兩株極地真菌次級代謝產(chǎn)物的研究

閆凝星 方莎莎 劉靖堂 盧小玲 劉小宇 焦炳華

(第二軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433)

0 引言

由于生長環(huán)境特殊，極地微生物具有特異的遺傳和代謝特性，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、生理活性獨特的新型次級代謝產(chǎn)物，近年來已成為極地天然產(chǎn)物研究的活躍領(lǐng)域［1-2］。

Articulosporasp.主要分布在赤楊木，菩提樹，橡樹等的樹葉分解物［3-6］。中國極地研究中心發(fā)現(xiàn)Articulosporasp.能產(chǎn)生 β-葡萄糖苷酶［7］，日本學(xué)者 Hirosuke Sugahara從Articulosporasp.發(fā)酵液中提取到Art1，它是一種組氨酸激酶抑制劑，IC50為9.5 μM［8］。目前對Articulosporasp.的研究主要集中在生態(tài)學(xué)、物種多樣性上，而對其在天然產(chǎn)物方面的研究很少。

目前關(guān)于青霉屬天然產(chǎn)物的研究報道較多，它們的次級代謝產(chǎn)物包括生物堿，聚酮，青霉素衍生物，萜類，大環(huán)內(nèi)酯類等，并具有抗菌、抗腫瘤、抑制蛋白酪氨酸磷酸酶等廣泛的生物學(xué)功能［9-11］。

本實驗室前期對中國極地研究中心提供的兩株極地真菌Articulosporasp.Z1-1和Penicilliumsp.S-1-10的粗提物進(jìn)行的生物學(xué)活性預(yù)試表明，其發(fā)酵產(chǎn)物具有抗細(xì)菌活性，并對多種腫瘤細(xì)胞株具有抑制活性。在此基礎(chǔ)上，本文展開了這兩株極地真菌的發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分研究，以期得到結(jié)構(gòu)新穎的具有生物學(xué)活性的化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

1.1.1 儀器與材料

600 MHz核磁共振波譜儀，Bruker公司;Agilent 1100型高效液相色譜儀，Agilent G1315BDAD檢測器，安捷倫公司;6538 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，安捷倫公司;LC3000半制備高效液相色譜儀，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司;ZQZY-C振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司;減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA公司;薄層色譜硅膠(涂層厚度:0.20±0.3 mm，硅膠粉粒度:8±2μm≥80%，TLC:10-40μm)和柱層層析硅膠(硅膠粉粒度:8±2μm≥80%)，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司;ODS反相硅膠層析填料，Merck公司;Sephadex LH-20凝膠層析填料，GE公司。

1.1.2 菌株

真菌菌株Z1-1分離于北極高緯度土壤樣品，由中國極地研究中心提供，經(jīng)PDA培養(yǎng)后菌落呈棕黃色絨毛狀，無孢子形成，經(jīng)18S rDNA序列測定及Blast分析比對后鑒定為節(jié)枝孢屬(Articulospora)真菌［7］，菌種保存于第二軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室。

真菌菌株S-1-10分離于南極高緯度土壤樣品，由中國極地研究中心提供，經(jīng)PDA培養(yǎng)后菌落呈黃綠色，并有孢子形成，經(jīng)18S rDNA序列測定及Blast分析比對后鑒定為青霉屬(Penicillium)真菌(未發(fā)表數(shù)據(jù))，菌種保存于第二軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑

PDB培養(yǎng)基，由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。(GPY+NaCl 1%)培養(yǎng)基即葡萄糖10 g，胰蛋白胨2 g，酵母粉1 g，NaCl10 g，蒸餾水1 000 mL，其中胰蛋白胨和酵母粉由英國OXOID公司提供，其他化學(xué)試劑皆由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供?？偪寡趸噭┖杏杀淘铺焐锛夹g(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)與發(fā)酵

1.2.1.1 菌株Articulosporasp.Z1-1的培養(yǎng)與發(fā)酵

種子培養(yǎng):挑取菌株 Z1-1菌絲體接種于裝80 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在25℃，80 rpm條件下振蕩培養(yǎng)4 d。

大批發(fā)酵:種子液按2%的接種量，接種于裝有600 mL PDB培養(yǎng)基的2 L搖瓶中，在25℃，80 rpm條件下振蕩培養(yǎng)1 d后靜置27 d，共發(fā)酵28 d。經(jīng)大批發(fā)酵，獲得真菌Articulosporasp.Z1-1發(fā)酵液共72 L。

1.2.1.2 菌株P(guān)enicilliumsp.S-1-10的培養(yǎng)與發(fā)酵

種子培養(yǎng):挑取菌株S-1-10菌絲體接種于裝80 mL(GPY+1%NaCl)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在24℃，80 rpm條件下振蕩培養(yǎng)4 d。

大批發(fā)酵:種子液按2%的接種量，接種于裝有500 mL(GPY+1%NaCl)培養(yǎng)基的2 L搖瓶中，在24℃，80 rpm條件下振蕩培養(yǎng)14 d。經(jīng)大批發(fā)酵，獲得真菌Penicilliumsp.S-1-10發(fā)酵液共85.5 L。

1.2.3 菌株粗提物的制備

發(fā)酵液離心后，加入等體積的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相40℃減壓濃縮，共制得Articulosporasp.Z1-1 粗提物 4.5 g，Penicilliumsp.S-1-10粗提物9.3 g。

1.2.4 次級代謝產(chǎn)物的分離

1.2.4.1 菌株Articulosporasp.Z1-1次級代謝產(chǎn)物的分離

發(fā)酵液浸膏首先經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析，氯仿∶甲醇=2∶1為洗脫劑，TLC檢測洗脫進(jìn)程，得到4個組分(Fr.1-Fr.4)。Fr.2通過ODS硅膠柱層析，甲醇-水梯度洗脫，30%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇洗脫，減壓蒸干得30%-2，30%-2經(jīng)正相硅膠柱層析(三氯甲烷∶甲醇)，之后通過制備型薄層硅膠板純化得到化合物1(3 mg)，50%-2經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯)和制備型薄層硅膠板純化，得到化合物2(6.0 mg)、化合物3(9.0 mg)和化合物4(8.0 mg)。Fr.3通過ODS硅膠柱層析，甲醇-水梯度洗脫，50%甲醇洗脫得50%-3，50%-3經(jīng)ODS硅膠柱層析，甲醇-水梯度洗脫，40%甲醇洗脫得到樣品，后經(jīng)正相硅膠柱層析(三氯甲烷∶甲醇)，得到化合物5(6.5 mg)和化合物6(8.1 mg)。

1.2.4.2 菌株P(guān)enicillium.S-1-10次級代謝產(chǎn)物的分離

總浸膏進(jìn)行減壓硅膠柱層析，石油醚-丙酮-二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，收集不同組分，濃縮后經(jīng)TLC檢測合并相同的組分后得到9個組分。其中組分Fr.3經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷-甲醇梯度洗脫)和Sephadex LH-20凝膠柱色譜(二氯甲烷∶甲醇 =2∶1)層析分離得到化合物7(17 mg)。組分Fr.6經(jīng)硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫)和硅膠制備板分離純化得到化合物8(5 mg)和化合物9(4.3 mg)。

1.2.5 核磁共振(NMR)

樣品溶解于適當(dāng)?shù)碾軇┲?，裝入干凈的核磁管中進(jìn)行測試，測試項目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC和 NOESY等。

1.2.6 質(zhì)譜(MS)

分別取少量樣品，用ESI-MS質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。樣品用甲醇溶解，進(jìn)樣量10μL，流動相為乙腈-水溶液。

1.3 生物學(xué)活性測試

1.3.1 化合物的細(xì)胞毒活性測試

采用MTT法［12］測定化合物對6種腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以(4-8)×104·mL-1接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，分別加入終濃度為 100.0、50.0、25.0、12.5、6.2 和3.1μg·mL-1的樣品，對照組選擇終濃度為1%的DMSO，選取阿霉素作為陽性對照并設(shè)置空白對照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入5 mg·mL-1MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO，用酶標(biāo)儀(波長570 nm)測定各孔OD值，計算不同濃度對細(xì)胞生長的抑制率，利用SPSS軟件計算半數(shù)抑制濃度IC50值。

1.3.2 紙片法抗菌活性測試

采用紙片法測定化合物對大腸桿菌(Escherichia coli(25922))，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis(6633))和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus(25923))的抑制作用，樣品用甲醇溶解，氯霉素作為陽性對照，分別加在滅菌烘干的紙片(Φ6 mm)上，每個紙片上樣品的加樣量為50μg，待溶劑揮發(fā)后，置于涂有指示菌的固體瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18 h，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生及抑菌圈直徑大小。

1.3.3 對稻瘟霉(Pyricularia oryzae)P-2b的抑制活性測試［13］

以稻瘟霉分生孢子以及菌絲形態(tài)變化為指標(biāo)，對化合物進(jìn)行活性測試。孢子芽管不萌發(fā)，孢子基本保持原有狀態(tài)為抑制活性，用“o”表示;孢子不萌發(fā)、萌發(fā)或菌絲生長但形態(tài)發(fā)生嚴(yán)重變化為強(qiáng)變形活性，孢子不萌發(fā)、萌發(fā)或菌絲生長，但形態(tài)發(fā)生嚴(yán)重變化，為強(qiáng)變形活性，用“+++”表示;孢子萌發(fā)或菌絲生長，但形態(tài)發(fā)生中等強(qiáng)度的變化，為中等變形活性，用“ ++”表示;菌絲生長，但生長狀態(tài)異常，為弱變形活性，用“+”表示;菌絲正常生長為陰性，用“-”表示。把稻瘟霉菌絲體生長開始受到抑制或不再生長的化合物濃度定義為最低抑菌濃度(MIC)，即稻瘟霉大致呈現(xiàn)“+”狀態(tài)時的濃度(圖1)。

圖1 稻瘟霉孢子/菌絲不同程度抑制/變形圖Fig.1.The different degree inhibition or deformation figure of Pyriculariaoryzae sporule ormycelium

1.3.4 總抗氧化活性測試

采用總抗氧化能力檢測法(ABTS快速法)測定化合物的總抗氧化能力。ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的 ABTS+，在抗氧化物存在時ABTS+的產(chǎn)生會被抑制，在414 nm測定ABTS+的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。陽性對照物是一種維生素E的類似物Trolox，總抗氧化能力定為1，相同濃度情況下，其它物質(zhì)的抗氧化能力用其抗氧化能力和Trolox相比的倍數(shù)來表示。

2 實驗結(jié)果

通過各種分離手段，從兩株極地真菌中共分離得到9個化合物，根據(jù)1D-NMR、2D-NMR和MS實驗數(shù)據(jù)鑒定了化合物1-9的結(jié)構(gòu)(圖2)。

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為黃色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm/z:273［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)， δH:11.8(1H， s)，11.3(1H， s)，7.21(1H，d，J=3.9 Hz)，6.72(1H， d，J=3.9 Hz)，6.64(1H， d，J=3.9 Hz)，6.61(1H，d，J=3.7 Hz)，3.90(3H，s)， 2.73(3H，s);13C-NMR(CD3OD)， δC:138.5(C-1)， 25.0(CH3-1)， 117.6(C-2)，158.5(C-3)，101.6(C-4)，152.6(C-4a)，164.7(C-6)，99.2(C-8)， 166.2(C-9)， 55.8(OCH3-9)， 103.4(C-10)，137.8(C-10a)，108.8(C-10b)。此波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報道的基本一致，故鑒定為 3，7-二羥基-9-甲氧基-1-甲基-苯并［c］色烯-6-酮。

圖2 化合物1-9的結(jié)構(gòu)式Fig.2.The chemical structure of compounds 1-9

化合物2為白色晶體，F(xiàn)eCl3顯紫色。ESI-MSm/z:125 ［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)，δH:6.62(1H，d，J=8.4 Hz)，6.57(1H，m)，6.45(1H，dd， J=8.4 Hz， J=3.6 Hz)，2.09(3H， s);13CNMR(CD3OD)， δC:14.9(CH3-2)，149.6(C-1)，125.1(C-2)，117.0(C-3)，147.9(C-4)， 112.5(C-5)，115.0(C-6)。與文獻(xiàn)［15］報道的波譜數(shù)據(jù)一致，故鑒定為1，4-二羥基甲苯。

化合物3為無色針狀晶體。ESI-MSm/z:125［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)，δH:7.15(1H， t，J=8.4 Hz)，6.80(1H，m)，6.79(1H，m)，6.67(1H，dd，J=7.8 Hz，J=2.4 Hz)， 4.50(2H， s);13CNMR(CD3OD)， δC:156.8(C-1)，114.3(C-2)，142.4(C-3)， 118.2(C-4)，129.1(C-5)，113.6(C-6)，64.0(C-7)。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］報道的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為間羥基芐醇。

化合物4為白色晶體。ESI-MSm/z:139［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)， δH:7.05(2H， d，J=9.0 Hz)，6.71(2H， d，J=8.4 Hz)， 3.67(2H， t，J=7.2 Hz)， 2.71(2H， t，J=7.2 Hz);13CNMR(CD3OD)，δC:156.2(C-1)， 114.9(C-2，C-6)，129.8(C-3，C-5)， 129.4(C-4)，38.8(C-7)，63.8(C-8)。與文獻(xiàn)［17］報道的波譜數(shù)據(jù)一致，故鑒定為對羥基苯乙醇。

化合物5為淡黃色油狀物質(zhì)。ESI-MSm/z:279［M+H］+。 根據(jù)1H-NMR，13C-NMR和 MS數(shù)據(jù)，可判斷此化合物結(jié)構(gòu)完全對稱，13C-NMR和DEPT譜上的芳香區(qū)顯示有2個次甲基、2個季碳、3個亞甲基和1個甲基信號，其分子式推導(dǎo)為C16H22O4，根據(jù)13C-NMR譜可知該化合物含有1個苯環(huán)2個酯羰基和2個丁氧基。綜合上述信息并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)［18］進(jìn)行比較，化合物5的結(jié)構(gòu)推導(dǎo)為鄰苯二甲酸二丁酯。

化合物6為黃色油狀物質(zhì)。ESI-MSm/z:315［M-H］-。1H-NMR(CD3OD)， δH:12.25(brs)，10.5(brs)，7.62(1H， d，J=15.8 Hz)，7.48(1H，d，J=15.8 Hz)，7.01(1H，d，J=2.2 Hz)，6.78(1H， d，J=2.2 Hz)，5.55(brs)， 4.60(brs)，3.89(3H，s);13C-NMR(CD3OD)， δC:160.8(C-1)， 107.5(C-2)，154.4(C-3)， 106.9(C-4)，120.5(C-5)，125.7(C-6)， 149.2(C-7)，167.2(C-8)， 180.1(C-9)，151.1(C-10)，106.9(C-11)，155.8(C-12)，117.4(C-13)， 117.4(C-14)， 62.7(CH2OH-3)，52.6(CH3)。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］報道一致，故鑒定該化合物 1，7-二羥基-3-羥甲基-8-甲氧基-二苯并［b， e］氧雜卓-13，14-二酮。

化合物7為黃色油狀物質(zhì)，ESI-MSm/z:391［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)，δH:9.20(2H， d，J=3.6 Hz)，9.04(2H，d，J=3.6 Hz)，5.72(4H，m)，3.22(2H，m)，2.89(16H，m)，2.43(6H，m);3C-NMR(CD3OD)， δC:128.8(C-1， C-6)，130.9(C-2，C-5)，132.5(C-3， C-4)，167.7(C-7， C-7')， 68.2(C-9， C-9')， 38.7(C-10， 10')，30.4(C-11， C-11')， 28.9(C-12， C-12')， 23.0(C-13， C-13')，14.0(C-14， C-14')，23.7(C-15，C-15')， 10.9(C-16， C-16')。 波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］報道一致，故鑒定該化合物鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯。

化合物8為黃色油狀物質(zhì)，ESI-MSm/z:289［M+H］+。 根據(jù)1H-NMR，13C-NMR，和 DEPT譜的信號，可推出該化合物含有1個甲基，一個醛基，和12個亞甲基，δH7.84(2H，J=11 Hz)和6.97(2H，J=10.5 Hz)為對位取代芳環(huán)上的質(zhì)子信號，再結(jié)合MS數(shù)據(jù)，可推斷出該化合物結(jié)構(gòu)為4-十三烷基-苯甲醛。

化合物9為黃色粉末狀物質(zhì)，ESI-MSm/z:249［M+Na］+。1H-NMR(CD3OD)， δH:5.34(2H，m)， 2.2(2H， t，J=11.2 Hz)， 2.02(4H， m)，1.60(2H， t，J=10.9 Hz)， 1.24(12H， m)， 0.90(3H， t，J=10.3 Hz);13C-NMR(CD3OD)， δC:179.7(C-1)，131.2(C-8)，131.1(C-7)，36.9(C-2)，33.3(C-9)， 30.5(C-10)， 30.2(C-11)，30.1(C-12)，29.8(5)，28.4(C-4)，27.2(C-3)，24.0(13)， 14.7(C-14)。 波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［21］報道一致，故鑒定該化合物(Z)-7-十四烯酸。

2.2 化合物的細(xì)胞毒活性測試

采用MTT法測定化合物對6種腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用，結(jié)果顯示該化合物2對胰腺癌SW1990細(xì)胞株和乳腺癌MCF-7細(xì)胞株具有較強(qiáng)細(xì)胞毒活性，IC50分別為18.6和9.68μg·mL-1見表1。

表1 化合物2的體外細(xì)胞毒活性(IC50，μg·m L-1)Table 1.The in vitro cytotoxicities of compounds 2

2.3 對稻瘟霉的抑制活性測試

實驗結(jié)果表明化合物1和4對稻瘟霉具有抑制活性，MIC值為31.2和15.6μg·mL-1。

2.4 紙片法抗菌活性測試

實驗結(jié)果顯示化合物2表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，其抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為13 mm、18 mm和14 mm，氯霉素對此三種指示菌的抑菌圈直徑分別為17 mm、22 mm和21 mm(圖3)。

圖3 化合物1-6的抗菌活性(左中右分別為大腸桿菌，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)Fig.3.Theantibacterial activity of compounds 1-6(the left，middle and right represents Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus)

2.5 抗氧化活性測試

總抗氧化能力的實驗結(jié)果顯示，化合物3具有較強(qiáng)的總抗氧化能力，總抗氧化能力為陽性對照物Trolox的2.4倍。

3 討論

本項研究從極地真菌Articulosporasp.Z1-1和Penicilliumsp.S-1-10中分離得到9個次級代謝產(chǎn)物?；衔?-6均首次從Articulosporasp.屬分離?；衔?由Meng等首次從Hyalodendriellasp.Ponipodef12中分離，有較弱的抗菌活性、抗線蟲活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性［7］，本研究發(fā)現(xiàn)它有中等強(qiáng)度的抗稻瘟霉活性?；衔?常被用作醫(yī)藥、染料、顏料中間體，是較好的抗氧化劑，也是一種新型阻聚劑，本文還發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細(xì)胞株抑制作用較強(qiáng)，并有較強(qiáng)的抗菌作用，具有抗腫瘤和抗菌的研究價值和應(yīng)用前景。化合物3有較強(qiáng)的抗氧化活性，有望開發(fā)成為抗氧化劑。本實驗從節(jié)枝孢屬Z1-1中分離到了具有強(qiáng)抗氧化活性的酚類化合物，也許能部分解釋極地微生物對紫外輻射的抗性的機(jī)制。從Penicillium.S-1-10中分離的化合物8是新的天然產(chǎn)物。另外，本文首次系統(tǒng)的報道了Articulosporasp.次級代謝產(chǎn)物，以上研究為極地微生物資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了重要依據(jù)。

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