青蒿素對(duì)大鼠心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)的影響及其機(jī)制研究

鄭武揚(yáng)，李衛(wèi)華，謝強(qiáng)，黃崢嶸，萬曉群

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廈門361000）

青蒿素對(duì)大鼠心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)的影響及其機(jī)制研究

鄭武揚(yáng)，李衛(wèi)華，謝強(qiáng)，黃崢嶸，萬曉群

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廈門361000）

惡性室性心律失常（室性心動(dòng)過速，室速；心室顫動(dòng)，室顫）是心梗后患者死亡的主要原因，約占心梗后患者死亡的一半以上[1]。心梗后交感神經(jīng)的過度再生，在心梗后的室性心律失常的發(fā)生中起著重要的作用，為心梗后惡性心律失常的發(fā)生提供了電學(xué)基質(zhì)[2]。因此，有效地抑制心梗后交感神經(jīng)過度再生，可能是預(yù)防和治療心梗后心律失常的有效途徑之一。

目前，有關(guān)心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)的機(jī)制還不是很清楚。但是，有證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)在心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)的過程中起著重要作用[3-4]。研究顯示炎癥細(xì)胞合成神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF），而且炎癥細(xì)胞聚集的區(qū)域，交感神經(jīng)再生明顯，其密度顯著高于其它區(qū)域[5-6]。此外，有學(xué)者相繼報(bào)道，心梗后給予抗炎治療可以顯著減緩交感神經(jīng)重構(gòu)[7]。這些研究結(jié)果均表明，抑制炎癥反應(yīng)可能是減緩心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)的有效途徑之一。

青蒿素是一種從菊科植物黃花蒿中提取的具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，是世界衛(wèi)生組織公認(rèn)的抗瘧疾藥物[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素除了抗瘧疾之外，還存在其它生物學(xué)作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥、抗纖維化等[9]。鑒于青蒿素具有抑制NF-κB活性抗炎癥等生物學(xué)作用，猜測(cè)其可能具有抗心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)的生物學(xué)作用。本文通過研究青蒿素對(duì)大鼠心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)的作用并探索其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠（購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）合格證號(hào)601036，體質(zhì)量為250～300 g。本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材：小型動(dòng)物呼吸機(jī)，江西省特立麻醉呼吸設(shè)備有限公司LEAD-2000B 32；導(dǎo)電生理記錄儀，四川錦江電子設(shè)備有限公司；MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)，美國(guó)Millipore有限公司；電泳轉(zhuǎn)膜裝置，美國(guó) Bio-Rad有限公司；熒光倒置顯微鏡，德國(guó)Leica有限公司；VL凝膠成像分析系統(tǒng)，法國(guó)；蛋白印跡雜交系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad有限公司；Olympas BX60光學(xué)顯微鏡，日本Olympas有限公司；冰凍超高速離心機(jī)，德國(guó)Heraeus有限公司。

1.1.3 主要試劑：戊巴比妥鈉凍干粉，美國(guó) Sigma公司 RNA抽提試劑盒（Trizol），北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；青蒿素（H10970338），廣西制藥廠羧甲基纖維素鈉（GB2760-2011），山東江北化工有限公司；RT-PCR試劑盒，美國(guó)Biosystem公司；GAP43兔抗大鼠多克隆抗體，美國(guó)Invitrogen公司；TH兔抗大鼠多克隆抗體，美國(guó)Sigma公司；NGF兔抗大鼠多克隆抗體，美國(guó) Sigma公司；小鼠抗白介素 1β抗體，Abcam小鼠抗腫瘤壞死因子 α，Abcam抗 β-actin抗體。IL-1β的引物序列：F：5’-GGGATGATGACGACCTGC-3’，R：5’-CCACTTGTTGGCTTATGTT-3’；TNF-α的引物序列：F：5’-GCCACCACGCTCTTCTGTC-3’，R:5’GCTACGGGCTTGTCACTCG-3’； GAPDH 的 引 物 序 列 ： F： 5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’， R：5’-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3’。

1.2 方法

1.2.1 分組造模：70只大鼠隨機(jī)分成3組，假手術(shù)組10只，心梗組30只，心梗治療組30只。

大鼠心梗模型的造模步驟：大鼠按照30 mg/kg的劑量腹腔注射10%戊巴比妥鈉；麻醉成功后將其四肢用橡皮筋固定于自制的手術(shù)臺(tái)上，用小剪刀減去頸部和胸部的毛，四肢連接多道電生理記錄儀電極，行心電監(jiān)護(hù)；鈍性分離頸部肌肉，暴露氣管，將自制的氣管插管針插入氣管；將氣管插管與小型動(dòng)物呼吸機(jī)相連接，調(diào)節(jié)潮氣量12 mL，呼吸比2∶1，頻率70次/分；手術(shù)刀片沿左側(cè)胸骨切開皮膚，傷口長(zhǎng)約2.5 cm，鈍性分離胸大肌，直至暴露肋骨，用2把止血鉗將第4～5根肋骨咬斷，注意防止肋間動(dòng)脈出血，用開瞼器將其撐開；用小剪刀剪開心包膜，充分暴露心臟；用棉簽從左心耳處將心臟挑起，從肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，距離左心耳根部約2 cm處，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，進(jìn)針深度約0.5 mm，以6/0縫線穿過肌層，針尖穿出后小心抽出針，結(jié)扎縫線，觀察心電圖的變化，結(jié)扎線以下區(qū)域可見顏色變白，心肌收縮減慢，同時(shí)Ⅰ導(dǎo)聯(lián)aVL導(dǎo)聯(lián)ST段向上抬高，大于0.2 mV，并且可見頻發(fā)的室性心律失常，以上提示結(jié)扎成功。留置排氣導(dǎo)管置入心臟胸腔，逐層縫合肌肉和皮膚，用注射器抽吸胸腔內(nèi)的積血和空氣，最后拔除導(dǎo)管。術(shù)后腹腔注射青霉素40萬單位，肌注1周；假手術(shù)組，開胸暴露心臟的方法同前，冠脈前降支下穿過結(jié)扎線，不縫合。

給藥途徑和時(shí)間：大鼠心梗后24 h，青蒿素溶解在0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，心梗治療組按75 mg/（kg·d）的劑量分3次灌胃大鼠，每次間隔1天。心梗組和假手術(shù)組給予等量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，持續(xù)時(shí)間為4周，后將動(dòng)物處死并按需要取材。

心梗面積計(jì)算：Masson染色后，心肌梗死區(qū)全部是膠原纖維，呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞被染成紅色。病理專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0，計(jì)算左室梗死面積（梗死面積 = 梗死區(qū)心內(nèi)膜長(zhǎng)度/整個(gè)左心室心內(nèi)膜長(zhǎng)度）。

1.2.2 蛋白免疫印跡分析IKBα蛋白的表達(dá)：將150 mg左右的心肌組織放入勻漿器，同時(shí)加入組織裂解液1 mL，組織勻漿器徹底勻漿，4℃條件下，12000 r/min的速度離心15 min，將其上清液保存在－70℃條件下備用；加5 μL樣品到96孔板樣品孔，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20 μL；各孔中加入200 μL G250染色液，混勻后，室溫下放置5 min；運(yùn)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A595時(shí)的吸光值，并且該值作為Y軸，而蛋白濃度作為X軸，繪制曲線，根據(jù)曲線計(jì)算樣品中蛋白濃度；SDS-PAGE電泳，200 mA 橫流轉(zhuǎn)膜，30～40 min；將NC膜放入TBST稀釋的一抗中，在4℃條件下孵育過夜；TBST洗膜，每次10 min，共3次；將NC膜放入TBST稀釋的二抗中，在4℃條件下孵育過夜；TBST洗膜，每次10 min，共3次；將ECL顯影液（等量混合），孵育5 min（室溫下），準(zhǔn)備好保鮮膜和膠片（暗房里操作），準(zhǔn)備曝光，曝光結(jié)束后取下膠片，顯影定影各5 min，最后用自來水沖洗。蛋白免疫印跡定量分析：凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描，Bandscan 軟件對(duì)圖像條帶作半定量分析，以內(nèi)參β-actin的條帶吸光值作為參考標(biāo)準(zhǔn)。目的條帶和β-actin的條帶吸光值的比值作為鈣蛋白表達(dá)相對(duì)量。

1.2.3 免疫組織化學(xué)分析 TH和GAP43染色的陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度：心肌組織標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛浸泡后，石蠟包埋處理，5 μm厚度切成片；對(duì)組織進(jìn)行脫蠟，切好的組織切片進(jìn)行水化；3%的雙氧水，室溫下滅活5～10 min，蒸餾水沖洗3次；用正常血清工作液封閉，將內(nèi)源性過氧化物酶活性滅活，室溫條件下孵育10 min；將血清甩去，滴加GAP43指標(biāo)的兔抗大鼠抗體GAP43，0.05 mL，37℃條件下孵育2 h；PBS洗涮3次，每次約3～5 min；滴加稀釋10倍二抗生物素標(biāo)記羊抗兔IgG10%，0.05 mL，37℃條件下孵育10～15min；PBS洗3次，每次約3～5 min；滴加辣根酶鏈霉素工作液，37℃條件下孵育10～15 min；PBS洗3次，每次約3～5 min；DAB顯色；自來水沖洗；蘇木素染色；梯度酒精脫水；二甲苯透明處理；最后用中性塑膠來封片；最后，對(duì)TH和GAP43染色的陽(yáng)性神經(jīng)纖維進(jìn)行密度分析，其具體方法參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 NGF蛋白表達(dá)檢測(cè)：使用免疫組化SABC方法檢測(cè)、心肌組織炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平用RTPCR檢測(cè)，取心肌組織100 mg剪碎，用Trizol法提取總RNA。按照試劑說明進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-CT方法分析目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。免疫組織化學(xué)檢測(cè)梗死周邊區(qū)巨噬細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 心梗模型與心梗面積

心梗后4周，假手術(shù)組死亡1只，存活率為90%；心梗組死亡18只，存活率為40%；心梗治療組死亡10只，存活率67%。經(jīng)Masson染色和病理分析，心梗組和心梗治療組心梗面積分別為（34.50 ± 2.36）%、（33.77 ± 4.05）%，心梗組和心梗治療組之間的心梗面積沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 交感神經(jīng)纖維的分布和密度

本研究觀察青蒿素對(duì)大鼠心梗后GAP43和TH陽(yáng)性交感神經(jīng)纖維的分布及密度。研究發(fā)現(xiàn)心梗后梗死周邊區(qū)，GAP43和TH陽(yáng)性交感神經(jīng)纖維分布紊亂，直徑粗亂，纖維密度高，見圖1。心梗組與假手術(shù)組相比，GAP43和TH陽(yáng)性交感神經(jīng)纖維密度顯著增加（P<0.05）。心梗治療組GAP43和TH陽(yáng)性交感神經(jīng)纖維密度比心梗組顯著降低（P<0.05），見表1。

2.3 RT-PCR檢測(cè)心肌組織炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平

青蒿素具有抗炎癥的作用，本研究通過RTPCR檢測(cè)梗死周邊區(qū)心肌組織炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平。研究表明，與假手術(shù)組相比，心梗組梗死周邊區(qū)TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平顯著增加（P<0.05），與心梗組相比，心梗治療組炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），見表2。

2.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)IKBα蛋白的表達(dá)

心梗后4周，本研究通過蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)梗死周邊區(qū)IKBα蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心梗組IKBα蛋白比假手術(shù)組要高（P<0.05），青蒿素治療可以顯著減小IKBα蛋白表達(dá)（P<0.05），見表3。

2.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)NGF、GAP43、TH蛋白的表達(dá)

心梗后4周，心梗組梗死周邊區(qū)NGF蛋白的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，青蒿素治療可以顯著減少NGF蛋白的表達(dá)水平。心梗組梗死周邊區(qū)的心肌組織中GAP43和TH蛋白表達(dá)含量顯著高于假手術(shù)組，而青蒿素治療后表達(dá)顯著減少（P<0.05），見圖2、表4。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)梗死周邊區(qū)巨噬細(xì)胞數(shù)目

巨噬細(xì)胞在心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)中起重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)心梗后4周，梗死周邊區(qū)巨噬細(xì)胞數(shù)目比假手術(shù)組高，而青蒿素治療可以有效降低梗死周邊區(qū)巨噬細(xì)胞數(shù)目（P<0.05），見圖3、表5。

3 討論

青蒿素是一種從菊科植物黃花蒿中提取的具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，是世界衛(wèi)生組織公認(rèn)的抗瘧疾藥物[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素除了抗瘧疾之外，還存在其它生物學(xué)作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥、抗纖維化等[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素抑制大鼠心梗后交感神經(jīng)再生，同時(shí)緩減心梗后梗死周邊區(qū)炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)生長(zhǎng)因子以及炎癥介質(zhì)的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素治療可以顯著減少心梗后梗死周邊區(qū)炎癥因子的表達(dá)和炎癥細(xì)胞的數(shù)目，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)青蒿素治療可以抑制核因子KB的激活，主要通過抑制IKB蛋白的磷酸化。炎癥細(xì)胞在心梗后NGF的合成中起著重要的作用[13-15]。Hasan等研究發(fā)現(xiàn)梗死周邊區(qū)NGF表達(dá)顯著高于非梗死區(qū)，而且梗死周邊巨噬細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞數(shù)目很高，這些結(jié)果提示炎癥細(xì)胞可能是NGF的重要來源[3]。而本研究發(fā)現(xiàn)心梗后4周，青蒿素治療組梗死周邊區(qū)心肌組織的NGF濃度和巨噬細(xì)胞數(shù)目都顯著低于對(duì)照組。這些結(jié)果表明，青蒿素降低心肌組織中的NGF濃度可能是通過減少心肌組織中巨噬細(xì)胞數(shù)目實(shí)現(xiàn)的。青蒿素治療可以顯著緩減梗死周邊區(qū)交感神經(jīng)再生降低梗死周邊區(qū)心肌組織中NGF的濃度，這些結(jié)果提示抑制心梗后心肌組織中NGF的表達(dá)可能是青蒿素減緩心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)的主要機(jī)制。

綜上所述，本研究首次報(bào)道青蒿素可以抑制心梗后交感神經(jīng)重構(gòu)，而且其機(jī)制可能是通過抑制心梗后炎癥反應(yīng)，該研究為臨床運(yùn)用青蒿素治療心梗后交感神經(jīng)過度再生提供了理論依據(jù)。鑒于交感神經(jīng)重構(gòu)與心律失常的發(fā)生密切相關(guān)，因此我們推測(cè)青蒿素可能為臨床治療心梗后惡性室性心律失常提供了新的選擇。

摘編自《中國(guó)生化藥物雜志》2015年第1期：81～84頁(yè)，圖、表、參考文獻(xiàn)已省略。