南方紅豆杉組培快繁技術研究進展

張文泉，鄧 潔

(凱里學院，貴州 凱里 556011)

南方紅豆杉(Taxus chinensis var.mairei)屬紅豆杉科(Taxaceae S.F.Gery)紅豆杉屬(Taxus Linn.)植物，又名美麗紅豆杉，為國家一級重點保護野生植物，多分布于分布于長江流域及陜西、甘肅等地。其木材紅色，材質細密，為珍貴的紅木樹種；其樹形優(yōu)美，四季常青，果實紅色，觀賞價值極高；尤其是南方紅豆杉內含紫杉醇(Paclitaxe)為特效抗腫瘤藥物，對于乳腺癌、前列腺癌等非小細胞性腫瘤及類風濕性關節(jié)炎的治療具有顯著療效[1-6]。南方紅豆杉體內紫杉醇含量遠高于東北紅豆杉，最高可達0.02%以上[2]，具有極高的開發(fā)利用價值。由于市場需求量巨大，野生南方紅豆杉植物資源極其匱乏，遠難以滿足市場要求。因此大力發(fā)展南方紅豆杉產(chǎn)業(yè)可解決生產(chǎn)紫杉醇原料缺乏問題，更進一步有效保護南方紅豆杉野生資源具有重大意義。

目前有關南方紅豆杉的研究主要集中于對其種植技術、紫杉醇的化學提取合成和化學修飾和基因工程等方面。對于南方紅豆杉組織培養(yǎng)的研究始于20世紀90年代，多集中于愈傷組織誘導和細胞培養(yǎng)。迄今已有大量文獻報道[1-22]，主要包括兩個層面：一是利用微繁技術大量生產(chǎn)組培苗以用于人工栽培造林；二是通過愈傷組織誘導及細胞懸浮培養(yǎng)，從中直接提取紫杉醇，用于藥物生產(chǎn)。本文對南方紅豆杉組織培養(yǎng)進行綜述，旨在為南方紅豆杉資源的進一步研究、開發(fā)利用提供參考。

1 外植體

因南方紅豆杉為裸子植物，又屬木本，因而愈傷組織誘導難度較大。我國對于南方紅豆杉組織培養(yǎng)技術的研究開始于20世紀90年代，張宗勤等以南方紅豆杉枝條為外植體，成功誘導南方紅豆杉的愈傷組織[1]。迄今，據(jù)報道，南方紅豆杉組織培養(yǎng)的研究主要集中在愈傷組織誘導及細胞懸浮培養(yǎng)，因為從懸浮培養(yǎng)系中可大量提取南方紅豆杉的活性物質紫杉醇。外植體較多使用莖段與枝條，也常見采用使用芽、葉和成熟種子胚適宜的外植體有莖段、枝條芽、葉和成熟種子胚，但以莖段、芽為主[2-9]。蘇應娟[3]、楊禮香等[7]在南方紅豆杉愈傷組織的誘導和培養(yǎng)中采用芽與莖段為外植體，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，同等條件下芽的愈傷誘導率高于莖段，愈傷組織出愈時間早于莖段，且生長速率快、污染率低，莖段愈傷誘導率可達到100%。邱德有[9]等采用南方紅豆杉成熟種子胚，誘導得到胚性愈傷組織，并成功獲得體細胞胚。

無菌外植體的獲得多采用消毒滅菌相結合的方式，采集回的外植體流水沖洗后，通常采用75%乙醇和0.1%～0.3%升汞或次氯酸鈉配合使用，75%乙醇消毒時間控制在30 s左右，滅菌時間3～15 min不等，消毒滅菌其時間長短及所有消毒液的濃度視外植體情況而定，如莖段等外植體污染較嚴重，成熟度較高，采用毒性較大升汞為消毒劑，濃度可較高，消毒時間可適當延長，而葉片和莖段等幼嫩而且污染率相對較低的外植體時用毒性小的次氯酸鈉等較為適宜，消毒時間消毒液濃度均可適當降低等[1-9]。

綜上所述，莖段因取材方便、外植體來源廣泛、細胞分化能力較強等特點成為南方紅豆杉誘導愈傷組織最常用外植體。

2 培養(yǎng)條件

2.1 基本培養(yǎng)基

南方紅豆杉組織培養(yǎng)過程中，基本培養(yǎng)基的類型起至關重要，南方紅豆杉愈傷組織誘導最常用MS、B5兩種基本培養(yǎng)基[1-3,5-6,8-10]。張宗勤等[1]以改良MS（增加硝態(tài)氮的含量，降低銨態(tài)氮的含量）為基本培養(yǎng)基誘導的得到的愈傷組織生長情況優(yōu)良，體積較大，呈顆粒狀，質地疏松、不易褐化。陳永勤等[2]通過改良B5培養(yǎng)基，提高有機物質中VB3濃度提高至1.25 mg/L，并添加1.0 mg/L的VB1，可提高愈傷組織誘導率至100%，且可提高愈傷組織的分化率，邱德有等[9]利用改良B5培養(yǎng)基成功誘導出南方紅豆杉的胚性愈傷組織愈傷組織。章國瑛等[5]報道，在黑暗條件下誘導愈傷組織，B5培養(yǎng)基愈傷組織誘導率高于基本MS培養(yǎng)基。蘇應娟等[3]報道，在愈傷組織的階段，B5培養(yǎng)基更適合愈傷組織增殖生長。體現(xiàn)出南方紅豆杉組織培養(yǎng)各個階段對營養(yǎng)物質的要求不盡相同，在愈傷組織誘導及培養(yǎng)過程中，對MS、B5培養(yǎng)基進行改良后，效果較好。

2.2 激素

植物生長調節(jié)劑是植物組織培養(yǎng)能否成功的關鍵所在，不同激素種類的組合與不同濃度和配比顯著影響植物組織培養(yǎng)過程中細胞分裂與發(fā)育。南方紅豆杉組織培養(yǎng)過程中，生長素常用2.4-D與NAA，細胞分裂素常用6-BA、KT。將兩類激素配合使用，充分體現(xiàn)出激素組合的優(yōu)勢[10-16]。不同的培養(yǎng)階段及不同的外植體所采用的激素組合及激素濃度不盡相同。在南方紅豆杉愈傷組織誘導階段，生長素濃度與分裂素濃度比例通常大于10∶1。章國瑛等[5]報道：采用改良B5+3.0 mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA，用莖段作外植體誘導愈傷組織，愈傷組織誘導率達100%。張宗勤等[1]采用NAA可以替代2.4-D，同樣可誘導得到質量較高的愈傷組織，可規(guī)避2.4-D本身具有致癌活性而影響組織培養(yǎng)獲得南方紅豆杉中紫杉醇的藥用風險。楊禮香等[7]報道：采用改良MS+2.0 mg/L 2.4-D+0.5 mg/L NAA，用莖段作外植體誘導愈傷組織，愈傷組織誘導率高達100%，而且出愈快，第5 d即形成愈傷組織，愈傷組織增殖過程中采用改良MS+0.5 mg/L 2.4-D,1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT愈傷組織的生長率達到7.74 g/L，以幼嫩的芽作為外植體時，只需添加適宜濃度的2.4-D與NAA即使未加入任何細胞分裂素也可使愈傷組織誘導率高達100%。蘇應娟等[3]研究表明分裂素高濃度的KT，GA3對南方紅豆杉愈傷組織的誘導與生長均存在抑制作但采用低濃度的KT會明顯的改善愈傷組織的質地，使其結構變得疏松，呈顆粒狀，低濃度的GA3可緩解南方紅豆杉愈傷組織的褐化現(xiàn)象，這是因為GA3能抑制POD和PPO的活性,從而降低褐化率。

2.3 其他

2.3.1 碳源。在植物組織培養(yǎng)過程中，大多使用蔗糖為碳源，不例外，在南方紅豆杉組織培養(yǎng)中，通常采3%的蔗糖作為碳源。趙芳等報道[6]：在以嫩枝為外植體，MS為基本培養(yǎng)基采用最佳植物激素濃度組合條件下，分別添加3%的蔗糖、果糖和葡萄糖，最終統(tǒng)計愈傷組織誘導率及生長量得出：蔗糖作為碳源優(yōu)于果糖和葡萄糖。由此得出：南方紅豆杉組織培養(yǎng)中最適碳源為蔗糖。

2.3.2 光照條件。通常條件下，暗培養(yǎng)有利于植物愈傷組織的誘導，同樣，諸多的研究報道表明：在南方紅豆杉愈傷組織的誘導過程中，暗培養(yǎng)更有利于愈傷組織的誘導[3,5,9,10,17-19]，但在南方紅豆杉愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)中，光照反而有利于愈傷組織增殖。趙芳等[6]在暗培養(yǎng)及不同光照條件下對愈傷組織生長量進行了比較，當光照強度為1000～1200 lx，光照時間為12 h/d條件下不但促進愈傷組織的生長，而且減輕愈傷組織的褐化。

2.3.3 小分子物質。植物組織培養(yǎng)過程中，添加一些小分子物質或天然營養(yǎng)物質，有利于組培過程的順利進行[17,20-21]，如在培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸、乙酸鈉、椰乳、香蕉汁等，盛長忠等[10]發(fā)現(xiàn)：在B5基本培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸和乙酸鈉這兩種小分子物質，以葉片為外植體誘導愈傷組織，雖然對愈傷組織誘導及生長影響不顯著，但對愈傷組織中紫杉醇的含量顯著提高，甚至可達到對照組的3倍以上。陳惠等[11]研究表明，在培養(yǎng)基中添加根皮苷這一物質也有利于南方紅豆杉愈傷組織誘導及生長。

3 問題與展望

迄今為止，南方紅豆杉組織培養(yǎng)獲得了較大進展，愈傷組織誘導率較高，微繁及細胞培養(yǎng)技術基本成熟，基本建立了以腋芽增殖方式構建的再生體系[6,20-24]，但通過愈傷組織分化構建植株再生體系的途徑由于愈傷組織分化率較低還有待進一步研究。

目前，南方紅豆杉組織培養(yǎng)急需解決的關鍵問題是愈傷組織的褐化及完整的植株再生體系的建立。由于在愈傷誘導時外植體中的多酚氧化酶被激活導致細胞代謝發(fā)生一系列變化，出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，與諸多木本植物一樣南方紅豆杉愈傷組織在培養(yǎng)過程中極易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，愈傷組織出現(xiàn)褐化后會導致細胞活力降低、增殖生長緩慢直至死亡，因此褐化現(xiàn)象成為了限制南方紅豆杉組織培養(yǎng)的瓶頸所在，采用哪些技術減輕和控制南方紅豆杉組培過程中的愈傷組織的褐化問題成為關鍵所在。目前常采用的技術有：選用較為幼嫩的外植體，適宜的培養(yǎng)基及激素組合，在培養(yǎng)基中加入活性炭、抗壞血酸等均對愈傷組織的褐化能起到一定的抑制作用[23，25]。但活性炭屬于酚類吸收劑，在吸收組培過程中所產(chǎn)生酚類物質的同時也吸附培養(yǎng)基中所含的有限的無機鹽和植物激素，導致培養(yǎng)基中能供愈傷組織生長的營養(yǎng)物質減少，愈傷組織的生長緩慢；抗壞血酸屬于還原劑，也會影響愈傷組織生長。因此，如何保證南方紅豆杉愈傷組織正常生長的同時盡量降低愈傷組織的褐化，是后續(xù)南方紅豆杉組織培養(yǎng)中急需解決的關鍵問題。

通過植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)組培苗不受時間、地域、氣候、土壤等因素的影響，可實現(xiàn)大批量的苗木生產(chǎn)，實現(xiàn)工廠化育苗，還可以通過微莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗[26]，對珍稀瀕危植物保護具有重大意義。南方紅豆杉屬于國家一級重點保護野生植物，目前由于對紫杉醇的需求日益增加，對原生南方紅豆杉而破壞加劇，雖然通過組培途徑誘導愈傷組織后進行細胞培養(yǎng)可大量獲得紫杉醇，但遠滿足不了需求，因此如果能通過組培途徑生產(chǎn)大量苗木，為后續(xù)持續(xù)提取紫杉醇開辟了更廣闊的渠道。然而，據(jù)目前的研究報道，對南方紅豆杉組織培養(yǎng)的研究多處于愈傷組織誘導和增殖階段，尚未實現(xiàn)真正意義上的完整的植株再生。但有報道東北紅豆杉、云南紅豆杉、歐洲紅豆杉通過愈傷誘導途徑獲得完整再生植株的報道[11,26]?？煞窠梃b其技術方法對南方紅豆杉愈傷組織誘導及植株再生進行研究構建完整的植株再生體系，是后續(xù)南方紅豆杉組織培養(yǎng)的研究重點之一。