脈沖場凝膠電泳技術(shù)在致病菌分型技術(shù)的應(yīng)用

王宇

上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海200023

脈沖場凝膠電泳技術(shù)在致病菌分型技術(shù)的應(yīng)用

王宇

上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海200023

脈沖場凝膠電泳(pulse-field gelelectrophoresis，PFGE)，又稱脈沖式交變電場電泳，該技術(shù)是將電泳電場方向交替性改變，并優(yōu)化脈沖時間和其他條件，可以分辨凝膠中35～10 000 kb的DNA分子。該方法應(yīng)用于分子流行病學中，通過觀察電泳條帶的差異，為確定菌株之間的親緣關(guān)系提供了可靠的技術(shù)手段。該技術(shù)在致病菌溯源（細菌性傳染性疾病溯源、細菌性食源性疾病溯源）、醫(yī)院內(nèi)感染流行監(jiān)測等方面都有廣泛的應(yīng)用。

脈沖場凝膠電泳；致病菌分型；致病菌溯源；院感監(jiān)測

脈沖場凝膠電泳(pulse-fieldgelelectrophoresis，PFGE)，又稱脈沖式交變電場電泳，是上世紀80年代后期發(fā)展起來的一種新型的電泳技術(shù)，主要用來分離大分子量線性DNA。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)僅能分離50 kb以下的DNA分子，對于超過50 kb的DNA分子，傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠其分子篩作用較弱，無法清晰分辨電泳條帶[3]。脈沖場凝膠電泳技術(shù)突破了該瓶頸，很好地解決了這一問題。1984年，Schwartz和Cantor首次將脈沖場凝膠技術(shù)應(yīng)用于染色體DNA的分離，并成功分離到16條完整的釀酒酵母菌細胞染色體DNA。此后該技術(shù)得到了長足的發(fā)展，到目前為止，PFGE技術(shù)已經(jīng)可以分離高達10 Mb級DNA分子[4]。

PFGE技術(shù)因其所具備的高分辨能力，其應(yīng)用范圍不斷擴大，幾乎覆蓋所有生物基因組結(jié)構(gòu)的研究。國內(nèi)開始應(yīng)用脈沖電場凝膠電泳技術(shù)最早應(yīng)用于研究鼠疫耶爾森菌[5]，可見脈沖電場凝膠電泳技術(shù)在致病菌分型上有其獨特的優(yōu)勢，適于推廣應(yīng)用。近年來，該技術(shù)不斷成熟，特別是限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用，使其成功應(yīng)用于菌株親緣關(guān)系的分析。通過對檢測儀器、試劑、操作程序進行標準化設(shè)置，可以建立一套重復(fù)性好、分辨率高且數(shù)據(jù)可以共享的細菌分子分型方法，該方法已在流行病學調(diào)查和院內(nèi)感染分析中起到日益重要的作用。

1 PFGE在致病菌檢測方面的應(yīng)用原理

細菌以二分裂方式進行增殖，在其不斷的傳代過程中，其親緣細菌之間具有相同的基因物質(zhì)。不同來源的致病菌中的基因物質(zhì)是否相似是鑒定其是否具有親緣關(guān)系的依據(jù)[6]。使用適宜的限制性內(nèi)切酶，可以在4 h內(nèi)將基因組DNA酶切成10～20個DNA大限制性片段，通過對這些片段的大小和數(shù)量進行分析可以對DNA大分子進行鑒定[7]。在正電場推動下，瓊脂糖(或聚丙烯酰胺)凝膠以篩濾形式對大小不同的DNA分子起分離作用。DNA

分子可看作自由牽引的卷體，只有在整個分子沿一系列膠孔運行時，DNA的泳動方能實現(xiàn)。較小的DNA分子可進入較小的膠孔，大些的DNA分子只能進入較大的膠孔，故需較長時間才能找到可進入的膠孔，因而泳動軌跡彎曲，泳動速度慢。＞30 kb的DNA分子在電泳時只能以頭尾牽引方式進入膠孔，如同蛇行一般，凝膠濾過效應(yīng)不再起作用，從而也無法分離DNA。雖然通過降低凝膠濃度和電場強度可在一定程度上解決較大DNA分子的分離困難，但仍然無法解決大于150 kbDNA分子的分離。PFGE技術(shù)與傳統(tǒng)電泳技術(shù)的最大區(qū)別就是其電泳電場可定期改變，且電場改變的方向和時間均可根據(jù)不同大小的DNA分子進行優(yōu)化。當電場方向改變時，不同大小的DNA分子重定向的時間與其分子大小成正比，隨著電場定期交替變化，不同大小的DNA分子以不同速度在凝膠上以蛇形軌跡泳動，從而達到分離大分子DNA片段的目的。通過對電場方向、脈沖時間、凝膠濃度等條件的優(yōu)化，可以有效分離35～10 Mb的DNA大分子[1]。

2 PFGE在致病菌方面的應(yīng)用

2.1 致病菌溯源

常規(guī)的診斷方法是根據(jù)微生物的表型特征而進行的，例如根據(jù)微生物對不同染料的染色性、生化反應(yīng)和血清學反應(yīng)、抗原特性、藥敏實驗、菌落特征、是否攜帶噬菌體、是否表達細菌素以及菌體蛋白成分等綜合指標進行判定，這些方法存在的一個共同問題是，許多情況下只能鑒定某一類病原微生物，屬于特異性診斷方法。病原微生物的生理、生化表型是由其所含的遺傳物質(zhì)決定的。表型的差異是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)差異的體現(xiàn)。直接研究細菌染色體DNA分子的特點，比較各種細菌DNA組成和結(jié)構(gòu)的差異與相似性，可從本質(zhì)上闡明細菌間的差別及親緣關(guān)系[2]。

2.1.1 細菌性傳染性疾病溯源傳染性疾病是嚴重危害人類健康的一類疾病。人類在自然科學領(lǐng)域已經(jīng)取得許多令人矚目的成就，但在與傳染性疾病的抗爭中，仍沒有完全掌握這類疾病發(fā)生的機理。在細菌性疾病方面，早期快速診斷和對菌株的鑒定是臨床實驗室一直努力的目標。對各種病原微生物建立快速的診斷和檢測方法是采取有效治療和應(yīng)對措施的重要前提。當對一個未知的病原微生物采用某一特定的檢測方法進行檢測而未能得到預(yù)期結(jié)果時，容易造成治療上的延誤，尤其在公共突發(fā)性生物事件急需盡快做出準確結(jié)論時，延誤將帶來較大的經(jīng)濟和生命的損失。而PFGE可從本質(zhì)上闡明細菌間的差別及親緣關(guān)系，從而快速找到應(yīng)對方法及傳染源，為研制疫苗等防治提供有效信息，保護人群健康，減少經(jīng)濟損失，避免人群恐慌。

如江西省疾病預(yù)防控制中心的熊長輝醫(yī)生等利用脈沖場凝膠電泳技術(shù)分析流行性腦脊髓膜炎（簡稱“流腦”）病例及其密切接觸者分離出的腦膜炎奈瑟菌（Nm）的同源性以及不同病例分離出Nm的相關(guān)性。他們對6例疑似流腦病例的血液和腦脊液標本以及對密切接觸者咽拭子進行腦膜炎奈瑟菌的培養(yǎng)分離,分離菌進行氧化酶試驗、血清學分群鑒定、糖原利用試驗和脈沖場凝膠電泳（PFGE）鑒定試驗.結(jié)果6例疑似流腦病例與其密切接觸者共分離出21株菌,均為Nm C群,5株為AH 1型,14株為AH 2型,2株為AH 47型。結(jié)論，流腦病例分離出的Nm與其密切接觸者分離出的Nm完全同源,其中4例病例病原菌來自同一菌株[8]。

2.1.2 細菌性食源性疾病溯源目前，在世界范圍內(nèi)，細菌性食源性疾病仍然是人類面臨的一個嚴重的問題。特別是交通、物流、旅游行業(yè)的快速發(fā)展，細菌性食源性疾病的發(fā)病模式也有了較大的改變。以往，食源性疾病多以單一地區(qū)的集中爆發(fā)為主，現(xiàn)在食源性疾病更多以多地爆發(fā)或者表現(xiàn)為多地表面上的“散發(fā)”。因此，在食源性疾病爆發(fā)或者“潛在”爆發(fā)的時候，應(yīng)對不同來源的病原體分子水平和基因物質(zhì)的水平上進行鑒定以確定其親緣關(guān)系，并對具有同源性或親緣關(guān)系相近的致病菌開展流行病學調(diào)查，確定傳播途徑并追蹤傳染源[7]。

由于PFGE技術(shù)可以在分子水平上評估不同來源細菌的親緣關(guān)系，因此，在細菌性食源性疾病的溯源調(diào)查過程中，PFGE技術(shù)被廣泛應(yīng)用于判定可疑食品分離菌株、污染環(huán)境中分離菌株、病人嘔吐物或排泄物中分離菌株以及可疑傳染源分離菌株的同源性或親緣關(guān)系，成為細菌性食源性疾病溯源判定的金標準[9-10]。目前，多個發(fā)達國家都建立了基于PFGE技術(shù)的細菌分子分型網(wǎng)絡(luò)實驗室，用于食源性疾病的防控。不同地區(qū)的網(wǎng)絡(luò)實驗室通過共享PFGE圖譜數(shù)據(jù)庫，可以對不同來源菌株進行同源性即時比對，從而發(fā)現(xiàn)潛在的食物中毒事件，做

到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)警，以便更即時的采取公共衛(wèi)生干預(yù)行動。

如浙江省寧波市傳染病院的的王春萍醫(yī)生、金春光醫(yī)生在2009年對來自食物中毒標本中分離的沙門菌進行分子分型。經(jīng)菌株分離、生化鑒定和血清型確定參照GB4789.4-2003方法進行,對5株布利丹沙門菌用PFGE方法進行分子分型,應(yīng)用Quantity oneTM分析軟件對電泳后的條帶進行分析。結(jié)果：從7份標本中檢出5株布利丹沙門菌,檢出率為71.4%,經(jīng)PFGE分型,5株來源于食物中毒病人標本的布利丹沙門菌其帶型一致,因此PFGE型別相同[11]。

美國于1998年5月建立PulseNet（病原菌分子分型監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)），是最早將PFGE技術(shù)應(yīng)用于食源性疾病監(jiān)測以及快速反應(yīng)和預(yù)警的國家，并有多起成功案例。在一起多州發(fā)生的食物中毒事件中，PulseNet通過比對數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)多株致病菌具有相同的PFGE圖譜，CDC經(jīng)過流行病學調(diào)查，最終確定多起可疑食物均來自于一家墨西哥農(nóng)場，通過對該農(nóng)場生產(chǎn)食物的控制和處理以及該農(nóng)場衛(wèi)生狀況的改善，從而在源頭上控制了該起食物中毒的爆發(fā)[7]。

2.2 在醫(yī)院內(nèi)感染流行監(jiān)測方面的應(yīng)用

引起院內(nèi)感染暴發(fā)的微生物具有克隆相關(guān)性，即它們擁有相同的起源?？寺∠嚓P(guān)菌株具有相同的毒力、生化特性和基因相似性特征。由于微生物在種屬水平上存在著變異，分離自不同時間、不同地點、不同部位的細菌常被分為不同的型或亞型。分型對于鑒別感染流行、鑒定交叉感染、確定感染來源、識別特殊毒力株、指導實施免疫計劃有著非常重要的意義。將PFGE用于細菌感染流行病學研究，可以分析細菌較大的基因組DNA片段，能將整個細菌基因組的酶切片段圖譜清楚地顯現(xiàn)于一塊凝膠上，且重復(fù)性極好，具有很高的特異性和分辨力，能夠較好反映流行病學相關(guān)性，是公認的醫(yī)院感染調(diào)查最好的分型方法，它能有效地協(xié)助查清感染來源，發(fā)現(xiàn)流行傳播方式，及時有效地控制流行，指導臨床治療，是一種快速、可靠、準確的院內(nèi)感染細菌的流行病學調(diào)查方法[12-14]。

如上海復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科的陳海紅醫(yī)生等對醫(yī)院2007—2008年以及2005年上半年下呼吸道標本分離的耐碳青霉烯類抗菌藥物鮑曼不動桿菌（CRAB）復(fù)活后，采用脈沖場凝膠電泳技術(shù)進行基因同源性分析。其PFGE圖譜分析發(fā)現(xiàn),2007—2008年所復(fù)活的63株細菌中共有A、C-L等11種基因型,主要為流行株C和流行株E,各有20株,各占31.7%；此時期,外科重癥監(jiān)護病房（SICU）分離的25株CRAB主要來源于流行株C（72.0%）,該病區(qū)中流行株C最早分離于2007年12月,之后在2008年引起持續(xù)而頻繁的感染；急診重癥監(jiān)護病房（EICU）分離的細菌以流行株G1為主（40.0%）,呼吸科病房及留院觀察室均以克隆株E為主；SICU 2005年2—6月分離的CRAB有A和B兩種基因型,以流行株B為主,占80.0%；克隆株A首次分離于2005年2月的SICU的痰標本,之后（2007—2008年）在所研究的各個病區(qū)間斷出現(xiàn)。結(jié)論近兩年醫(yī)院CRAB主要的PFGE基因型為流行株C和流行株E,克隆株G1和克隆株E可引起暴發(fā)流行；同一克隆株可在同一病房內(nèi)發(fā)生交叉感染從而引起流行暴發(fā)；流行相關(guān)的克隆株可在病區(qū)長期生存,從而引起病區(qū)內(nèi)持續(xù)感染,需要積極采取感染控制措施；與2005年相比,近兩年SICU中的主要流行株由克隆株B變?yōu)榭寺≈闏,推測同一個病區(qū)的流行基因型可能存在流行變遷[15]。

3 PFGE方法的局限性

雖然PFGE方法得到了廣泛的應(yīng)用，但其自身也存在著一些不足之處。比如儀器設(shè)備、耗材以及數(shù)據(jù)庫分析軟件價格昂貴，不利于推廣；實驗步驟繁瑣，技術(shù)不易掌握；實驗耗時較長（2～4 d），錯過流行學調(diào)查最佳時機。由于PFGE方法是對限制性內(nèi)切酶酶切片段條帶的帶型進行區(qū)分，其分辨力和精確性不足，可能會導致某些流行病學上無相關(guān)的菌屬間由于具備相同的內(nèi)切酶位點而表現(xiàn)出相同的PFGE圖譜[3]，相對于隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD）、重復(fù)序列PCR技術(shù)（Rep-PCR）、多位點序列分型技術(shù)（MLST）、IS200分型等方法，還存在一些局限性[16-17]。盡管該技術(shù)還存在著一定的不足之處，目前其在細菌分子分型領(lǐng)域仍然是最推崇的方法之一。

自1984年脈沖場凝膠電泳技術(shù)問世以來，這項技術(shù)經(jīng)過不斷的完善，得到了越來越廣泛的應(yīng)用。為病原微生物致病機制、分子流行病學和基礎(chǔ)科學等領(lǐng)域的發(fā)展做出了巨大的貢獻，也將會在未來的研究中得到更好的加強，在技術(shù)和成本上不斷更新進步，使其更好地應(yīng)用于相關(guān)的研究領(lǐng)域。

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Pulsed-field Gel Electrophoresis and its Application in Pathogen Molecular Typing

WANG Yu
Huangpu District Centre for Disease Control and Prevention，Shanghai，200023 China

Pulsed Field Gel Electrophoresis(PFGE)is a new technique of gelelectrophoresis developed in1980's.It can be used to separate large DNA molecules ranging from 35 to10 Mb.It has been widely applied to the pathogen molecular typing,identification of species groups，Source-tracking of pathogen and nosocomial infection surveillance.

PFGE；Pathogen molecular typing；Traceability pathogens；Hospital infection surveillance

R378

A

1672-5654（2015）08（b）-0186-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2015.23.186

2015-05-17）

上海市黃浦區(qū)科委課題（2011HGG-09）。

王宇（1973.3-），男，回族，遼寧遼陽人，碩士，副主任技師，從事微生物檢驗相關(guān)研究。