國內(nèi)外青蒿素生產(chǎn)過程差異性比較

賈成友，于金英，張傳輝，王云紅，禹奇男，楊榮平

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2.重慶市中藥研究院中藥制劑研究所，重慶 400065）

國內(nèi)外青蒿素生產(chǎn)過程差異性比較

賈成友1,2，于金英1,2，張傳輝1,2，王云紅2，禹奇男1,2，楊榮平1,2

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2.重慶市中藥研究院中藥制劑研究所，重慶 400065）

青蒿（Artemisia apiacea）系菊科（Compositae）植物黃花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分，具有清熱解暑、除蒸截瘧之功效，主治暑熱、暑濕、濕溫、陰虛發(fā)熱、瘧疾和黃疸等癥[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，青蒿在抗瘧、抗腫瘤、抗菌殺蟲、抑制免疫功能亢進(jìn)、抗心律失常、抗孕、抗單純皰疹病毒等方面作用明顯，同時(shí)可用于紅斑狼瘡、心律失常的治療以及降低機(jī)體本身對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的過度免疫[2-4]。

青蒿素是從青蒿中提取分離出的含過氧橋基的新型倍半萜內(nèi)酯，分子式C15H22O5，分子量282.34，具有抗瘧、抗菌、解熱、增強(qiáng)免疫等藥理活性，尤為適宜于惡性瘧疾、腦型瘧疾的治療，是世界衛(wèi)生組織推薦治療瘧疾的首選藥物[5,6]。我國學(xué)者許杏祥等在1986年經(jīng)化學(xué)反應(yīng)首次合成了青蒿素，詮釋了全合成途徑和關(guān)鍵反應(yīng)參數(shù)[7]，此后，國外也相繼開展了有關(guān)青蒿素全合成途徑和方法的研究。合成所常用的原料主要有香茅醛、異胡薄荷醇、異檸檬烯、薄荷酮、β-蒎烯和環(huán)己烯酮等[8]。青蒿素的化學(xué)全合成研究雖取得了一定進(jìn)展，但由于合成路線繁瑣、難度大，工藝復(fù)雜、成本高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)[9]等種種因素，青蒿素化學(xué)合成在工業(yè)生產(chǎn)中難以普遍開展，其商業(yè)價(jià)值也未得以體現(xiàn)。因此，國內(nèi)外研究者開始轉(zhuǎn)向青蒿素合成生物學(xué)及代謝工程研究，以期在微生物體內(nèi)構(gòu)建青蒿素生物合成途徑，并對青蒿中原有的青蒿素生物合成途徑進(jìn)行遺傳改良，從而增加青蒿素產(chǎn)量[10]。本研究通過比較國內(nèi)外青蒿素生產(chǎn)過程的差異，分析國內(nèi)在青蒿素生產(chǎn)研究方面存在的問題，并提出了解決此類問題的方法和建議，為青蒿素進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 青蒿素獲取途徑

青蒿素主要來源于以下3個(gè)方面：直接從青蒿藥材中提取、單體物質(zhì)經(jīng)過多步化學(xué)反應(yīng)合成或通過組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因克隆法生物合成。在我國，青蒿素主要依靠從青蒿中直接提取，而國外則多通過化學(xué)合成和生物合成得到青蒿素或增加其產(chǎn)量。

2 青蒿素研究領(lǐng)域

國內(nèi)，醫(yī)藥研究者充分發(fā)揚(yáng)中國在青蒿素科學(xué)研究上的傳統(tǒng)優(yōu)勢，研究領(lǐng)域多集中在快速高效提取、分離純化和檢測青蒿素及青蒿素轉(zhuǎn)基因青蒿植株培育、青蒿素合成生物學(xué)和代謝工程方面；國外，青蒿素研究領(lǐng)域不僅囊括青蒿素轉(zhuǎn)基因青蒿植株培育、青蒿素合成生物學(xué)和代謝工程，而且開始轉(zhuǎn)向以異源生物作為反應(yīng)器來高效生產(chǎn)青蒿素，并已經(jīng)成功生物合成了青蒿素。此外，國內(nèi)外醫(yī)藥工作者在青蒿素研究的基礎(chǔ)上合成開發(fā)出的青蒿琥酯（artesunate）、蒿甲醚（artemether）、蒿乙醚（arteether）和二氫青蒿素（dihydroartemisinin）等，血中溶解度好，生物利用度高，對抗氯喹性瘧疾及致命性腦型瘧有很好的治療效果[11]，有效地避免或延緩了惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物抗藥性情況的發(fā)生。

3 國內(nèi)外青蒿素生產(chǎn)過程差異性比較

3.1 國內(nèi)青蒿素生產(chǎn)過程

3.1.1 直接從青蒿中提取青蒿素

青蒿廣泛分布于我國南北各地，但是野生生長和集中種植地域狹窄，不同產(chǎn)地青蒿中青蒿素含量差異較大（0.12%～1.30%）[12]，以重慶酉陽所產(chǎn)青蒿素含量居多。

3.1.1.1 提取方法

目前，我國青蒿素主要由青蒿飲片經(jīng)處理后提取、純化而來。常用的青蒿素提取方法有傳統(tǒng)溶劑法及近些年發(fā)展起來的新型提取工藝和聯(lián)用技術(shù)[13]。傳統(tǒng)溶劑法包括室溫提取、冷浸提取、索氏提取、回流提取；新型提取工藝技術(shù)包括超聲提取技術(shù)、超臨界CO2萃取技術(shù)、微波輔助萃取技術(shù)和快速溶劑萃取技術(shù)等。

近年來，我國醫(yī)藥工作者在傳統(tǒng)溶劑提取法的基礎(chǔ)上，結(jié)合青蒿藥材和青蒿素物化特點(diǎn)，采用新型提取工藝和聯(lián)用技術(shù)對青蒿素高效提取開展了一系列研究。張穎[14]以青蒿素提取量為考察指標(biāo)，采用有機(jī)溶劑提取法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，得出青蒿素最佳提取工藝條件，在該條件下青蒿素提取量達(dá)5.27 mg?g-1。盧婉怡[15]利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法考察纖維素酶輔助提取過程中時(shí)間、加酶量、溫度對青蒿素提取率的影響，并對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果優(yōu)化條件下青蒿素提取率較未使用酶輔助提取工藝提高了1.89倍。另有研究者通過超臨界CO2萃取法對青蒿中青蒿素進(jìn)行提取，同時(shí)考察萃取壓力、溫度以及時(shí)間對青蒿素收率的影響，優(yōu)化了提取工藝，使得青蒿素提取效率大大提高[16]。研究還發(fā)現(xiàn)，采用微波輔助提取法、快速溶劑萃取法提取青蒿素，與傳統(tǒng)溶劑提取結(jié)果相比較后發(fā)現(xiàn)，二者提取效率顯著高于傳統(tǒng)溶劑提取法[17-20]。此外，徐朝輝等[13]將超聲提取-膜過濾-超臨界萃取聯(lián)用技術(shù)用于青蒿素的提取，大大提高了青蒿素的收率（0.48%）和純度（92%），減少操作工序及污染，提高效益。鄧啟華等[21]將連續(xù)逆流技術(shù)與超聲波技術(shù)結(jié)合，應(yīng)用到黃花蒿中青蒿素的提取試驗(yàn)中，不僅加快了提取速率，同時(shí)使青蒿素的提取率高達(dá)89%。各提取方法原理和特點(diǎn)如表1所示。

3.1.1.2 純化手段

目前，文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)青蒿素分離純化工藝的研究方法主要有大孔樹脂吸附法和硅膠柱層析法等。龐斐等[26]采用超臨界流體色譜技術(shù)對青蒿萃取液中青蒿素進(jìn)行提純，使得青蒿素的含量達(dá)到74.83%。韋國鋒等[27]采用ADS-17大孔吸附樹脂提取青蒿素，使得青蒿素提取率高達(dá)75%，青蒿素含量大于99%。胡淼等[28]利用硅膠柱層析純化超臨界CO2提取所得青蒿素膏體，使得青蒿素含量可由原來的15%提高到70%以上，回收率達(dá)90%。周凌云[29]采用硅膠柱層析法純化青蒿素，利用不同比例石油醚與乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，90%乙醇結(jié)晶，考察填料、洗脫劑及層析次數(shù)對純化的影響，結(jié)果青蒿素含量高達(dá) 97.5%。由此可見，青蒿素可以通過大孔吸附樹脂和硅膠柱層析達(dá)到分離純化的目的。而南加州大學(xué)Chandrakant R等人[30]采用槲皮素反溶劑結(jié)晶法純化青蒿素，同樣取得良好成效，提示后期青蒿素純化研究不宜僅僅局限于一個(gè)方面，應(yīng)關(guān)注國際研究形式，多方位多靶點(diǎn)研究青蒿素純化方法，可以開發(fā)一種專門針對青蒿素富集純化的青蒿素接枝交聯(lián)殼聚糖樹脂，用于青蒿素的純化。

綜上，青蒿素的獲取已形成一個(gè)從提取到分離純化的完整流程。事實(shí)上，青蒿素提取、分離純化中仍存在有效成分提取不完全、溶劑殘留等問題，亟待進(jìn)一步地研究與改善。根據(jù)表1中內(nèi)容，對比各提取方法可知，尋求一種簡單方便，提取率高，溶劑殘留少，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)的提取方法、純化工藝顯得尤為重要。

3.1.2 轉(zhuǎn)基因植株培育

在生物合成青蒿素研究領(lǐng)域，我國主要側(cè)重于青蒿植株的組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植物研究，并取得了顯著成效。葉和春等首次將重組法呢基焦磷酸合成酶基因（FPS）導(dǎo)入青蒿，增加了FPS基因的拷貝數(shù)目，由此獲得青蒿素含量比對照高約4倍的轉(zhuǎn)基因青蒿發(fā)根（0.2%～0.3%）[31]及比對照高約3倍的轉(zhuǎn)基因青蒿植株（0.8%～1.0%）[32,33]。曾慶平[34]等將反義鯊烯合酶基因（asSS）導(dǎo)入青蒿，阻斷了競爭青蒿素生物合成的類固醇分支途徑，獲得的青蒿植株類固醇含量比對照植株降低近一半，同時(shí)，植株青蒿素含量比對照植株提高近3倍。Chen JL等[35]利用β-石竹烯合酶cDNA反義片段抑制青蒿的倍半萜合成支路，減少了β-石竹烯對紫穗槐-4,11- 二烯的競爭抑制，使得青蒿素含量提高50%。另有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素主要在青蒿葉片腺狀分泌毛狀體中合成[36]，細(xì)胞分裂素可刺激葉片生長，故推斷提高青蒿中的細(xì)胞分裂素水平有可能促進(jìn)青蒿素的合成。Geng S 等[37]將異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因（ipt）導(dǎo)入青蒿，使細(xì)胞分裂素水平提高近3倍，青蒿素含量增加了30%-70%。諸如此類的研究成果直接或間接應(yīng)用于青蒿素的實(shí)際生產(chǎn)，使得青蒿素類藥物產(chǎn)量大增，為降低瘧疾發(fā)病率和死亡率，解決青蒿素原料藥供不應(yīng)求，市場價(jià)格飆升[10]的問題帶來了新契機(jī)。

3.2 國外青蒿素生產(chǎn)過程

合成生物學(xué)作為一項(xiàng)新興領(lǐng)域，潛在地改善著全球健康，依靠其合成的新藥物，可再生化學(xué)品或清潔能源正慢慢走進(jìn)人們的生活[38,39]。國外，醫(yī)藥研究者在微生物中合成青蒿素前體后選擇改用化學(xué)方法半合成青蒿素，并已啟動(dòng)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。已有研究證實(shí)，青蒿素生物合成途徑屬于植物類異戊二烯代謝途徑。該途徑有酶和能產(chǎn)生青蒿素前體物質(zhì)的異源生物的參與，同時(shí)受到基因調(diào)控的影響。

參與類異戊二烯代謝途徑的關(guān)鍵酶主要有3-羥基-3- 甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）[40,41]，法呢基焦磷酸合酶（FPPS）[40]，紫穗槐-4,11- 二烯合酶（ADS）[42]，紫穗槐-4,11- 二烯P450單加氧酶[43]等。中間體主要有青蒿酸[7]，青蒿素B[44]，青蒿烯[45]，二氫青蒿素[46]四種。鑒于關(guān)鍵酶和中間體研究開始的比較早，研究成果較成熟，文獻(xiàn)、綜述中多有論述，本文不做詳細(xì)介紹，僅從利用異源生物為載體通過基因調(diào)控體內(nèi)合成青蒿素方面加以闡釋。

常用的異源生物包括大腸桿菌、沙門氏桿菌、酵母和煙草等。大腸桿菌生長快速，遺傳性好，與沙門氏桿菌在形態(tài)上和生理上都極其相似，并可以執(zhí)行一個(gè)基于內(nèi)生大腸桿菌transcription-translation（TX-TL）游離表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生等效大量蛋白質(zhì)T7的高效系統(tǒng)[47]。酵母菌與植物親緣關(guān)系比較接近，發(fā)酵時(shí)間短，產(chǎn)物量高，且可以簡化提取和純化過程。煙草葉片生物信息量大，具有精細(xì)的調(diào)控系統(tǒng)，可以通過光合作用獲得代謝前體物質(zhì)，且遺傳轉(zhuǎn)化研究較多，種種特點(diǎn)使得大腸桿菌、沙門氏桿菌、酵母、煙草等被用作分子代謝物異源表達(dá)的宿主，用以青蒿素的合成。

早在2001年，Wallaart[40]等已將ADS基因?qū)霟煵?，并成功獲得了可以產(chǎn)生0.2～1.7 ng?g-1鮮重的紫穗槐-4,11- 二烯轉(zhuǎn)基因煙草，發(fā)現(xiàn) ADS基因在轉(zhuǎn)基因植物中能表達(dá)出有活性的蛋白，為之后通過青蒿轉(zhuǎn)基因植株提高青蒿素產(chǎn)量的研究奠定基礎(chǔ)。Newman等[48]通過對酵母菌發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用紫穗槐-4,11- 二烯工程菌，采用兩相發(fā)酵法，使紫穗槐-4,11- 二烯的產(chǎn)量達(dá)到0.48 g?L-1。Kajiwara等[49]將IPP異構(gòu)酶編碼基因（idi）在細(xì)菌中過量表達(dá)，結(jié)果提高了類異戊二烯的積累量。另有文獻(xiàn)[50]報(bào)道稱，通過對半域突變等位基因upc2-1 過量地表達(dá)，可以在一定程度上提高了紫穗槐-4,11- 二烯的產(chǎn)量，使紫穗槐-4,11- 二烯的產(chǎn)量達(dá)到153 mg?L-1，與Martin等[51]利用工程大腸桿菌生產(chǎn)紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量相比較提高近500倍。Starai等[52]通過調(diào)控沙門氏桿菌乙酰輔酶A合酶，發(fā)現(xiàn)乙?；D(zhuǎn)移酶對乙酰輔酶A合成酶609位點(diǎn)的賴氨酸乙?；挂阴］o酶A 合成酶失活，而輔酶II（NADP）依賴性Sir2蛋白催化乙酰輔酶A合成酶脫去乙?；?，從而使其恢復(fù)酶活性。Shiba課題組[53]以此為基礎(chǔ)，將質(zhì)粒載體將沙門氏桿菌乙酰輔酶A合成酶去乙?；稽c(diǎn)基因L641P與ALD6基因轉(zhuǎn)入紫穗槐-4,11- 二烯工程酵母中，結(jié)果紫穗槐-4,11-二烯的量提高了1.9 倍。Redding-Johanson 和Westfall 兩個(gè)課題組[54,55]先后通過對代謝途徑中的酶進(jìn)行啟動(dòng)子修飾，進(jìn)而提高了工程菌中紫穗槐-4,11- 二烯的產(chǎn)量，為進(jìn)一步的合成提供了有力支持。不同的是，前者僅對甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶進(jìn)行修飾表達(dá)，而后者對整條代謝途徑過程中的酶基因都進(jìn)行了啟動(dòng)子修飾。對比二者結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對全部參與的酶都表達(dá)可以使青蒿酸、紫穗槐-4,11- 二烯產(chǎn)量大為增加，可見酶在生物合成中起到舉足輕重的作用?？刂?、調(diào)控好酶的作用就為中間產(chǎn)物和青蒿素的生成奠定了基礎(chǔ)。目前，科研領(lǐng)域已經(jīng)有報(bào)道[56]，將酵母菌和煙草作為紫穗槐-4,11- 二烯、青蒿酸中間體人工制備系統(tǒng)的宿主細(xì)胞，可制備出青蒿素，雖然產(chǎn)量較低，但是意義重大，表明通過異源宿主細(xì)胞可以獲得青蒿素。今后研究中，以此類中間體為合成前體，再通過廣泛的半合成青蒿素的研究，青蒿素的產(chǎn)量將會(huì)無限接近工業(yè)化的水平，青蒿素類藥物供需不平衡的偏態(tài)將被打破，為有效地降低青蒿素的價(jià)格，控制瘧疾在貧困國家的肆虐起到應(yīng)有的作用。

4 問題與展望

至今青蒿素類藥物仍然是治療惡性瘧疾、腦型瘧疾的首選藥。鑒于青蒿素類藥物需求量逐漸增加的態(tài)勢，實(shí)現(xiàn)青蒿素高效、多產(chǎn)就顯得尤為重要。國內(nèi)外青蒿素生產(chǎn)過程存在差異，我國主要從青蒿中直接提取獲得青蒿素，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)提高青蒿中青蒿素含量；而國外則通過在微生物中合成青蒿素的前體后改用化學(xué)方法半合成青蒿素，或以大腸桿菌、酵母菌和煙草為宿主細(xì)胞，體內(nèi)合成青蒿素。造成這種研究側(cè)重點(diǎn)存在差異的原因有歷史和現(xiàn)實(shí)雙重因素。青蒿在中國有著悠久的種植和使用歷史，人們更愿意以傳統(tǒng)的思維和手段去研究、利用它，開發(fā)也只局限于青蒿轉(zhuǎn)基因植物的培育方面，在生物合成方面雖有涉及但研究不夠深入。國外研究者不受傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)和研究方法的束縛，更傾向于向更深領(lǐng)域的開拓，這也促成了他們在生物合成青蒿素領(lǐng)域處于遙遙領(lǐng)先的地位。

青蒿素的研究開發(fā)是一段艱辛的路程，我們可以借鑒國外研究的最新成果，加快國內(nèi)青蒿種植和青蒿素產(chǎn)業(yè)化建設(shè)，同時(shí)也應(yīng)該形成自己的特色：研究過程中應(yīng)著力加強(qiáng)青蒿素轉(zhuǎn)基因青蒿植株的田間試驗(yàn)和評價(jià)，加強(qiáng)青蒿素合成反應(yīng)的分子物質(zhì)基礎(chǔ)研究，以此建立青蒿及轉(zhuǎn)基因青蒿中由中間體轉(zhuǎn)變?yōu)榍噍锼氐耐獠織l件，從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等優(yōu)轉(zhuǎn)基因青蒿品種的普及和應(yīng)用；此外，還應(yīng)重點(diǎn)完善青蒿素高效提取方法，解決溶劑殘留問題，優(yōu)化青蒿素純化工藝，建立青蒿素快速高效檢測方法，為青蒿素工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)，造福數(shù)億患者。

摘編自《世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化》2015年3期：734～739頁，圖、表、參考文獻(xiàn)已省略。