蟒蛇肉酶解肽電噴霧多級(jí)質(zhì)譜法分析

高 穎，高曉晨，李晶峰，郭曉慶，張 輝，孫佳明

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春130117)

蟒蛇，又名蟒，王蛇，蚺蛇，南蛇，埋頭蛇，王字蛇，琴蛇，梅花蛇［1］，是當(dāng)今世界上最原始的優(yōu)質(zhì)蛇種之一。蟒蛇肉在《名醫(yī)別錄》就有記載，其味甘，性溫，有小毒。除手足風(fēng)痛，殺三蟲，去死肌，皮膚風(fēng)毒癘風(fēng)，疥辟惡瘡。具有祛風(fēng)活絡(luò)，殺蟲止癢的功效，可用于風(fēng)痹，癱瘓，癘風(fēng)，疥廨，惡瘡 。在我國，蟒蛇主產(chǎn)于福建、廣東、海南、廣西、貴州、云南。近年來，蟒蛇的生存環(huán)境遭到破壞以及蟒蛇皮的市場(chǎng)需求加大致使蟒蛇的數(shù)量急劇下降，同時(shí)也刺激了蟒蛇的人工養(yǎng)殖。

生物活性肽(bioactive peptides)具有特殊的生物活性和生理功能，它一般是由3～20個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽類物質(zhì)，通常情況下，其分子量在1萬Da以下。它由氨基酸組成，但其具有氨基酸所不能比擬的功效，生物活性肽源于蛋白質(zhì)，但更易被人體吸收和利用，甚至?xí)霈F(xiàn)原蛋白質(zhì)所不具備的新功能［2-3］。本文運(yùn)用現(xiàn)代電噴霧多級(jí)質(zhì)譜法對(duì)蟒蛇肉酶解肽進(jìn)行了分析研究，解析其中酶解肽的氨基酸序列。

1 材料與儀器

1.1 材料 蟒蛇肉酶解肽由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心自制。

1.2 儀器 Agilent 6350 ESI-MS(美國 Agilent公司);GL-20G-Ⅱ型低溫超速離心機(jī);FD-1000真空冷凍干燥機(jī);UV-Visible Spectrophotometer;BP211D型十萬分之一電子天平 (北京賽多利斯天平有限公司)。

1.3 試劑 所用試劑均為色譜純。

2 方法

2.1 樣品制備 稱取1g蟒蛇肉酶解肽凍干粉，用10%MeOH定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，濾過，即得。

2.2 質(zhì)譜條件［4］電離源:電噴霧離子源(ESI);檢測(cè)方式:正離子檢測(cè);掃描范圍:m/z 50～500;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流量:10 mL/min;霧化氣壓強(qiáng):0.24 MPa(35.0 psi);毛細(xì)管電壓:4 kV。

2.3 樣品分析 采用蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣到離子源，利用質(zhì)譜工作站所能提供的離子信息，對(duì)樣品主要成分進(jìn)行序列解析。從一級(jí)質(zhì)譜圖中，主要對(duì)m/z303、374的［M+H］+準(zhǔn)離子峰進(jìn)行分析，解析其主要寡肽類成分的氨基酸序列。

3 結(jié)果

3.1 m/z303離子的序列解析 一級(jí)質(zhì)譜中m/z為303的［M+H］+離子峰，說明其分子量為302，氨基酸的平均分子量為128，根據(jù)氮律分子應(yīng)含奇數(shù)個(gè)氮，推斷其可能為三肽化合物。在碰撞誘導(dǎo)解離過程中，m/z 303離子失去一分子水(18 Da)生成m/z 285離子;m/z 303離子失去一分子丙氨酸(89 Da)生成m/z 214離子;m/z 303離子失去一分子丙氨酸(89 Da)和一分子脫水纈氨酸(117 Da)生成m/z 115離子，m/z 115為天冬酰胺脫去氨基而生成的離子。結(jié)合肽類裂解規(guī)律的文獻(xiàn)報(bào)道［5-7］，推知m/z為303的離子是由丙氨酸、纈氨酸和天冬酰胺三個(gè)氨基酸依次脫水形成酰胺鍵后生成的三肽，其氨基酸序列為AVN，結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 m/z 303離子結(jié)構(gòu)式

3.2 m/z374離子的序列解析 一級(jí)質(zhì)譜中m/z為374的［M+H］+離子峰，說明其分子量為373，氨基酸的平均分子量為128，根據(jù)氮律分子應(yīng)含偶數(shù)個(gè)氮，推斷m/z 374離子可能為四肽化合物。在碰撞誘導(dǎo)解離過程中，m/z374離子失去一分子水(18 Da)生成m/z 356離子;m/z 374離子失去一分子丙氨酸(89 Da)生成m/z 285離子;m/z 374離子失去一分子丙氨酸(89 Da)和一分子脫水丙氨酸(89 Da)生成m/z 214離子;m/z 374離子失去一分子丙氨酸(89 Da)、一分子脫水丙氨酸(89 Da)和一分子脫水纈氨酸(117 Da)生成m/z 115離子;m/z 115為天冬酰胺脫去氨基而生成的離子。結(jié)合肽類裂解規(guī)律，推斷m/z 374離子是由兩個(gè)丙氨酸、一個(gè)纈氨酸和一個(gè)天冬酰胺4個(gè)氨基酸依次脫水形成酰胺鍵后生成的四肽，故m/z374離子的氨基酸序列為AAVN，結(jié)構(gòu)式如圖2。

圖2 m/z 374離子結(jié)構(gòu)式

4 討論

生物活性肽具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、抗血栓、降低膽固醇、抑菌、抗病毒、抗腫瘤作用等，是篩選藥物的天然資源寶庫。研究發(fā)現(xiàn)蟒蛇肉酶解肽具有較好的抗氧化能力［8］，本文首次利用ESI-MSn對(duì)蟒蛇肉酶解肽進(jìn)行了分析研究，從中解析出兩個(gè)具有代表性的酶解肽的氨基酸序列，為蟒蛇進(jìn)一步合理開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典(下)［M〗.上海:上海人民出版社，2004:2989-2991.

［2］王竹青，李八方.生物活性肽及其研究進(jìn)展［J〗.中國海洋藥物雜志，2010，29(2):60-68.

［3］韋緒芹，張建華，占文婷，等.海洋生物源抗氧化活性肽的制備和構(gòu)效關(guān)系［J〗.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(25):15-20.

［4］宗穎，孫佳明，袁賢達(dá)，等.蝮蛇抗氧化酶解活性肽的ESIMSn 分析研究［J〗.吉林中醫(yī)藥，2012，32(10):1040-1041.

［5］陳晶，付華，陳益，等.質(zhì)譜在肽和蛋白質(zhì)序列分析中的應(yīng)用［J〗.有機(jī)化學(xué)，2002，22(2):81-90.

［6］馮曉梅，韓玉謙，趙志強(qiáng)，等.牡蠣酶解產(chǎn)物中多肽的分離純化及其結(jié)構(gòu)研究［J〗.中國海洋藥物雜志，2009，28(2):1-5.

［7］李蕾，俞蘭，胡家，等.生物活性肽蛋白質(zhì)組分分離與鑒定方法的建立［J〗.生物技術(shù)通訊，2014，25(5):682-686.

［8］高穎，孫佳明，張輝.蟒蛇活性肽抗氧化作用的研究［J〗.吉林中醫(yī)藥，2012，32(11):1138-1139.