶烯類抗菌藥物耐藥率為逐年上升，對(duì)派拉西林、阿米卡星、慶大霉素、頭孢菌素、等耐藥率總體維持在70%~80%。本研究結(jié)果表明，以敏感≥14 mm，耐藥≤10 mm為折點(diǎn)時(shí)替加環(huán)素對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌保持較高敏感性100%，中介敏感占33%，敏感占67%，在三種藥物中敏感性最高；以敏感≥19 mm，耐藥≤13 mm為折點(diǎn)時(shí)，多粘菌素B中度敏感性為67%，耐藥性為33%，其敏感性僅次于替加環(huán)素，而敏感≥21 mm，耐藥≤15 mm為折點(diǎn)時(shí)對(duì)頭孢哌酮舒巴坦的敏感性為7%，中介敏感為20%，耐藥性為73%，其耐藥性較高。導(dǎo)致頭孢哌酮舒巴坦舒巴坦耐藥性上升的因素包括細(xì)菌自身的基因因素和外在抗生素的廣泛使用，細(xì)菌自身的因素包括該菌有多種耐藥基因，如ESBLS、金屬酶、AMPc酶、氨基糖苷修飾酶等，潘思爭(zhēng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌多種抗生素產(chǎn)生耐藥基因?qū)е屡R床上出現(xiàn)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，甚至泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌導(dǎo)致的感染，治療已經(jīng)是目前臨床上的一大難題，據(jù)Karageorgopoulos等[14]研究碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)在世界范圍內(nèi)擴(kuò)散，引起了緊迫的公共衛(wèi)生問題。因此，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌作為醫(yī)院感染的主要致病菌，由于菌株基因型的差異，并有研究證明這些基因型的差異與細(xì)菌的多重耐藥性有關(guān)系，因此在選用抗菌藥物時(shí)應(yīng)根據(jù)體外藥敏結(jié)果指導(dǎo)用藥，提高用藥療效，減少用藥劑量，減少毒性反應(yīng)，防止或延緩耐藥基因的產(chǎn)生[15]。

通過上述研究證實(shí)替加環(huán)素作為一種較新的抗生素，在對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抗菌活性試驗(yàn)中保持著較高的敏感性，其中介敏感度為33%，高度敏感度為67%，多粘菌素B多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的中介敏感性為67%，也能抑制該菌的生長(zhǎng)。因此，替加環(huán)素和多粘菌素B，可以用作治療多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌引起的各種感染性疾病的抗菌藥物之一。

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