青蒿素的合成生物學(xué)研究進(jìn)展

孔建強(qiáng)，王偉，程克棣，朱平

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

青蒿素的合成生物學(xué)研究進(jìn)展

孔建強(qiáng)，王偉，程克棣，朱平

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

青蒿素是一種非常優(yōu)良的抗瘧藥物，存在活性好、毒副作用小、市場(chǎng)需求大、來(lái)源窄等特點(diǎn)，從而導(dǎo)致價(jià)格昂貴，不利于疾病的治療和預(yù)防，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康安全。因此，需要建立一種大規(guī)模的、廉價(jià)生產(chǎn)這種藥物的替代方法。現(xiàn)在看來(lái)，天然藥物合成生物技術(shù)無(wú)疑是最理想的。天然藥物合成生物學(xué)是在以基因組解析技術(shù)和化學(xué)合成技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)基礎(chǔ)上，將工程學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)相結(jié)合，綜合分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、藥物化學(xué)、藥物合成、藥物分析、藥理學(xué)等學(xué)科，建立起來(lái)的以規(guī)?；统绦蚧苽涮烊凰幬餅槟康牡募蓪W(xué)科。從本質(zhì)上說(shuō)，天然藥物合成生物學(xué)技術(shù)是一種采用綠色、可持續(xù)發(fā)展方式規(guī)?；苽涮烊凰幬锏墓こ袒锖铣杉夹g(shù)，代表著未來(lái)天然藥物制備的發(fā)展方向之一。其研究?jī)?nèi)容目前主要包括兩個(gè)方面：一是天然藥物固有代謝途徑的解析、重構(gòu)與工程化，即通過(guò)基因工程，將天然藥物生物合成相關(guān)途徑酶基因?qū)氪竽c桿菌、釀酒酵母以及模式植物細(xì)胞中，在這些底盤(pán)細(xì)胞中重構(gòu)一條天然藥物的生物合成途徑，將這些細(xì)胞構(gòu)建成能制備天然藥物的“細(xì)胞工廠”，利用“細(xì)胞工廠”生長(zhǎng)繁殖快的特點(diǎn)，源源不斷的制備天然藥物；二是全新天然藥物合成途徑的設(shè)計(jì)、篩選、組裝與程序化，即根據(jù)天然藥物的生源合成途徑，從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找相應(yīng)的酶基因，并將這些酶基因轉(zhuǎn)移到底盤(pán)細(xì)胞中，組裝成一條全新的多基因控制的藥物合成途徑，利用這條代謝途徑制備出結(jié)構(gòu)優(yōu)化、產(chǎn)量豐富的天然藥物。經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，天然藥物合成生物技術(shù)已被成功地應(yīng)用到青蒿素的規(guī)模化制備中，并取得了一系列成果。

1 青蒿素生物合成及相關(guān)酶基因研究進(jìn)展

青蒿素生物合成途徑現(xiàn)在并不是完全清楚。根據(jù)相關(guān)中間體的分離和結(jié)構(gòu)鑒定[1-8]，以及生物合成相關(guān)酶基因的克隆與功能鑒定[9-27]，再加上原位青蒿素飼喂實(shí)驗(yàn)[3,7,8,28,29]綜合分析，推斷青蒿素的生物合成主要包括四大步驟：第一步是通過(guò)甲羥戊酸途徑和非甲羥戊酸兩條途徑形成法尼基焦磷酸（farnesylpyrophosphate，F(xiàn)PP）[30,31]；第二步是在紫穗槐-4,11-二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）的作用下將 FPP環(huán)化形成青蒿素的中間體紫穗槐-4,11-二烯[19-21]；第三步是在紫穗槐-4,11-二烯氧化酶（amorpha-4,11-diene oxidase，AMO）的作用下，紫穗槐-4,11-二烯進(jìn)一步被氧化形成青蒿醇、青蒿醛，進(jìn)而合成青蒿酸和/或二氫青蒿酸[22,23,25]；第四步是青蒿酸和/或二氫青蒿酸通過(guò)一系列酶反應(yīng)和/或非酶反應(yīng)形成青蒿素（圖 1）[28,29,32,33]。在這條合成途徑中，第四步爭(zhēng)議最大。早期的研究表明，青蒿酸是青蒿素最直接的前體[32,33]；而隨著青蒿素分子生物學(xué)的發(fā)展，二氫青蒿酸是青蒿素最直接的前體又逐漸被研究人員提出[3,7,8,29]。究竟誰(shuí)是青蒿素最直接前體，現(xiàn)在尚無(wú)定論。推測(cè)青蒿中可能存在至少兩條青蒿素生物合成途徑，即分別以青蒿酸和二氫青蒿酸為最直接前體的兩條生物合成途徑，不同青蒿中存在哪條合成途徑取決于其化學(xué)型[34,35]。

參與青蒿素生物合成途徑的酶基因中，參與FPP生物合成的酶基因絕大部分都已經(jīng)通過(guò)克隆得到，如脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXPS）[9,10]、脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxyxylulouse 5-phosphate reductoisomerase，DXPR）[9,11,12]、1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-二磷酸合酶（1-hydroxy-2-methyl-2-butenyl diphosphatesynthase，HDS）[13]、1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl 4-diphosphate reductase，HDR）[14]、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymeA reductase，HMGR）[15]和法尼基焦磷酸合酶基因（farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PPS）[16-18]等。而以FPP為底物特異合成青蒿素的酶基因也有部分被克隆并進(jìn)行了功能鑒定。如紫穗槐-4,11-二烯合酶[19-21]、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶[22-24]、細(xì)胞色素P450氧化還原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，CPR）[22]、青蒿醛雙鍵還原酶[25]和醛脫氫酶[26]等編碼基因的克隆與功能鑒定。在上述酶基因中，參與萜類(lèi)共同前體FPP生物合成的酶基因保守性較強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，較多的見(jiàn)于各種實(shí)驗(yàn)論文和綜述中，本文不作詳細(xì)介紹。紫穗槐-4,11-二烯合酶是青蒿素生物合成的第一個(gè)特異性酶，其性質(zhì)與基因克隆、功能鑒定參考筆者以前的綜述[27]。下面對(duì)其余參與青蒿素合成的特異性酶基因作簡(jiǎn)單介紹。

1.1 紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因

在青蒿或非青蒿植物中，存在著多個(gè)能氧化紫穗槐-4,11-二烯的酶[22-24,36]。2005年，Bertea等[3]以青蒿葉片微粒體酶對(duì)紫穗槐-4,11-二烯進(jìn)行催化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果在產(chǎn)物中檢測(cè)到了青蒿醇的存在。根據(jù)這個(gè)結(jié)果，以及青蒿醇和紫穗槐-4,11-二烯相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，Bertea等推斷在青蒿中存在一個(gè)P450羥基化酶，這個(gè)酶能將紫穗槐-4,11-二烯催化生成青蒿醇。

2006年，美國(guó)的 Keasling[22]和加拿大的 Covello[23]兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室先后從青蒿腺毛中克隆得到了紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因CYP71AV1，并進(jìn)行了功能鑒定，但對(duì)于CYP71AV1編碼框的大小，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果有所不同。Keasling實(shí)驗(yàn)室推斷CYP71AV1長(zhǎng)為1485 bp，編碼494氨基酸的蛋白，而Covello實(shí)驗(yàn)室推斷CYP71AV1長(zhǎng)為1464 bp，編碼487氨基酸的蛋白，通過(guò)對(duì)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室提供的具體序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Keasling實(shí)驗(yàn)室多出的堿基位于CYP71AV1的5' 末端。盡管在氨基酸序列上存在差異，但這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)這兩個(gè)蛋白都進(jìn)行了功能鑒定，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)蛋白都能將紫穗槐-4,11-二烯連續(xù)催化形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，是多功能酶。隨后幾年，CYP71AV1基因被不同實(shí)驗(yàn)室的科研人員從不同的青蒿株系中克隆得到[37,38]，目前，在GenBank中注冊(cè)的CYP71AV1基因已有十幾條。CYP71AV1的編碼序列和現(xiàn)在已知的其他P450之間的一致性很低，最高51%，表明該P(yáng)450是一種菊科植物特異的P450氧化酶，考慮到青蒿素是青蒿中的特異成分，有理由推測(cè)CYP71AV1參與了青蒿素的生物合成途徑。進(jìn)一步的功能鑒定證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。CYP71AV1對(duì)底物具有特異性，只能作用于紫穗槐-4,11-二烯，而對(duì)其他單萜和倍半萜如檸檬烯（limonene）、α-蒎烯（α-pinene）、β-蒎烯（β-pinene）、松香芹醇（pinocarveol）、（-）-異長(zhǎng)葉烯（-）-alloisolongifolene）、石竹烯（caryophyllene）、（-）-α-古蕓烯（-）-α-gurjunene）、（+）- γ-古蕓烯（+）-γ-gurjunene）、（+）-喇叭烯（+）-ledene）、（+）-β-芹子烯（+）-β-selinene）和（+）-朱欒倍半萜（+）-valencene）則沒(méi)有活性。CYP71AV1的表達(dá)具有組織特異性，RT-PCR結(jié)果表明，CYP71AV1在腺毛中的表達(dá)水平最高，其次是花芽（flower bud），而在葉和根中的表達(dá)水平非常低，幾乎檢測(cè)不到RT-PCR產(chǎn)物[23]。

Teoh等[23]通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)表明，CYP71AV1除了能作用于紫穗槐-4,11-二烯，連續(xù)形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸之外，還能作用于二氫青蒿醇，形成二氫青蒿醛，但對(duì)二氫青蒿醛幾乎沒(méi)有活性。

除了從青蒿中克隆青蒿素生物合成相關(guān)基因之外，2010年，Nguyen等[24]從包括菊芋（Cichoriumintybus L.）在內(nèi)的5種菊科植物中分離得到了5個(gè)大香葉烯A氧化酶（germacrene A oxidase）cDNA，功能鑒定表明，大香葉烯A氧化酶除了能連續(xù)氧化大香葉烯A形成對(duì)應(yīng)的酸外，還能連續(xù)氧化紫穗槐-4,11-二烯形成青蒿酸，但當(dāng)這些氧化酶和來(lái)自青蒿的電子配偶體CPR偶聯(lián)進(jìn)行氧化反應(yīng)時(shí)，其對(duì)紫穗槐-4,11-二烯的氧化活性要低于 CYP71AV1。這是第一例從非青蒿植物中分離得到具有氧化紫穗槐-4,11-二烯活性的氧化酶的報(bào)道。

2011年，Cankar等[36]從菊芋根中除了克隆得到上面介紹的大香葉烯A氧化酶cDNA外，還克隆得到一個(gè)P450氧化酶CYP71AV8基因，該基因CDS長(zhǎng)為1491 bp，編碼496氨基酸，和CYP71AV1（DQ315671）的氨基酸一致性為78%，與大香葉烯A氧化酶（GU256644）的氨基酸一致性為81%。該酶除了催化（+）-valencene 生成（+）-nootkatone之外，還能分別催化大香葉烯A和紫穗槐-4,11-二烯生成germacra-1（10），4,11（13）-trien-12-oic acid和青蒿酸，與CYP71AV1不同的是，將紫穗槐-4,11-二烯投入該酶的反應(yīng)體系中時(shí)，在反應(yīng)產(chǎn)物中除了檢測(cè)到了青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸之外，還檢測(cè)到了二氫青蒿醛。多個(gè)具有紫穗槐-4,11-二烯氧化功能的P450酶的出現(xiàn)豐富了合成生物學(xué)制備青蒿素前體的可能性，同時(shí)，通過(guò)對(duì)這些酶進(jìn)行進(jìn)化分析，可能衍生得到具有超強(qiáng)紫穗槐-4,11-二烯氧化功能的P450酶。

1.2 細(xì)胞色素P450還原酶基因

CYP71AV1是一種 P450氧化酶，其不能單獨(dú)發(fā)揮作用，必須由電子配偶體的配合。2006年，Keasling實(shí)驗(yàn)室在克隆得到CYP71AV1后，從青蒿中將CYP71AV1的電子配偶體——細(xì)胞色素P450還原酶基因也克隆了出來(lái)[22]。

1.3 青蒿醛雙鍵還原酶

2008年，Zhang等[25]通過(guò)綜合運(yùn)用蛋白部分純化、質(zhì)譜和EST文庫(kù)的方法從青蒿中克隆得到一個(gè)青蒿醛Δ11（13）雙鍵還原酶基因，命名為Dbr2。Dbr2基因長(zhǎng)為1245 bp，編碼414氨基酸的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為45.6 kD。Dbr2蛋白和植物的12-氧代植二烯酸還原酶（12-oxophytodienoate reductases）蛋白家族具有最高的氨基酸一致性。Dbr2 的180、183和185位含有3個(gè)高度保守的組氨酸。Dbr2的最適pH是7.5，當(dāng)pH為5.5時(shí)，Dbr2的活性被抑制，當(dāng)pH為9.0 時(shí)，Dbr2的活性只有20%。Dbr2在腺毛中表達(dá)最高，特異性地作用于青蒿醛，生成11R-二氫青蒿醛，對(duì)青蒿酸、青蒿醇、artemisitene 和arteannuin B均無(wú)活性。

2009年，Zhang等[39]從青蒿中分離得到一個(gè)雙鍵還原酶，命名為Dbr1，這個(gè)蛋白長(zhǎng)為346氨基酸，分子質(zhì)量為38.5 kD，基因編碼長(zhǎng)度為1041 bp。Dbr1含有一個(gè)富含甘氨酸的的多肽序列——AASGAVG，這個(gè)結(jié)構(gòu)參與了結(jié)合NAD（P）H 和NAD（P）中的焦磷酸基團(tuán)。底物結(jié)合位點(diǎn)處含有1個(gè)保守性很高的Tyr，在Dbr1中含有1個(gè)保守的催化結(jié)構(gòu)域SQY。在Dbr1的C末端有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域GKNVGKQVVXVAXE，但其功能尚不清楚，Dbr1最適pH是7.0，用NADH做輔助因子時(shí)，沒(méi)有活性。Dbr1和Dbr2一樣，也能催化青蒿醛形成二氫青蒿醛，但產(chǎn)物以11S-二氫青蒿醛為主，此外，在待檢測(cè)的底物中，Dbr1和Dbr2共同的底物只有青蒿醛和2E-nonenal。

1.4 醛脫氫酶

2009年，Teoh等[26]從青蒿中分離得到1個(gè)醛脫氫酶基因，命名為Aldh1。該基因CDS長(zhǎng)為1497 bp，編碼498氨基酸，分子質(zhì)量是53.8 kD。ALDH1的N末端無(wú)信號(hào)肽，也沒(méi)有細(xì)胞器定位序列。ALDH1含有兩個(gè)非常保守的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是含有谷氨酸活性位點(diǎn)的保守結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)是含有半胱氨酸活性位點(diǎn)的保守結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域參與了ALDH1的催化功能。此外，ALDH1還含有保守的4個(gè)氨基酸，分別是Gly243、Gly297、Glu397 和Phe399，這4個(gè)氨基酸參與了與輔因子的結(jié)合。ALDH1在腺毛中表達(dá)最高，在花芽中表達(dá)適中，在葉子中表達(dá)較低，而在根中檢測(cè)不到活性，這種表達(dá)方式與CYP71AV1的很相似，也與青蒿素在植物中的分布很相似，表明ALDH1可能參與了青蒿素的生物合成。ALDH1 能作用于青蒿醛和二氫青蒿醛，生成相應(yīng)的青蒿酸和二氫青蒿酸。此外，該酶對(duì)短鏈的烷基醛（alkyl aldehye）也有弱的活性。以二氫青蒿醛為底物時(shí)，其最適pH是8.5，用NAD和NADP作輔因子時(shí)都有活性。

2 青蒿素合成生物學(xué)研究特點(diǎn)

青蒿素的合成生物學(xué)研究是伴隨其生物合成途徑的逐步闡明而發(fā)展起來(lái)的。由于從青蒿酸/二氫青蒿酸形成青蒿素的途徑不是很清楚，現(xiàn)在通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)制備青蒿素的研究絕大部分采用的都是一種半合成的路線。即通過(guò)代謝工程制備青蒿素的前體如紫穗槐-4,11-二烯[40，41]、青蒿酸[42，43]和二氫青蒿酸[25]，然后通過(guò)半合成的方法合成青蒿素[40-43]。經(jīng)過(guò)若干年的發(fā)展，青蒿素合成生物學(xué)的研究取得了重要進(jìn)展，呈現(xiàn)如下幾個(gè)特點(diǎn)。

2.1 底盤(pán)細(xì)胞種類(lèi)多樣

與普通異源宿主不同的是，用于合成生物學(xué)研究的底盤(pán)細(xì)胞是一種遺傳背景清楚、按照工程化原理構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化集成細(xì)胞，可以為模塊工作提供穩(wěn)定場(chǎng)所，并能用于工業(yè)化生產(chǎn)。迄今為止，用于青蒿素及其中間體合成生物學(xué)研究的底盤(pán)細(xì)胞有大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物細(xì)胞和其他微生物（表1）。

E.coli是所有工程菌中開(kāi)發(fā)最早、最成熟的一種。盡管缺少糖基化和翻譯后加工等功能，但大腸桿菌具有遺傳背景清楚、生長(zhǎng)快速、生長(zhǎng)周期短、安全性好、可以進(jìn)行高密度培養(yǎng)、適合表達(dá)不同基因產(chǎn)物和成本低及易于操作等優(yōu)點(diǎn)，因此成為青蒿素合成生物學(xué)研究中首選的宿主菌，已經(jīng)在大腸桿菌中重構(gòu)了紫穗槐-4,11-二烯[40,44-55]和青蒿酸[52]等青蒿素中間體的合成途徑。

釀酒酵母是一種真核生物，因其具有內(nèi)膜系統(tǒng)，更適合包括P450氧化酶等基因在內(nèi)的植物次生代謝酶基因的表達(dá)，因此，在青蒿素合成生物學(xué)研究中，被更多的作為紫穗槐-4,11-二烯[22,41,55-63]、青蒿酸[22,25,36,37,41-43,64-65]和二氫青蒿酸[25]等重要中間體人工制備系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。

和微生物相比，植物表達(dá)系統(tǒng)有自己的優(yōu)勢(shì)，如具有精細(xì)的調(diào)控系統(tǒng)，能通過(guò)光合作用獲得代謝前體物質(zhì)等。利用植物表達(dá)系統(tǒng)制備的萜類(lèi)化合物產(chǎn)量一直很低，提高幅度較慢，但植物表達(dá)系統(tǒng)是獲得代謝產(chǎn)物種類(lèi)最多的底盤(pán)細(xì)胞。已經(jīng)獲得了紫穗槐-4,11-二烯[21,66-70]、青蒿醇[68]、二氫青蒿醇[68]、青蒿酸糖苷[69]和青蒿素[70]等代謝產(chǎn)物。

除了上述幾種比較常見(jiàn)的底盤(pán)細(xì)胞外，構(gòu)巢曲霉也被用來(lái)制備紫穗槐-4,11-二烯[71]。

2.2 青蒿素合成生物學(xué)研究實(shí)現(xiàn)了多種產(chǎn)物的制備

在青蒿素的合成生物學(xué)研究中，已經(jīng)可以通過(guò)煙草制備出抗瘧藥物青蒿素[70]，盡管產(chǎn)量較低，但這個(gè)開(kāi)創(chuàng)性的報(bào)道具有非常重要的意義。首先表明通過(guò)異源宿主細(xì)胞可以獲得青蒿素，其次，加深對(duì)青蒿素生物合成途徑的了解，從而促進(jìn)青蒿素合成生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。除此之外，通過(guò)合成生物學(xué)研究還制備獲得了不同的青蒿素中間體，如紫穗槐-4,11-二烯[21,22,40,41,44-63,66-70]、青蒿醇[68]、二氫青蒿醇[68]、青蒿酸[22,36,37,41,52,64-65]、青蒿酸糖苷[69]和二氫青蒿酸[25]。并且以這些中間體為合成前體，進(jìn)行了廣泛的半合成青蒿素的研究，取得了重要的進(jìn)展。有些半合成青蒿素的產(chǎn)量已經(jīng)無(wú)限接近工業(yè)化的水平[40-43]。

2.3 重構(gòu)青蒿素及其中間體代謝途徑的方式多樣

目前主要通過(guò)兩種模式在不同的底盤(pán)細(xì)胞中構(gòu)建青蒿素及其中間體代謝途徑。第一種模式是青蒿素及其中間體固有代謝途徑的轉(zhuǎn)移、重構(gòu)與工程化，這種模式是建立在青蒿素代謝途徑的深刻解析的基礎(chǔ)之上，是青蒿素合成生物學(xué)研究中主要的模式。這種模式的主要特點(diǎn)是重構(gòu)的青蒿素及其中間體的代謝途徑與原植物中的代謝途徑基本保持一致。通過(guò)這種模式構(gòu)建的青蒿素及其中間體工程化生物系統(tǒng)中，一種方式是只導(dǎo)入了青蒿素生物合成特異途徑中的基因，利用底盤(pán)細(xì)胞中固有的底物供應(yīng)途徑，便可達(dá)到制備青蒿素中間體的目的（圖2）。這種構(gòu)建方式主要是基于基因工程的原理設(shè)計(jì)的。和別的重構(gòu)方式相比，這種方式相對(duì)較為簡(jiǎn)單。這種青蒿素及其中間體工程系統(tǒng)的構(gòu)建理念被廣泛地運(yùn)用到了不同的底盤(pán)細(xì)胞中，更主要的目的是想驗(yàn)證不同代謝途徑在底盤(pán)細(xì)胞中重構(gòu)的可能性[19-21,50,55,56,63,67,68]。

第二種方式也是利用底盤(pán)細(xì)胞中固有的底物供應(yīng)途徑，和第一種方式不同的是除了導(dǎo)入青蒿素生物合成特異基因之外，還導(dǎo)入了底物供應(yīng)途徑的限速酶基因，通過(guò)增加這些限速酶基因的拷貝數(shù)，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量（圖3）。和第一種方式相比，通過(guò)這種方式構(gòu)建工程菌時(shí)，在基因工程的原理上引入了模塊化設(shè)計(jì)的理念。這樣構(gòu)建的工程菌中，一般含有兩個(gè)模塊，即青蒿素及其中間體合成模塊與萜類(lèi)前體調(diào)控模塊。組成這兩個(gè)模塊的基因一般分處在不同的質(zhì)粒上[44-47,51,52,54,62]，但考慮到底盤(pán)細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，這兩個(gè)模塊的基因有時(shí)候也克隆在同一載體上[47,70]。自然界主要存在兩條萜類(lèi)前體供應(yīng)的途徑，根據(jù)萜類(lèi)前體調(diào)控模塊將這種方式的工程菌分為兩大類(lèi)，即含DXP途徑調(diào)控模塊的工程菌和含MVA途徑調(diào)控模塊的工程菌。Martin等[44]構(gòu)建了一種紫穗槐-4,11-二烯E.coli工程菌，除了導(dǎo)入ADS基因之外，還導(dǎo)入了含DXP途徑的3個(gè)限速酶基因的模塊，導(dǎo)致目的產(chǎn)物紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量提高了3.6倍。2006年，Ro等[22]構(gòu)建了以釀酒酵母為底盤(pán)細(xì)胞的青蒿酸工程菌，在該工程菌中，除了導(dǎo)入了含青蒿酸生物合成特異基因的模塊之外，還導(dǎo)入了含MVA途徑基因的調(diào)控模塊，通過(guò)調(diào)控模塊的作用，使工程菌中青蒿酸的產(chǎn)量大幅提升，達(dá)到115 mg·L-1。除此之外，還有很多實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的工程菌都采用了這種青蒿素及其中間體合成模塊與MVA 途徑調(diào)控模塊共轉(zhuǎn)化的模式，如Kong等[37,62]、Wu等[50]、van Herpen等[69]以及Farhi等[70]等構(gòu)建的工程菌。

第三種方式是另外導(dǎo)入一條底物供應(yīng)途徑，這樣既可以在不需要底盤(pán)細(xì)胞供應(yīng)底物的情況下，完成青蒿素及其中間體的制備，也可以同時(shí)利用底盤(pán)細(xì)胞固有的底物供應(yīng)途徑和引入的底物供應(yīng)途徑提供的底物制備青蒿素及其中間體。和前兩種方式相比，這種方式通過(guò)模塊化的設(shè)計(jì)導(dǎo)入更多的基因，給底盤(pán)細(xì)胞帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)最重，因此，在操作上更為繁雜。這種構(gòu)建工程菌的方式融入了工程化思想，使得重構(gòu)的代謝途徑成為一條可拆卸的即插即用的“電路”（圖 4）。2003年，美國(guó)伯克利分校的 Keasling課題組構(gòu)建了一個(gè)能制備紫穗槐-4,11-二烯的E.coli工程菌，在這個(gè)工程菌中，導(dǎo)入了3個(gè)模塊，即甲羥戊酸合成模塊（頂部模塊，top module）、FPP合成模塊（bottom module）和紫穗槐-4,11-二烯合成模塊[44]。這3個(gè)模塊都由一些可拆卸的即插即用的元件構(gòu)成，因此，既可以方便地對(duì)模塊中的元件進(jìn)行優(yōu)化[54]，也能便捷地將這些模塊用于其他代謝途徑的構(gòu)建[52]，將眾多復(fù)雜的生物合成途徑演變成了可隨時(shí)拆卸用的工程化生物系統(tǒng)。此后的很多學(xué)者也采用了類(lèi)似的方法構(gòu)建了不同的青蒿素及其中間體工程化系統(tǒng)[52]。

在底盤(pán)細(xì)胞中構(gòu)建青蒿素及其中間體代謝途徑的第二種模式是全新青蒿素及其中間體合成途徑的設(shè)計(jì)、篩選、組裝與程序化。這種模式是根據(jù)青蒿素及其中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的一條合成路線。根據(jù)這條合成路線從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出能參與設(shè)計(jì)好的合成路線的酶基因，并將這些酶基因?qū)氲妆P(pán)細(xì)胞中，在底盤(pán)細(xì)胞中組裝成一條新的青蒿素及其中間體的合成路線。這樣構(gòu)建的青蒿素及其中間體的合成路線和原植物中的合成路線明顯不同，它是建立在深厚的化學(xué)和生物功底的基礎(chǔ)之上，不需要詳細(xì)了解青蒿素在原植物中的合成路線。Dietrich等[65]構(gòu)建了一個(gè)能制備artemisinic-11S，12-epoxide的大腸桿菌工程菌，在這個(gè)工程菌中，除了導(dǎo)入能合成紫穗槐-4,11-二烯的操縱子之外，還導(dǎo)入了一個(gè)突變的長(zhǎng)鏈脫氫酶基因 P450BM3，這樣構(gòu)建的代謝途徑并不是青蒿中存在的，然而，利用這樣構(gòu)建的工程菌產(chǎn)生的artemisinic-11S，12-epoxide 為底物，通過(guò)半合成的方法卻能制備得到青蒿素的直接前體二氫青蒿酸。

3 提高工程菌中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的措施

3.1 通過(guò)“開(kāi)源”方式增加前體供應(yīng)

青蒿素是一種倍半萜，其生物合成包括兩部分（圖1）。上游部分（top pathway）主要指倍半萜共同前體FPP的形成。通過(guò)MEP和MVA兩條途徑形成的FPP池可以為下游各種倍半萜以及甾體提供前體物質(zhì)。下游部分（bottom pathway）是青蒿素生物合成的特異途徑，即在ADS的競(jìng)爭(zhēng)作用下，將上游途徑中形成的FPP池中的部分FPP引入青蒿素生物合成代謝流中。因此，為了提高工程菌中青蒿素或其中間體的產(chǎn)量，就必須將更多的前體FPP導(dǎo)入青蒿素生物合成的特異途徑中?？傮w來(lái)看，現(xiàn)在實(shí)現(xiàn)這一目的的方式主要采用“開(kāi)源”和“節(jié)流”兩種。所謂“開(kāi)源”，是指提高工程菌的FPP池中底物的總量，從而提高進(jìn)入青蒿素生物合成途徑的底物的絕對(duì)總量，這是提高工程菌產(chǎn)量的主要方式，包括提高FPP形成途徑中各個(gè)途徑酶的效率，如增加基因拷貝數(shù)、對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行修飾、密碼子優(yōu)化、基因替換、調(diào)控輔酶數(shù)量以及選擇不同區(qū)室等；或者通過(guò)優(yōu)化或平衡多基因控制的代謝途徑實(shí)現(xiàn)底物供應(yīng)的增量。而“節(jié)流”則是限制或減少底物流向別的代謝流，促使相對(duì)更多的FPP進(jìn)入青蒿素生物合成特異途徑。在青蒿素工程菌優(yōu)化過(guò)程中，這兩種方式既可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以聯(lián)合應(yīng)用。

3.1.1 增加基因的拷貝數(shù)

增加FPP合成途徑中酶基因的拷貝數(shù)，能有效地增加底物的供應(yīng)，這個(gè)觀點(diǎn)已經(jīng)為很多實(shí)驗(yàn)所證明。為了提高DXP途徑合成FPP的效率，Martin等[44]在工程菌中導(dǎo)入了含DXP途徑關(guān)鍵酶基因的質(zhì)粒，通過(guò)增加這些限速酶的基因拷貝數(shù)，使得構(gòu)建的工程菌產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量高于對(duì)照。為了增加重構(gòu)青蒿酸代謝途徑中底物FPP的供應(yīng)，Ro等[22]在釀酒酵母工程細(xì)胞中增加了MVA途徑的限速酶基因HMGR和FPPS的拷貝數(shù)，使得青蒿酸的產(chǎn)量顯著上升。Pitera等[46]通過(guò)采用將途徑酶基因克隆到多拷貝的表達(dá)質(zhì)粒上的方式，增加途徑酶基因的拷貝數(shù)，從而有效地增加了工程菌中底物的供應(yīng)?？捉◤?qiáng)等[62]的實(shí)驗(yàn)也表明，增加甲羥戊酸途徑中的HMGR和FPPS編碼基因的拷貝數(shù)，能有效地提高紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量。這種方法操作性很強(qiáng)，而且效果很直接，因此很多實(shí)驗(yàn)室都采用了增加基因拷貝數(shù)的策略來(lái)提高重構(gòu)生物系統(tǒng)中底物的供應(yīng)，進(jìn)而提高工程菌中目的產(chǎn)物產(chǎn)量[46,50,66,70]。

除了通過(guò)增加途徑酶基因的拷貝數(shù)來(lái)提高酶催化的效率之外，通過(guò)調(diào)控因子間接地促進(jìn)這些途徑酶基因的表達(dá)效率也是青蒿素合成生物學(xué)中比較常用的一種方法。UPC2是一種轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控甾體生物合成途徑中的許多酶基因表達(dá)，也包括FPP 生物合成途徑中的部分酶基因。因此，過(guò)表達(dá)upc2，能有效地增加FPP生物合成途徑中的許多酶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步提高他們的表達(dá)效率，增加FPP的供應(yīng)，有效地改善工程菌中紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的產(chǎn)量[22]。

3.1.2 啟動(dòng)子修飾

啟動(dòng)子的強(qiáng)弱能有效地影響基因表達(dá)的效率。Pitera等[46]通過(guò)將甲羥戊酸生物合成相關(guān)操縱子的Lac 啟動(dòng)子替換成強(qiáng)啟動(dòng)子araBAD后，導(dǎo)致甲羥戊酸積累。Anthony等[47]的實(shí)驗(yàn)也證明，采用強(qiáng)啟動(dòng)子時(shí)，甲羥戊酸生物合成相關(guān)操縱子的表達(dá)確實(shí)加強(qiáng)，導(dǎo)致紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量顯著提高。Redding-Johanson等[51]的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，使用強(qiáng)啟動(dòng)子能增加甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶的表達(dá)活性，進(jìn)而提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量。相對(duì)于上述采用強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控部分途徑酶基因的轉(zhuǎn)錄相比，Westfall等[41]對(duì)整條代謝途徑的途徑酶基因都采用強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行過(guò)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這樣的效果更佳，和前者相比，整條代謝途徑都過(guò)表達(dá)的工程菌產(chǎn)生的青蒿酸產(chǎn)量提高了2倍，而紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量更提高了5倍。

除了通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控途經(jīng)酶基因的效率之外，將含啟動(dòng)子的不同基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄方向置于相反的方向，可以有效地避免因?yàn)閱?dòng)子序列相同而導(dǎo)致的基因重組，保證其調(diào)控的基因能有效地轉(zhuǎn)錄[41]。

3.1.3 密碼子優(yōu)化通過(guò)優(yōu)化

FPP形成途徑中的途徑酶的密碼子，顯著增加其表達(dá)，增加底物供應(yīng)，也是一種方法。Anthony等[47]將FPP生物合成途徑中的途徑酶基因進(jìn)行優(yōu)化，由此構(gòu)建的工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量提高明顯。Redding-Johanson等[51]也證實(shí)了通過(guò)優(yōu)化甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶編碼基因而使這兩個(gè)基因在工程菌中的表達(dá)活性上升，導(dǎo)致了紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量的提升。然而，不是所有途徑酶基因優(yōu)化都能得到預(yù)期的效果。Anthony等[47]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲羥戊酸生物合成相關(guān)操縱子以及甲羥戊酸激酶被優(yōu)化后，都會(huì)引起產(chǎn)物上升，而對(duì)MBIS 操縱子進(jìn)行密碼子優(yōu)化，效果不是很明顯。

3.1.4 基因替換

青蒿素是通過(guò)萜類(lèi)途徑提供前體，而萜類(lèi)生物合成途徑廣泛地存在于各種生物中，因此，不同生物中存在各種不同的萜類(lèi)生物合成相關(guān)的酶基因，不同生物中的同工酶作用也有強(qiáng)弱之分，為了增加重構(gòu)的代謝途徑中的酶的催化效率，使用活性更強(qiáng)的同工酶替換原來(lái)代謝途徑中的酶也是提高蛋白表達(dá)豐度，增強(qiáng)其催化效率，進(jìn)而提高底物供應(yīng)的一種方法。由于代謝途徑中積累過(guò)多的HMG-CoA會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)，不利于目的產(chǎn)物的制備，為了將更多的HMG-CoA引入青蒿素生物合成特異途徑，2011年Ma等[54]對(duì)該工程菌中甲羥戊酸合成模塊中的HMGR基因元件進(jìn)行功能替代分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用來(lái)自Delftia acidovorans的HMGR基因元件替代原代謝途徑中的HMGR元件后，引起HMG-CoA含量上升，從而提高AD產(chǎn)量。Tsuruta等[40]進(jìn)一步對(duì)該工程菌進(jìn)行研究表明，當(dāng)用來(lái)自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的HMGR和HMGS兩個(gè)基因元件取代工程菌中甲羥戊酸代謝模塊中的HMGR和HMGS元件后，該工程菌中紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量也會(huì)顯著上升。

3.1.5 增加輔酶數(shù)量

萜類(lèi)生物合成途徑中有許多酶發(fā)揮作用都需要輔酶的參與，增加這些輔酶的數(shù)量也能顯著提高途徑酶的催化效率。Ma等[54]的實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)增加HMGR輔酶NADH的數(shù)量，能顯著提高HMGR的催化效率，促使更多的HMG-CoA生物合成AD。

3.1.6 選擇不同的區(qū)室

這種策略主要針對(duì)以植物為底盤(pán)細(xì)胞的合成生物學(xué)研究。植物中存在兩條萜類(lèi)生物合成途徑，細(xì)胞質(zhì)中主要是 MVA途徑發(fā)揮作用，而質(zhì)體主要通過(guò)MEP途徑供應(yīng)前體，在這兩條途徑的作用下，在不同的區(qū)室形成了含量有差異的萜類(lèi)前體池。當(dāng)將不同的萜類(lèi)生物合成途徑導(dǎo)向不同的區(qū)室時(shí)，由于前體供應(yīng)的差異，使得萜類(lèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量也有很大不同。Wu等[66]通過(guò)研究表明，導(dǎo)向質(zhì)體的紫穗槐-4,11-二烯代謝途徑產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量比導(dǎo)向細(xì)胞質(zhì)中的紫穗槐-4,11-二烯代謝途徑產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量高40000倍，達(dá)到了25 μg·g-1鮮重。隨后，Zhang等[68]的實(shí)驗(yàn)也支持了這個(gè)結(jié)論。Farhi等[70]的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，導(dǎo)向線粒體的青蒿素代謝途徑產(chǎn)生的青蒿素和紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量比導(dǎo)向細(xì)胞質(zhì)中的青蒿素代謝途徑產(chǎn)生的青蒿素和紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量都要高，而且增加的幅度很大。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選擇合適的區(qū)室對(duì)于達(dá)成通過(guò)合成生物學(xué)規(guī)?；苽淝噍锼丶捌渲虚g體的目的具有很重要的意義。

3.1.7 優(yōu)化或平衡多基因控制的代謝途徑

提高途徑酶基因的表達(dá)，確實(shí)能改善其催化效率，然而對(duì)于多基因控制的整條代謝途徑而言，局部的改善產(chǎn)生的效果并不理想。局部的改善往往導(dǎo)致代謝中間產(chǎn)物的積累，進(jìn)而使細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致毒性，抑制其生長(zhǎng)，不利于代謝目的產(chǎn)物的獲得。Keasling課題組在對(duì)2003年構(gòu)建的大腸桿菌工程菌進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)甲羥戊酸生物合成模塊，會(huì)導(dǎo)致HMG-CoA積累，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，反而不利于目的產(chǎn)物的產(chǎn)生。而增加HMG-CoA還原酶的拷貝數(shù)，消耗過(guò)多的HMG-CoA能恢復(fù)細(xì)胞的生長(zhǎng)，這種現(xiàn)象說(shuō)明平衡異源代謝流對(duì)于提高工程菌中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量至關(guān)重要[46]。Pfleger等[53]構(gòu)建一種基于基因間隔區(qū)（intergenic regions）文庫(kù)的篩選方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)操縱子多個(gè)基因協(xié)同調(diào)控，解決異源代謝途徑的平衡問(wèn)題。綜上所述，通過(guò)代謝流控制分析[48,49]，實(shí)現(xiàn)代謝途徑平衡運(yùn)行，進(jìn)而有效地高產(chǎn)制備目的產(chǎn)物是青蒿素合成生物學(xué)的終極目標(biāo)之一。

3.2 通過(guò)“節(jié)流”方式增加前體供應(yīng)

除了增加FPP的絕對(duì)供應(yīng)總量之外，減少FPP池中的前體流入其他倍半萜代謝途徑，促使相對(duì)更多的前體流入青蒿素及其中間體生物合成的特異途徑也是有效提高其產(chǎn)量的方法。這些節(jié)流措施主要包括抑制或下調(diào)競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑，從而限制或減少流入競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑中的FPP供應(yīng)。如為了提高進(jìn)入青蒿酸生物合成途徑的FPP的流量，Ro等[22]和Paradise等[58]都通過(guò)下調(diào)競(jìng)爭(zhēng)性甾體合成途徑中的ERG9基因的表達(dá)，減少進(jìn)入甾體生物合成途徑中的FPP代謝流，從而相對(duì)增加進(jìn)入青蒿酸生物合成途徑的FPP流量，進(jìn)而增加目的產(chǎn)物紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的產(chǎn)量。Lenihan等[42]的實(shí)驗(yàn)也證明，下調(diào)ERG9基因的表達(dá)，確實(shí)能增加代謝產(chǎn)物青蒿酸的產(chǎn)量。

3.3 提高底物利用效率

提高了底物的供應(yīng)量，并不一定能顯著提高工程化底盤(pán)細(xì)胞中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。要想使底物數(shù)量的變化在產(chǎn)物產(chǎn)量上有所體現(xiàn)，關(guān)鍵還是取決于重構(gòu)的代謝途徑對(duì)底物的利用效率。在青蒿素代謝途徑中，底物利用主要通過(guò)青蒿素生物合成特異途徑來(lái)完成。因此，工程化底盤(pán)細(xì)胞能否獲得高產(chǎn)的目的代謝產(chǎn)物，取決于青蒿素生物合成特異途徑的效率。提高青蒿素生物合成特異途徑中的途徑酶效率，主要通過(guò)兩種方式，即提高單個(gè)基因效率和優(yōu)化平衡整條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。對(duì)于單個(gè)基因效率的提高，主要采取增加基因拷貝數(shù)、密碼子優(yōu)化、強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控和融合基因等方式。對(duì)于代謝途徑的平衡優(yōu)化，主要采用一種基于全局的數(shù)學(xué)算法和生物信息分析，如代謝流控制分析。相對(duì)于單個(gè)基因效率的提高，整條代謝途徑的平衡優(yōu)化顯得更為困難和復(fù)雜，對(duì)最終產(chǎn)物產(chǎn)量的影響也是最深刻和直接的。

3.3.1 增加基因拷貝數(shù)

增加代謝途徑中目的基因拷貝數(shù)，通過(guò)過(guò)表達(dá)該基因能有效地增加產(chǎn)物的產(chǎn)量。Lindahl等[57]和Kong等[56,63]都證明，增加釀酒酵母工程菌中ADS基因的拷貝數(shù)，能提高紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量。Anthony等[47]的實(shí)驗(yàn)也表明，減少工程菌中ADS基因的拷貝數(shù)，紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量也會(huì)因此而顯著降低。

3.3.2 密碼子優(yōu)化

采用宿主偏愛(ài)的密碼子，減少或避免使用稀有密碼子是提高途徑酶基因異源表達(dá)水平的重要手段。為了增加紫穗槐-4,11-二烯合酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)，Martin等[44]將ADS基因突變成用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子表示的序列，并將其導(dǎo)入大腸桿菌，對(duì)獲得的工程菌進(jìn)行發(fā)酵表明，ADS的表達(dá)顯著增強(qiáng)，產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量明顯提高。

Kong等[61]通過(guò)連續(xù)重疊PCR的方法，獲得了完全用釀酒酵母偏愛(ài)密碼子表示的ADS基因，含有該基因的酵母工程菌產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量比對(duì)照提高了10～20倍。該結(jié)果再次表明，優(yōu)化途徑酶基因的密碼子是有效改善其表達(dá)水平的途徑之一。然而，如果將參與青蒿酸生物合成的3個(gè)基因ADS、CYP71AV1和CPR都采用釀酒酵母偏愛(ài)密碼子表示的序列，這樣構(gòu)建的工程菌產(chǎn)生的青蒿酸產(chǎn)量沒(méi)有顯著變化，上述結(jié)果說(shuō)明，多個(gè)基因優(yōu)化并不是多個(gè)單一基因優(yōu)化的簡(jiǎn)單總和，詳細(xì)的機(jī)制目前并不清楚[41]。

3.3.3 啟動(dòng)子修飾

除了使用強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控途徑酶基因的表達(dá)外，為了減少異源多基因控制的代謝途徑在底盤(pán)細(xì)胞中發(fā)生基因重組而導(dǎo)致基因沉默的情況發(fā)生，將構(gòu)成同一代謝途徑的不同基因通過(guò)不同的啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控能有效地規(guī)避這個(gè)不利現(xiàn)象的發(fā)生。Farhi等[70]利用不同的啟動(dòng)子和終止子對(duì)青蒿素生物合成途徑酶基因進(jìn)行調(diào)控，在煙草細(xì)胞中有效地合成出了青蒿素。

3.3.4 基因替換

Chang等[52]的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)CYP71AV1的N 末端跨膜序列被假絲酵母（Candida tropicalis）的P450跨膜序列取代時(shí)，或者CYP的N末端跨膜序列被假絲酵母的CPR跨膜序列取代時(shí)，工程菌中代謝產(chǎn)物出現(xiàn)了差異。

3.3.5 增加基因之間的偶聯(lián)效率

在青蒿素生物合成途徑中，P450氧化酶CYP71AV1及其電子配偶體CPR的偶聯(lián)對(duì)代謝途徑的影響比較顯著。Zhang等[68]在N.tabacum中導(dǎo)入了青蒿素生物合成相關(guān)的基因：FPPS、ADS、CYP71AV1和Dbr2，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草中積累青蒿醇和二氫青蒿醇，并沒(méi)有檢測(cè)到預(yù)計(jì)的青蒿酸和二氫青蒿酸的生成。據(jù)此推斷，煙草的內(nèi)環(huán)境更適于醛的還原，而且植物內(nèi)生的乙醇脫氫酶活性要強(qiáng)于CYP71AV1的青蒿醇和青蒿醛氧化酶活性，從而促使CYP71AV1氧化形成的青蒿醛還原成青蒿醇，或者將Dbr2催化形成的二氫青蒿醛還原成二氫青蒿醇。另外Farhi等[70]也利用了N.tabacum進(jìn)行了合成青蒿素及其中間體的嘗試，他們?cè)贜.tabacum中除了導(dǎo)入上述4個(gè)基因之外，還導(dǎo)入HMGR和CPR兩個(gè)基因，結(jié)果表明，通過(guò)這種方式構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因煙草中制備出了青蒿素。在這種植物工程系統(tǒng)中，HMGR的導(dǎo)入主要是增加前體的供應(yīng)，而導(dǎo)致產(chǎn)物出現(xiàn)差異的一個(gè)重要原因是CPR基因的導(dǎo)入。CPR的導(dǎo)入增加了和CYP71AV1的偶聯(lián)效率，提高了它的氧化效率，有利于氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，進(jìn)而形成青蒿素。這個(gè)結(jié)論在Chang等[52]的實(shí)驗(yàn)中也得到了佐證。Chang等在利用E.coli 制備青蒿酸的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CYP71AV1和CPR的偶聯(lián)效率要強(qiáng)于CYP71AV1與異源CPR的偶聯(lián)效率，導(dǎo)入了CYP71AV1和CPR的E.coli工程菌產(chǎn)生的青蒿醇產(chǎn)量提高了12倍。

3.3.6 質(zhì)粒替換

質(zhì)粒作為基因的載體被導(dǎo)入不同的工程化細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)多基因控制通路的重構(gòu)與優(yōu)化。因此，質(zhì)粒自身的性質(zhì)對(duì)工程化細(xì)胞中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量也會(huì)有顯著的影響。Chang等[52]的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)將CYP71AV1克隆pETDUET-1中時(shí)，會(huì)導(dǎo)致CYP71AV1表達(dá)效率降低，從而影響CYP71AV1 的功能，發(fā)酵產(chǎn)物中只能檢測(cè)到青蒿醇。而將CYP71AV1克隆到pCWori中時(shí)，CYP71AV1的氧化效率顯著增加，直接表現(xiàn)就是青蒿醛和青蒿酸出現(xiàn)在發(fā)酵產(chǎn)物中。

此外，工程菌中質(zhì)粒之間的兼容性對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)量也具有很大的影響[47]。

3.3.7 底盤(pán)細(xì)胞替換

作為天然產(chǎn)物的生產(chǎn)場(chǎng)所，底盤(pán)細(xì)胞性質(zhì)的差異對(duì)目的產(chǎn)物也會(huì)造成非常大的影響，主要體現(xiàn)在產(chǎn)量和性質(zhì)兩個(gè)方面。除了在分類(lèi)上屬于不同界的底盤(pán)細(xì)胞，如植物、釀酒酵母和大腸桿菌產(chǎn)生的產(chǎn)物會(huì)出現(xiàn)差異之外，同一個(gè)種的底盤(pán)細(xì)胞，即便只是基因型出現(xiàn)差異，產(chǎn)生目的產(chǎn)物的能力也會(huì)顯著不同。Chang等[52]的實(shí)驗(yàn)表明，和DH10B相比，采用DH1作為宿主菌，能顯著增加紫穗槐-4,11-二烯的的氧化效率。

3.4 優(yōu)化培養(yǎng)和生產(chǎn)條件

除了對(duì)青蒿素代謝途徑自身進(jìn)行優(yōu)化外，培養(yǎng)條件對(duì)工程菌中青蒿素及其前體的產(chǎn)量也有相當(dāng)大的影響。根據(jù)紫穗槐-4,11-二烯容易揮發(fā)的特點(diǎn)，Keasling實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為2003年的實(shí)驗(yàn)有可能低估了紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量[44]，因此，他們利用兩相分配生物反應(yīng)器（two-phase partitioning bioreactor，TPPB）來(lái)制備紫穗槐-4,11-二烯，結(jié)果表明，加入有機(jī)相后，紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量顯著增加，達(dá)到0.48 g·L-1[45]。但這種兩相分配生物器不是對(duì)所有青蒿素及其中間體工程菌的發(fā)酵都適用，Chang等[52]在發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌工程菌生產(chǎn)青蒿酸時(shí)發(fā)現(xiàn)，去掉有機(jī)相覆蓋層，會(huì)顯著促進(jìn)青蒿酸產(chǎn)量上升，這就表明任何一個(gè)外界條件都有一定的適用范圍，條件優(yōu)化應(yīng)該根據(jù)對(duì)象進(jìn)行設(shè)計(jì)。

考慮到二氫青蒿酸通過(guò)光氧化能自發(fā)地形成青蒿素，F(xiàn)arhi等[70]在培養(yǎng)導(dǎo)入了ADS、tHMGR、CYP71AV1、CPR和DBR2 5個(gè)基因的植物細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)時(shí)，采用強(qiáng)光培養(yǎng)的方式，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草在強(qiáng)光條件下，確實(shí)能將由上述5個(gè)酶催化形成的二氫青蒿酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生青蒿素。

除了上述培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基的成分對(duì)工程菌發(fā)酵也會(huì)產(chǎn)生重大的影響。Martin等[44]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加甘油，會(huì)增加工程菌的生物量和紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量。Westfall等[41]證明，將乙醇和葡萄糖作為培養(yǎng)基的混合碳源時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量顯著增加。而將碳源變成半乳糖時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中的青蒿酸產(chǎn)量上升明顯[42]。此外，對(duì)工程菌進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，對(duì)氮源和碳源進(jìn)行限制[40]，或者對(duì)葡萄糖和磷酸鹽進(jìn)行限制[41]，都能有效增加工程菌的生物量，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。

這些結(jié)果說(shuō)明提高人工系統(tǒng)制備目的天然產(chǎn)物的能力，必須采用“內(nèi)因”和“外因”協(xié)調(diào)優(yōu)化的方式，即既要對(duì)代謝途徑進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化，又必須有針對(duì)性的優(yōu)化培養(yǎng)條件，只有這樣，才能以最優(yōu)的方式將工程菌中目標(biāo)代謝物的產(chǎn)量提高到工業(yè)化的水平。

從上面可以看到，經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展，通過(guò)底盤(pán)細(xì)胞生產(chǎn)青蒿素及其中間體無(wú)論從理論上還是物質(zhì)上都已經(jīng)準(zhǔn)備充分。網(wǎng)絡(luò)上早就有賽諾菲-安萬(wàn)特公司開(kāi)始利用工程酵母制備青蒿素的報(bào)道，意味著合成生物學(xué)制備的青蒿素正式走向生產(chǎn)。

4 小結(jié)

通過(guò)合成生物學(xué)制備青蒿素及其中間體的成功，無(wú)論對(duì)青蒿素本身還是對(duì)未來(lái)天然藥物的生產(chǎn)格局都會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。通過(guò)合成生物學(xué)制備青蒿素，不受環(huán)境和土地的制約，能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的青蒿素，能穩(wěn)定世界市場(chǎng)上青蒿素的供應(yīng)，有效地降低青蒿素的價(jià)格，有利于控制瘧疾在貧困國(guó)家的肆虐。青蒿素是醫(yī)藥界的“重磅炸彈”，通過(guò)合成生物學(xué)制備青蒿素的成功，其意義可能不止每年幾十億元的銷(xiāo)售額。首先，它對(duì)其他稀缺藥物的綠色制備具有借鑒意義，能有效地推動(dòng)天然藥物的可持續(xù)發(fā)展、能引領(lǐng)其他天然藥物的綠色制備，更重要的是通過(guò)合成生物學(xué)制備青蒿素的成功經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)能移植到其他化工產(chǎn)品、能源和材料的合成生物學(xué)研究中，能有效地緩解由于人口劇增帶來(lái)的土地供應(yīng)問(wèn)題以及由于化學(xué)合成及土地施肥造成的環(huán)境污染問(wèn)題，對(duì)于建設(shè)“綠色中國(guó)”和“綠色世界”的目標(biāo)都具有非常重要的意義。

摘編自《藥學(xué)學(xué)報(bào)》2013年2期：193～205頁(yè)，圖、表、參考文獻(xiàn)已省略。