黃芪山甲方抗腎間質纖維化的多靶點抑制作用

蔡宏瑜+楊光輝+萬強+張娟+傅志慧+高艷霞

[摘要]目的 動態(tài)觀察黃芪山甲方（HQSJ）對大鼠腎間質纖維化（RIF）多靶點的治療作用，探討HQSJ方在不同階段的可能作用機制。 方法 實驗采用UUO大鼠模型，將雄性SD大鼠54只隨機分成3組：假手術組（Sham）、模型組（UUO）、治療組（HQSJ）。術后14、28、56d分別處死6只大鼠，觀察腎功能變化；對腎小管基底膜（TBM）、腎小管萎縮、炎細胞浸潤及間質纖維化情況進行半定量評分；采用免疫組織化學法及RTPCR法檢測腎組織TGF-β1、FN蛋白及mRNA的表達。結果 （1）腎功能方面：與Sham組比較，UUO及HQSJ組大鼠BUN、SCr值在14～28d進行性升高，在28～56d相對穩(wěn)定。HQSJ組大鼠BUN、SCr值在同一時相均較UUO組低（P<0.05）。（2）病理改變方面：與Sham組比較，UUO及HQSJ組大鼠炎細胞浸潤與腎間質慢性病變程度均有增高趨勢，同一時相比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。UUO與HQSJ組比較，炎細胞浸潤程度在14、28d有統(tǒng)計學意義（P<0.05），56d無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；腎間質慢性病變程度14、28、56d均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（3）TGF-β1、FN表達：與Sham組比較，UUO及HQSJ組TGF-β1、FN表達均增高，在同一時相比較均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與UUO組比較，HQSJ組TGF-β1、FN在14、28、56d的表達均不同程度下降（P<0.05）；同一時相下降幅度比較：免疫組化示TGF-β1、FN蛋白陽性率分別下降64%、47%、7%及82%、72%、70%；RT-PCR法檢測TGF-β1、FN的mRNA分別下降72%、57%、27%及83%、72%、68%。 結論 HQSJ方抗腎間質纖維化的多靶點作用，可能與減少炎性細胞、抑制TGF-β1分泌，減輕腎臟固有細胞的活化及轉分化，從而減少細胞外基質的沉積有關。其作用從病變早期開始，在14～28d主要是減少炎性細胞浸潤和降低TGF-β1表達，對FN的抑制作用貫穿始終。

[關鍵詞]黃芪山甲方；腎間質纖維化；TGF-β1；FN

[中圖分類號]R277.5 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2014）20-07-07

Multi-target inhibition of Huangqishanjia （HQSJ） on renal interstitial fibrosis（RIF）

CAI Hongyu YANG Guanghui WAN Qiang ZHANG Juan FU Zhihui GAO Yanxia

Department of Nephropathy， Shanxi Province Chinese Medicine Hospital， Taiyuan 030012， China

[Abstract]Objective To observe the multi-target therapeutic effect of HQSJ for RIF of mice and discuss possible action mechanism of HQSJ in different stages. Methods UUO mice mode was adopted and 54 male SD mice were randomly divided into 3 groups as fake operation group （Sham）， model group （UUO） and treatment group （HQSJ）. 6 mice were killed separately on 14d， 28d and 56d after operation and their kidney function changes were observed； TBM， renal tubular atrophy， inflammatory cell infiltration and RIF were given semi-quantitative scores； TGF-β1， FN protein and mRNA expressions of renal tissues were detected by immunohistochemical method and RT-PCR method. Results （1） On kidney function， compared with Sham group， BUN and SCr values of UUO and HQSJ group were developed during 14-28d and stayed relatively steady during 28-56d. BUN and SCr values of HQSJ group were both lower than UUO group in the same time phase （P<0.05）. （2） On pathological chages， compared with Sham group， inflammatory cell infiltration and renal interstitial chronic lesion degrees of mice of UUO and HQSJ group both had a increasing trend in the same time phase （P<0.05）. There were significant differences between inflammatory cell infiltration of UUO group and HQSJ group on 14 and 28d （P<0.05） but no significant difference on 56d （P>0.05）； there were significant differences on renal interstitial chronic lesion degrees on 14， 28 and 56d （P<0.05）. （3） On TGF-β1， FN expressions： compared with Sham group， TGF-β1 and FN expressions of UUO and HQSJ group both rose in the same time phase （P<0.05）； compared with UUO group， TGF-β1 and FN expressions on 14， 28 and 56d of HQSJ group all declined to different extents （P<0.05）； decline degree of the same time phase comparison； immunohistochemicalendprint

method showed that positive rates of TGF-β1 and FN protein declined separately by 64%， 47%， 7% and 82%， 72%， 70%； RT-PCR method showed that mRNA of TGF-β1 and FN declined separately by 72%， 57%， 27%% and 83%， 72%， 68%. Conclusion Multi-target therapeutic effect of HQSJ for RIF may related with decrease of ECM deposition caused by decrease of inflammatory cells， inhibition of TGF-β1 secretion， alleviation of excitation and transdifferentiation of renal inherent cells. Its action started from early lesion， mainly reducing inflammatory cell infiltration and decreasing TGF-β1 expression， and inhibition to FN throughout the whole process.

[Key words]Huangqishanjia； Renal interstitial fibrosis； TGF-β1； FN

RIF是各種原因造成的腎小管間質病變的最終結果，是導致慢性腎功能衰竭的主要因素之一，其特征是正常腎小管和腎間質結構被大量聚集的細胞外基質所代替[1]。中藥因其成分及配伍的多樣性在防治腎間質纖維化領域中突顯了中醫(yī)特色及優(yōu)勢。本研究應用UUO致RIF大鼠模型，并以HQSJ方進行干預治療，通過觀察HQSJ方對UUO大鼠的腎功能、腎臟病理形態(tài)學、TGF-β1、FN表達的影響，探討其抗腎間質纖維化的多靶點作用機制，并通過動態(tài)觀察，了解HQSJ方何時開始起效以及在疾病不同發(fā)展階段的動態(tài)作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇健康雄性Wistar大鼠54只，平均體重為（255.0±12.1）g，由山西省中醫(yī)藥動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑 HQSJ方由山西省中醫(yī)院中藥房提供。TGF-β1、FN、抗體及原位雜交試劑由武漢博士德生物有限公司提供。Trizol試劑購于上海生工生物科技有限公司，采用Fermentas公司的K1622逆轉錄（RT）試劑盒和Roche公司的熒光定量試劑盒，抗TGF-β1、FN抗體由美國SANTA CRUZ公司提供。

1.2 方法

動物模型制備及分組：將54只大鼠隨機分為3組：Sham組、UUO組、HQSJ組。其中UUO組、HQSJ組行單側輸尿管梗阻致RIF模型：3.5%水合氯醛以1mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，取右側臥位，背部左肋下備皮，常規(guī)消毒后沿腋后線從左肋下向尾部方向切開皮膚，鈍性分離皮下組織及肌層，打開腹腔，分離左側輸尿管并行雙線結扎，然后剪斷輸尿管，逐層縫合。Sham組打開腹腔后即縫合。術后各組肌肉注射青霉素以預防感染。Sham組、UUO組于術前3d開始每天2mL蒸餾水灌胃給藥；HQSJ組于術前3d開始每天中藥湯劑灌胃給藥；中藥用藥量均相當于成人每日每公斤體重的15倍。術后各時段麻醉后腹主動脈取血，送檢化驗室化驗。取血后處死大鼠，剖取梗阻左腎，分別留取光鏡、免疫標本送檢病理室。

1.3 檢測項目

1.3.1 腎功能 全自動生化分析儀檢測血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。

1.3.2 病理改變 200倍光鏡下，每張切片隨機選擇5個視野，腎間質慢性病變（CC）有3個參數(shù)判定TBM增厚、腎小管萎縮、間質纖維化，每個參數(shù)按0～3分評定（0=正常，1=輕度損傷，2=中度損傷，3=重度損傷），每個樣本小管間質的評分為0～9分。腎間質炎細胞浸潤（CIS）情況評分：無（0分）、局灶細胞浸潤（1分）、多灶細胞浸潤（2分）、彌漫細胞浸潤（3分）。

1.3.3 免疫組織化學測定TGF-β1、FN蛋白陽性面積 隨機選取5個不重疊的視野，在200倍光鏡下應用免疫組化染色測量每個視野內陽性染色面積占整個視野面積的百分比作半定量分析測定值。1.3.4 RT-PCR檢測TGF-β1、FN的mRNA的表達 Trizol試劑提取腎組織總RNA，逆轉錄生成CDNA，以CDNA為模板在TAQDNA聚合酶催化下進行PCR擴增，PCR反應條件：94℃預變性10min，活化Tag酶，94℃ 15s，60℃ 60s，45個循環(huán)結束。熒光定量PCR讀取CT （cycle threshold）值，按文獻[2]方法計算目的基因的2-ΔΔCT值，表示實驗組測定基因的表達相對與正常對照組樣本表達的變化倍數(shù)，以目的基因2-ΔΔCT值為參數(shù)半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示；各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腎功能

各時間點Sham組的BUN和SCr均保持相對穩(wěn)定水平；UUO組及HQSJ組BUN和SCr逐漸升高，同時相與Sham組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；HQSJ組可以降低UUO大鼠的BUN和SCr，同時相與UUO組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。endprint

2.2 腎臟病理變化

Sham組幾乎無明顯改變，UUO組與HQSJ組均有不同程度的病理改變。HQSJ治療后，腎臟組織形態(tài)學變化均較UUO組明顯減輕，但并未完全消失。與UUO比較，HQSJ組炎細胞浸潤程度在14、28d均減輕（P<0.05），56d無明顯改變（P>0.05）；腎間質慢性病變程度14、28、56d均減輕（P<0.05）。見表2。

2.3 免疫組織化學測定TGF-β1、FN蛋白的表達

Sham組幾乎無TGF-β1、FN表達。與Sham組比較，UUO組及HQSJ組在14、28、56d腎組織內見不同程度陽性棕褐色染色（P<0.05）。與UUO組比較，HQSJ組各時相棕褐色染色面積減輕（P<0.05）。TGF-β1在14、28、56d較UUO組下降幅度分別為64%、47%、7%，F(xiàn)N下降幅度分別為82%、72%、70%。見表3。

2.4 RT-PCR檢測TGF-β1、FN的mRNA的表達

與Sham組比較，RT-PCR檢測TGF-β1、FN的mRNA的表達均增高（P<0.05）。與UUO組比較，HQSJ組各時相表達減少（P<0.05）。TGF-β1在14、28、56d較UUO組下降幅度分別為72%、57%、27%，F(xiàn)N下降幅度分別為3%、72%、68%。見表4。

3 討論

RIF發(fā)病機制目前已知缺氧、感染、蛋白尿、免疫沉積物、化學因子、細胞因子、代謝性酸中毒、脂質、有毒物質等是引起CKD進展的主要病因，各種致病原因導致腎臟局部炎性細胞浸潤、腎臟固有細胞損傷并轉分化，炎性細胞及活化的固有細胞產生多種促纖維化因子，尤以TGF-β1為代表，主動參與ECM的合成；另外多種細胞因子通過旁分泌和自分泌方式，又促進腎臟固有細胞的增殖、活化及轉分化，產生大量以纖維粘蛋白（FN）和膠原（尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原）為代表的ECM的分泌[3-4]。中藥復方具有多成分的物質基礎，理論上具有多途徑與多靶點的作用特點，目前中藥抗RIF的作用備受關注。HQSJ方是我院全國名老中醫(yī)孫郁芝教授經過多年臨床實踐確立的用于治療CKD的基礎方，經大量臨床研究在降低尿蛋白、改善腎功能、延緩CKD進展方面療效確切[5]。為探討其抗RIF的多靶點作用機制，并通過動態(tài)觀察，了解HQSJ方何時開始起效以及在疾病不同發(fā)展階段的動態(tài)作用機制，我們采用UUO大鼠進行了動態(tài)相關研究。

對UUO造模后14、28、56d腎功能進行觀察，各時間點Sham組的BUN和SCr均保持相對穩(wěn)定水平[6-7]。模型組14d時，腎功能即可出現(xiàn)異常，到28d時血肌酐及尿素氮增高幅度最高，56d較28d升高幅度不明顯，考慮單側輸尿管梗阻后腎功能有一個急性損傷，故可見血肌酐及尿素氮的積聚增高，隨著時間延長對側腎臟開始代償，故可見血肌酐及尿素氮的明顯下降，最后對側腎臟亦失去代償，故可見腎功能不能完全恢復[8-9]。經HQSJ方治療后14～56d，腎臟病理變化較模型組減輕，同時腎功能也得到改善，在28d時血肌酐及尿素氮下降明顯低于模型組，56d時下降不明顯，說明HQSJ方的治療作用貫穿始終[10-11]。

腎臟病理觀察，Sham組幾乎無明顯病理改變，UUO組與HQSJ組的病理損傷都呈慢性進展的趨勢。UUO組造模后14、28、56d出現(xiàn)進行性腎小管間質損傷，病變在14d已出現(xiàn)明顯的腎間質炎癥細胞浸潤及腎小管擴張或萎縮、間質纖維化的病理變化。HQSJ方治療后，腎臟組織形態(tài)學變化均較UUO組明顯減輕，但并未完全消失。UUO及HQSJ組比較，炎細胞浸潤程度在14、28d有統(tǒng)計學意義（P<0.05），56d無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；腎間質慢性病變程度14、28、56d有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明其早期主要對炎癥細胞有抑制作用，對慢性病變程度的作用持續(xù)始終。提示HQSJ方對CKD治療持續(xù)有效，早期療效顯著[12-13]。

免疫組織化學測定TGF-β1、FN蛋白陽性面積及RT-PCR檢測TGF-β1、FN的mRNA的表達顯示：（1）Sham組幾乎無表達，UUO組及HQSJ組14、28、56d陽性表達漸加重，HQSJ組較UUO組表達明顯減弱。（2）與Sham組比較，UUO及HQSJ組TGF-β1、FN蛋白表達均增高，在同一時相比較均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（3）與UUO組比較，TGF-β1蛋白及mRNA的表達在14、28、56d下降幅度分別為64%、47%、7%與72%、57%、27%；FN蛋白及mRNA的表達下降幅度分別為82%、72%、70%與83%、72%、68%。

實驗說明HQSJ在14～28d主要減少炎性細胞浸潤，TGF-β1表達分泌為主，提示其腎臟保護作用從病變早期開始，主要表現(xiàn)為可能減輕各種炎性細胞及包括纖維化相關的細胞因子的分泌。從FN表達在14、28、56d下降幅度持續(xù)較高的數(shù)據(jù)提示，HQSJ可以持續(xù)減少腎臟固有細胞的活化及細胞外基質成分沉積，從而減輕RIF，延緩CKD的進展。

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（收稿日期：2014-07-18）endprint