轉化生長因子-β2、胰島素樣生長因子-Ⅰ在豚鼠形覺剝奪性近視眼視網(wǎng)膜的表達及作用

田軍鄭州市第二人民醫(yī)：眼科，河南鄭州450000

轉化生長因子-β2、胰島素樣生長因子-Ⅰ在豚鼠形覺剝奪性近視眼視網(wǎng)膜的表達及作用

田軍
鄭州市第二人民醫(yī)：眼科，河南鄭州450000

目的建立豚鼠形覺剝奪性近視眼模型，研究視網(wǎng)膜轉化生長因子-β2（TGF-β2）mRNA、胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA在形覺剝奪性近視眼的變化及作用。方法出生3 d的實驗用花色豚鼠45只，半透明眼罩遮蓋左眼，右眼為對照眼。遮蓋4周實驗結束時，RT-PCR檢測后極部視網(wǎng)膜中TGF-β2mRNA、IGF-ⅠmRNA的表達水平。結果遮蓋4周后遮蓋眼形成明顯的近視，TGF-β2mRNA在遮蓋眼表達量為（0.437±0.032），對照眼為（0.671±0.048），遮蓋眼表達量較對照眼下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（t=11.653，P＜0.01）；IGF-ⅠmRNA在遮蓋眼表達量為（1.817±0.144），對照眼為（1.536±0.113），遮蓋眼表達量較對照眼升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（t= 7.194，P＜0.01）。結論TGF-β2、IGF-Ⅰ參與豚鼠形覺剝奪性近視形成。

形覺剝奪；近視眼；視網(wǎng)膜；轉化生長因子β2；胰島素樣生長因子-Ⅰ

近視是導致視力下降的首位原因，在發(fā)達國家，病理性近視已成為失明的主要原因［1］。近視已成為全世界的公共衛(wèi)生問題。1999～2004年美國國家營養(yǎng)監(jiān)測和健康調查組的研究結果表明，近視在20～39歲美國人群的發(fā)病率較高，50%以上的大于20歲的美國人受到影響。在美國，男性的近視患病率要比女性低，男性為32.6%，女性為39.9%（P＜0.01）［2］。我國近視眼的患病率急劇增加，在世界上的排名僅次于近視眼第一大國日本。目前我國近視眼的患者已超過3億，我國近視患病率在小學達到10%，中學達到40%，大學達到70%。在新加坡學齡兒童近視的調查中發(fā)現(xiàn)，其近視的發(fā)生率高于中國同齡兒童，7、8、9歲兒童中，近視發(fā)生率分別為47.6%、37.4%、32.5%［3-4］。近視被分為低、中和高度近視，3.00以下為低度近視，-3.00～6.00 D為中度近視，＞6.00 D為高度近視［5］。高度近視又稱病理性近視或變形性近視，因矯正視力不理想，眼軸不斷延長，影響人們學習和工作。高度近視由于后鞏膜葡萄腫可引起視網(wǎng)膜脈絡膜病變，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度逐漸變薄，神經(jīng)纖維層指數(shù)增加，視網(wǎng)膜色素上皮細胞的表面積增加，視網(wǎng)膜色素上皮層變薄，脈絡膜厚度隨眼軸延長而改變［6-7］。通過建立形覺剝奪動物模型，有助于研究其發(fā)病機制，利于防止近視發(fā)生和發(fā)展。近年研究表明形覺剝奪性近視主要是通過局部視網(wǎng)膜機制調控鞏膜重塑的過程，眼球后極部視網(wǎng)膜表達的各種活性細胞因子的水平與形覺剝奪性近視眼的形成有關。本實驗以豚鼠為研究對象，研究轉化生長因子-β2（transforming growth factor-beta 2，TGF-β2）、胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulinlike growth factor-1，IGF-Ⅰ）在形覺剝奪性近視眼視網(wǎng)膜表達的變化規(guī)律，為形覺剝奪性近視的防治提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生3 d的小豚鼠45只（鄭州大學醫(yī)學：動物中心提供），室內標準化飼養(yǎng)，白天用自然光照射，每日光照與黑暗周期比為14∶10，室溫控制在24℃。出生后第3天對豚鼠進行檢影驗光，排除先天性近視及眼部疾病。右眼為自身對照眼，半透明眼罩遮蓋左眼作為形覺剝奪眼。

1.2 方法

1.2.1 屈光度測量、取材分別于出生后第3天、遮蓋4周時在暗室用1%復方托喲卡胺眼液散瞳后帶狀光檢影檢測雙眼屈光度。實驗結束后深麻醉處死動物，取后極部視網(wǎng)膜組織，置于1.5 mL RNase-free的EP管中，保存于-80℃的低溫冰箱內備用。

1.2.2 逆轉錄聚合酶鏈反應Trizol提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度及純度，1%甲醛變性凝膠電泳三條帶顯示清晰，確定RNA無明顯降解。引物由上海生工生物技術公司合成，引物序列：TGF-β2上游5'-TGGCCACCATGCACTACTGTGTCTGAGAAC-3'，下游5'-CAGCTGCATTTACAAGACTTGAC-3'產(chǎn)物1325 bp；IGF-Ⅰ上游5'-ATTAGCACACTCCGATTCAT-3'，下游5'-TGGTCTTGTACTGTGCTAGT-3'，產(chǎn)物356 bp；內參β-actin上游5'-CGTTAGCGTCCATAATCACGTC-3'，下游5'-CCTCAAATAGTCAGCGCAGCA-3'，擴產(chǎn)物219 bp。25μL PCR反應體系如下：10×one step RNA PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（25 μmol/L）5 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）2.5 μL，RNase Freed H2O 10.5 μL，RNase inhibitor（40 U/μL）0.5μL，組織RNA 2 μL，AMV Rtase XL（5 U/μL）0.5 μL，AMV-optimized Taq（5 U/μL）0.5 μL，目的基因上下游特異性引物（20 μmol/L）1 μL（各0.5 μL），β-actin上下游引物（20 μmol/L）1 μL（各0.5 μL）。TGF-β2反應條件：50℃逆轉錄30 min，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，32個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。IGF-Ⅰ反應條件：51℃逆轉錄30 min，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。將電泳后的PCR產(chǎn)物放入圖橡處理系統(tǒng)測量產(chǎn)物光密度值（OD值），記錄每個樣本在同一反應體系中與β-actin OD值的相對比值，進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 遮蓋期間雙眼屈光狀態(tài)變化

出生3 d時，豚鼠遮蓋眼屈光度為（3.37±1.56）D，對照眼（3.41±1.35）D，遮蓋眼與對照眼比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.791，P=0.649）。遮蓋4周后，遮蓋眼屈光度為（-2.32±1.34）D，對照眼（2.16±1.12）D，遮蓋眼與對照眼比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（t=-8.260，P=0.000），遮蓋眼形成明顯的近視。

2.2 RT-PCR分析IGF-Ⅰ和IGF-ⅡmRNA在正常和遮蓋豚鼠眼視網(wǎng)膜的表達

遮蓋4周后，TGF-β2mRNA在遮蓋眼表達量為（0.437±0.032），對照眼為（0.671±0.048），TGF-β2mRNA在遮蓋眼表達量較對照眼明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（t=11.653，P=0.004）。

遮蓋4周后，IGF-ⅠmRNA在遮蓋眼表達量為（1.817±0.144），對照眼為（1.536±0.113），IGF-ⅠmRNA在遮蓋眼表達量較對照眼明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（t=7.194，P=0.001）。

3 討論

形覺剝奪即通過遮蓋、縫合眼瞼或戴凹透鏡等方法，使幼年實驗動物的視網(wǎng)膜成橡模糊，得不到清晰物象的刺激，眼軸逐漸延長即為形覺剝奪性近視。由于眼軸延長，形覺剝奪性近視眼的改變與人的病理性近視眼的改變相似：如視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度逐漸變薄，視網(wǎng)膜色素上皮細胞的表面積增加，視網(wǎng)膜色素上皮層變薄等。形覺剝奪性近視越來越引起人們的關注，逐漸被人們應用于研究人類高度近視的動物模型中。豚鼠近年來被廣泛用于近視眼的研究，其眼球較大，成長較快，性情溫和，易于飼養(yǎng)，且價格低廉，比較適合作為近視動物模型的研究［8-9］。本實驗單眼遮蓋4周，成功誘導出豚鼠剝奪性近視動物模型。

伴隨著近年來對近視眼發(fā)病機理的研究，各種細胞生長因子所起的作用在近視發(fā)病原因中愈來愈受到關注。通過與近視發(fā)病有關的生長因子與視網(wǎng)膜、脈絡膜、鞏膜細胞上的各級受體結合，進行視覺信號的傳遞。大量研究證實視網(wǎng)膜對近視眼發(fā)生的調控與其合成分泌的細胞生長因子［如成纖維細胞生長因子（bFGF）、轉化生長因子β（TGF-β）、胰島素樣生長因子（IGF）］密切相關［10］，這些信號因子共同組成近視眼視網(wǎng)膜神經(jīng)調控網(wǎng)絡。目前認為形覺剝奪性近視的形成主要是通過局部視網(wǎng)膜機制來調節(jié)相鄰鞏膜主動重塑的結果。視網(wǎng)膜的細胞成分比較復雜，包括神經(jīng)節(jié)細胞、光感受器細胞、Muller細胞等，目前還不明確有哪些細胞參與近視的形成過程，生成近視信號因子。本項目研究表明豚鼠視網(wǎng)膜可以檢測到TGF-β2mRNA、IGF-ⅠmRNA表達，遮蓋眼視網(wǎng)膜TGF-β2mRNA表達量較對照眼下降，IGF-ⅠmRNA表達量較對照眼升高，說明TGF-β2、IGF-Ⅰ參與了豚鼠形覺剝奪性近視的發(fā)生過程。

TGF-β是生物體內極為重要的生長因子，其生物學作用可以促進細胞的生長，也可以抑制細胞的生長，但TGF-β抑制生長作用較弱。針對不同的細胞其發(fā)揮的生物學作用也不相同。它可以促進Ⅰ型膠原的翻譯、轉錄，促進平滑肌細胞、成纖維細胞彈性蛋白的合成，上調人成纖維細胞分泌多種蛋白多糖如：整合素、透明質酸、纖維黏連蛋白等［11］。TGF-β在眼部有3種亞型，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，玻璃體、脈絡膜、視網(wǎng)膜均可以檢測到這3種亞型。其中TGF-β2比例最大、活性最強。TGF-β2在眼球局部產(chǎn)生、利用、降解，分布于光感受器外節(jié)和視網(wǎng)膜色素上皮層，在脈絡膜也有輕度表達。體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細胞、脈絡膜黑素細胞均可分泌TGF-β［12］。Seko等［13］發(fā)現(xiàn)在雞FDM眼后極部視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜色素上皮、脈絡膜、鞏膜TGF-β2含量增加明顯。Jobling等［14］研究發(fā)現(xiàn)在近視發(fā)生過程中TGF-β通過改變鞏膜細胞的表型，使鞏膜產(chǎn)生較強的收縮性，降低TGF-β的表達，導致樹鼠鞏膜外基質發(fā)生改變，鞏膜重塑，近視發(fā)生。閆磐石等［15］用RT-PCR和免疫組化的方法在豚鼠近視模型中發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜TGF-β2含量下降，TGF-β2被發(fā)現(xiàn)主要表達于視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)和色素上皮層，形覺剝奪2周視網(wǎng)膜TGF-β2的表達含量較對照眼降低顯著。我們實驗表明形覺剝奪降低視網(wǎng)膜TGF-β2的活性，這與閆磐石的研究結果一致。TGF-β有促進細胞外基質合成的作用，TGF-β通過抑制蛋白酶水解酶的合成，抑制基質的降解，促進蛋白酶抑制劑的分泌，增加細胞外基質沉積，促進纖維細胞或鞏膜細胞的增殖［11］。

IGF-Ⅰ是一類多功能細胞增殖調控因子。在細胞的分化、增殖、個體的生長發(fā)育中具有重要的促進作用。IGF-Ⅰ與IGF-Ⅱ具有相似的結構和體外活性，但體內的生物學效應不盡相同。IGF的生物學功能不只局限于有絲分裂刺激作用，它們也能誘導分化或促進分化功能的表達。其精確的生物學效應取決于細胞發(fā)育的狀態(tài)及其他激素或生長因子的存在。尤其是在不同的組織，不同生長發(fā)育期，IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的作用及水平有相當?shù)牟町?。IGF-Ⅰ依賴于GH，可促進體外培養(yǎng)的多種細胞增殖，促進蛋白質和DNA合成。機體許多組織細胞均能自分泌和旁分泌IGF-Ⅰ。Fisher等［16］發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ及其受體廣泛分布于雞視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層、視網(wǎng)膜色素上皮層、脈絡膜、睫狀體、晶狀體赤道部，IGF-Ⅰ可以刺激視網(wǎng)膜Muller細胞的活性，提高其p38、MAPK、cFos的表達。一定劑量的IGF-Ⅰ聯(lián)合bFGF玻璃體腔注射可以引起小雞玻璃體腔擴大，眼軸增長，但是單獨注射卻IGF-1卻不能引起眼軸增長［17］。國內學者研究發(fā)現(xiàn)豚鼠剝奪性近視眼后極部視網(wǎng)膜IGF1R的表達水平升高，去遮蓋后，IGF1R在后極部視網(wǎng)膜的表達水平下降，豚鼠眼軸增長減慢，近視屈光度減低［18］，也提示IGF-Ⅰ通過IGF1R參與視網(wǎng)膜近視信號轉導。近年研究發(fā)現(xiàn)兒童血清IGFBP3濃度與身高、體重、年齡、角膜屈光力、眼軸長度、屈光度的相關性無顯著性差異，但血清IGF-Ⅰ濃度與兒童角膜屈光力相關性雖無顯著差異，但與眼軸長度呈正相關，因此認為血清IGF-Ⅰ濃度與眼軸增長有關。在近視程度不同的兒童，其血清IGF-Ⅰ濃度也不一樣，而且近視程度越高，血清IGF-Ⅰ濃度越高，充分說明IGF-Ⅰ在近視發(fā)生發(fā)展中有重要作用［19］。

形覺剝奪破壞了視網(wǎng)膜色素上皮和脈絡膜屏障，導致視網(wǎng)膜上調鞏膜生長的信息分子輕易通過而使鞏膜過度生長［20］。推測剝奪性近視視網(wǎng)膜分泌的TGF-β2、IGF-1可能是通過此方式作用于鞏膜細胞，直接減少膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、纖維連接蛋白、蛋白多糖等細胞外基質成分的合成，減少纖溶酶原激活物抑制劑PAⅠ-1和基質金屬蛋白酶組織抑制劑TIMPs的產(chǎn)生，使纖溶酶和基質金屬蛋白酶合成增加，細胞外基質過度降解，鞏膜變薄，眼球擴張，形成近視。

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Effect of TGF-β2and IGF-Ⅰin retina of form deprivation myopia in guinea pig

TIAN Jun
Department of Ophthalmology,the Second People's Hospital of Zhengzhou City,He'nan Province,Zhengzhou450000, China

ObjectiveTo explore the effects of retinal transforming growth factor-beta 2(TGF-β2)and insulin-like growth factor-1(IGF-Ⅰ)in form-deprivation myopia guinea pig model.Methods45 three-day-old guinea pigs were selectedall left eyes were coverred with transplant goggles,and the right eyes were control eyes with no goggles.Refractive status was measured by strip light retinascopy at before experiment and after 4 weeks.Total RNA in the posterior retina was extracted at the end of 4 weeks,the expression levels of TGF-β2mRNA and IGF-ⅠmRNA were measured by PCR.ResultsForm-deprivation eyes were significantly more myopia than control eyes,.the expression level of TGF-β2mRNA in form-deprivation eyes was(0.437±0.032),that in control eyes was(0.671±0.048),two groups were compared,the difference was statistically significant(t=11.653,P＜0.01).The expression level of IGF-ⅠmRNA in form-deprivation eyes was(1.817±0.144),that in control eyes was(1.536±0.113),two groups were compared,the difference was statistically significant(t=7.194,P＜0.01).ConclusionTGF-β2and IGF-Ⅰparticipate in the development of form deprived myopia in guinea pig.

Form deprivation;myopia;Retinal;Transforming growth factor-beta 2;Insulin-like growth factor-1

R778.11

A

1673-7210（2015）07（a）-0030-04

2015-03-09本文編輯：蘇暢）