楊樹胞外蛋白的提取分離及2－D電泳體系的建立

陳 穎，樂 利，羅永亞，楊 華，汪南陽，林芳芝，王俊霖

（南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學(xué)院，南京210037）

胞外蛋白（extracellular proteins，ECP）又被叫做細胞壁蛋白（cell wall proteins，CWPs），質(zhì)外體蛋白（apoplastic proteins，APPs）和分泌蛋白［1］，是質(zhì)外體中對細胞生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起關(guān)鍵調(diào)控作用的物質(zhì)，通常在高爾基體內(nèi)合成，被分泌到細胞壁及胞外的基質(zhì)中，只占質(zhì)外體所有成分的5%～10%。但胞外蛋白是胞外信號的感知者，是信號跨越細胞膜的傳遞者，又是細胞壁結(jié)構(gòu)骨架的搭建者。越來越多的實驗證據(jù)表明胞外蛋白與細胞骨架、胞外基質(zhì)、細胞膜及胞內(nèi)物質(zhì)之間不斷地進行著“交流”［2－3］。

根據(jù)其與細胞壁成分的結(jié)合度可將胞外蛋白分為三類：一類是松散型結(jié)合蛋白，主要屬于調(diào)控細胞壁生長分化的酶類；第二類胞外蛋白稱為弱結(jié)合型蛋白，是以弱的非共價鍵與細胞基質(zhì)結(jié)合的蛋白，在胞外可以進行擴散和遷移，因與細胞的生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答有關(guān)，又稱為防御蛋白；第三類胞外蛋白與胞壁成分結(jié)合緊密，稱為緊密結(jié)合型蛋白，因與細胞壁的框架構(gòu)建有關(guān)，又稱為壁結(jié)構(gòu)蛋白［4］。把胞外蛋白稱“質(zhì)外體蛋白”的學(xué)者偏于前兩類蛋白的研究，而把胞外蛋白稱“細胞壁蛋白”的學(xué)者大都偏向于二、三類蛋白的研究。本研究把葉片細胞壁提取的蛋白叫做細胞壁蛋白（CPWs），把從莖段液流中提取的蛋白叫做質(zhì)外體蛋白（APPs）。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為當今生命科學(xué)研究的熱點。亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)在細胞膜、細胞器（線粒體和葉綠體中）的研究相對較多，而由于人們對胞外蛋白作用的忽視及提取的困難使其研究落后于胞內(nèi)蛋白。目前對胞外蛋白組的研究主要集中在模式植物擬南芥上［4］，另外在甘藍、紫花苜蓿、煙草、玉米、鷹嘴豆、葡萄、水稻、豌豆、黃瓜等農(nóng)作物和蔬菜上也有所涉及［5－11］，但胞外蛋白組學(xué)在林木上的研究相對較少。

楊屬植物（Populus）是林木基因組研究的模式植物，具有基因組小、童期短、生長快、易轉(zhuǎn)化、易再生等特點，是當今世界中緯度地區(qū)栽培面積最廣、木材產(chǎn)量最多的樹種之一，中國種植面積就已超過7×106hm2［12］。目前楊樹基因組學(xué)的研究較為深入，在環(huán)境脅迫下胞外蛋白組的研究卻相對較少。通過對楊樹胞外蛋白組的變化研究，一方面可以揭示胞外蛋白在環(huán)境脅迫中的響應(yīng)機制，另一方面可以為其他林木胞外蛋白研究提供重要的理論和技術(shù)指導(dǎo)。本研究以美洲黑楊雜種優(yōu)良無性系‘NL895’（Populusdeltoides×Populuseuramericanacv.）組培苗的葉片和莖段為試材，對楊樹胞外蛋白的提取、分離、純化、單向和雙向電泳檢測等技術(shù)進行了系統(tǒng)地研究。其中葉片胞外蛋白（細胞壁蛋白）的提取采用了LiCl和CaCl2法，莖段胞外蛋白（木質(zhì)部液流蛋白）的提取采用了真空滲入法，初步建立了楊樹胞外蛋白的雙向電泳研究體系。

1 材料和方法

1.1 材 料

美洲黑楊雜種優(yōu)良無性系NL895楊組培苗葉片和莖段來自于南京林業(yè)大學(xué)實驗室。

1.2 苗木的擴繁和培養(yǎng)

組培苗的擴繁方法參照文獻［13］，蛋白提取等試驗材料取自組培苗的莖段和葉片（圖版Ⅰ，A、B）。

1.3 楊樹葉片胞外蛋白的提取與純化

楊樹葉片胞外蛋白提取參照Kong等［8］、朱畇昊等［11］、Feiz等［14］提取法加以改進，分兩步提取，具體流程如下。

細胞壁（CW）提?。海?）將NL895楊葉片用液氮研磨成粉末，加適量5mmol·L－1醋酸鈉（pH 4.6）溶解，然后轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，在4℃、6 000×g（Beckman CoulterTM）離心15min，重復(fù)1次上述操作。（2）將沉淀轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入含0.4mol·L－1蔗糖的醋酸鈉溶液（5 mmol·L－1，pH 4.6）中搖勻，用超聲波細胞破碎儀（XO－1000D）將細胞破碎，共3次，每次10min，并對破碎后的細胞粉碎程度進行鏡檢。破碎后的細胞在4 ℃、4 000×g離心15min，棄上清。（3）上述沉淀中依次加入含0.4、0.6、1.0mol·L－1蔗糖的醋酸鈉溶液（1mol·L－1）各沖洗3次，每次在4 ℃、4 000×g離心15min，棄上清。（4）沉淀再用5mmol·L－1醋酸鈉溶液（pH 4.6）洗滌6次，洗滌后每次4 ℃、4 000×g離心15 min。（5）棄上清，沉淀再用超純水沖洗4 次，沖洗后每次在4℃、4 000×g離心15min，最后一次在4℃、12 000×g 離心30 min，棄上清，其沉淀放入－20 ℃冷凍干燥即得細胞壁組分。

酚－甲醇／醋酸銨沉淀法胞外蛋白（ECPs）的提取與純化：（1）弱鍵結(jié)合的CWPs提取。上述細胞壁沉淀中加入0.2mol·L－1CaCl2醋酸鈉溶液（pH 4.6）沖洗2次，每次在4 000×g離心15min。（2）緊密型結(jié)合型CWPs提取。提取的細胞壁沉淀加入含0.2mol·L－1LiCl的醋酸鈉溶液（pH 4.6）沖洗2次，每次在4 000×g離心15min，以下兩者提取的步驟相同。（3）合并2次上清液，加入1／3體積Tris－平衡酚混勻，吸取苯酚相，轉(zhuǎn)入離心管中，再加入5倍體積0.1 mol·L－1乙酸銨／甲醇溶液混勻，于－20 ℃條件下沉淀過夜。（4）次日將沉淀在4℃、12 000×g離心20min，棄上清加入2倍沉淀體積的甲醇，漩渦震蕩2min，12 000×g離心20min。（5）棄上清，加入2倍沉淀體積的丙酮，漩渦震蕩2 min，12 000×g離心20min。重復(fù)1次該操作，最后沉淀于－20 ℃冰箱中冷凍干燥，干粉即為細胞壁蛋白質(zhì)（CWPs），－70 ℃保存。

TCA／丙酮沉淀法胞外蛋白（ECPs）的提取與純化：參照林梓浩等［6］和Komatsu等［15］法，在提取的細胞壁組分中加入含0.2 mol·L－1CaCl2的醋酸鈉緩沖液（25mmol·L－1，pH 4.6），渦旋5min，于4 ℃冰箱中浸提3h，4℃下15 000×g離心30min，留取上清液。該步驟重復(fù)1次后，再加入含3mol·L－1LiCl的醋酸鈉緩沖液（25mmol·L－1，pH 4.6）15mL，渦旋5min，4 ℃冰箱中浸提3h后，4 ℃下15 000×g離心30min。取上清液加入4倍體積預(yù)冷的10% TCA／丙酮溶液（內(nèi)含0.1% DTT，1 mmol·L－1PMSF），并在－20 ℃冰箱沉降過夜，4℃下15 000×g離心30min，棄上清，沉淀用丙酮清洗3次，每次4 ℃下15 000×g離心30 min，棄上清，沉淀于－20 ℃冰箱中冷凍干燥，干粉即為細胞壁粗蛋白（CWPs）。

1.4 楊樹莖段胞外蛋白提取

參照Dani等［16］與Zhu等［17］的真空滲入法，并加以改進。（1）稱取適量楊樹莖段剪成2cm 長小段，用超純水漂洗和分光光度計檢測蛋白的含量。（2）將漂洗好的莖段浸入20mmol·L－1醋酸鈉（含20mmol·L－1CaCl2）液體中，用70kPa真空抽氣泵抽氣20min，然后在5min內(nèi)慢慢放氣至室內(nèi)大氣壓，將莖段取出吸干表面水分，并剪除兩端褐化部分。（3）將材料放入底端帶孔的離心管中，將其套入另一個大的離心管內(nèi)，4 ℃、3 000×g離心60min，收集離心管底部的胞外提取液。（4）向提取液中加入1.5倍體積預(yù)冷的甲醇（含1%冰乙酸），在－28℃下浸提過夜。（5）次日，4 ℃、3 500×g 離心30 min，收集沉淀，依次用100%、70%甲醇洗滌沉淀，去除甲醇后的胞外蛋白粉在－70 ℃保存（即質(zhì)外體蛋白，APPs）。

1.5 細胞壁顯微檢測與胞外蛋白質(zhì)含量測定

用1.0%碘－碘化鉀染色液、藍墨水染色液浸潤超聲破碎的細胞，然后做徒手切片，并在顯微鏡下檢測細胞結(jié)構(gòu)的變化情況。胞外蛋白提取液中蛋白的含量測定參照Laemmli［18］法進行，用牛血清白蛋白做標準曲線，計算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

1.6 楊樹胞內(nèi)酶（蛋白）污染的檢測

為防止提取液中胞內(nèi)蛋白的污染，采用細胞內(nèi)6－P－葡萄糖（G－6－PDH）脫氫酶活性測定法（胞內(nèi)標志酶）檢測胞質(zhì)蛋白的污染率。參照Komatsu等［15］與Zhou等［19］法，向100μL 莖 段 胞 外 蛋 白 質(zhì)提取液、葉片細胞壁蛋白提取液和葉片總蛋白提取液中分別加入2.9mL 含55mmol·L－1Tris－HCl（8.0）、3.3 mmol·L－1MgCl2、0.2 mmol·L－1NADP、3.3mmol·L－1G－6P（6－P－葡萄糖）的混合液，在340nm 處檢測G－6－PDH 脫氫酶的活性。用胞外蛋白提取液中G－6－PDH 脫氫酶活性占總蛋白提取液中G－6－PDH 脫氫酶活性的百分比來檢測提取的胞外蛋白是否有胞內(nèi)蛋白污染，重復(fù)3次。

1.7 楊樹胞外蛋白的1－D和2－D電泳分析

1.7.1 胞外蛋白樣品處理及1－D 電泳分析 樣品的處理：將提取的胞外蛋白加入樣品處理液混勻，在沸水浴中煮5min，冷卻后在4 ℃、12 000×g下離心15min，取上清液點樣，進行SDS－PAGE 電泳分析。分離膠濃度12.9%，初始電壓80V，15min后改為200V 恒壓，至溴酚蘭遷移到距凝膠底部約1～2cm 時終止電泳。用PD Quest 1－DE 7.4.0圖像處理軟件進行圖譜分析。

1.7.2 2－D 電泳體系優(yōu)化 2－D 電泳參照林梓浩等［6］的方法并加以改進。（1）等電聚焦（IEF）：按10 μL／mg胞外蛋白含量加入蛋白裂解液［含7 mol·L－1尿素，2 mol·L－1硫脲，4% Chaps，1% DTT，2% Ampholyte（pH 3～10），1mmol·L－1PMSF］，充分搖勻后進行超聲波處理20 min；37 ℃水浴45 min，12 000×g離心15min，取上清液150μL，加入300μL溶脹液［含6mol·L－1尿素，2mol·L－1硫脲，2%Chaps，0.4%DTT，1%Ampholyte（pH 3～10）］水化上樣液，渦旋混勻。將樣品液加入IPG strip聚焦盤中，再放入IPG 膠條（GE Healthcare），滴加2～3mL 礦物油水化12h 后，在等電聚焦儀（Bio－Rad）上進行第一向等電聚焦電泳（IEF）。IEF聚焦參數(shù)為250V 慢速升壓45min，1 000V 快速升壓1h45min，10 000V 線性升壓5h，10 000V非線性快速升壓聚焦，使總聚焦伏特小時數(shù)達60 000Vh完成聚焦，最后為500V 保持任意時間，水化和聚焦溫度為20 ℃。（2）平衡：等電聚焦結(jié)束后，將膠條在平衡液Ⅰ［內(nèi)含50mmol／L Tris－HCl（pH 8.8），6 mol·L－1尿素，30%甘油，20g·L－1SDS，20g·L－1DTT］中振蕩平衡15 min，再在平衡液Ⅱ［內(nèi)含50mmol·L－1Tris－HCl（pH 8.8），6 mol·L－1尿素，30%甘油，20g·L－1SDS，25g·L－1碘乙酰胺］中振蕩平衡15 min。（3）第二向SDS－PAGE：同1－D 電泳操作步驟。（4）凝膠蛋白染色：SDS－PAGE結(jié)束后，取出凝膠，用去離子水漂洗2～3次，加入適量的R－250染色液，于搖床上輕輕染色3h，隨后用脫色液洗脫至背景清晰。

1.8 楊樹胞外蛋白電泳圖譜分析

顯色后的凝膠用ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad）掃描獲取圖像。單向電泳采用Quantity One 1－D 分析軟件進行條帶的識別和分析。雙向電泳采用PDQuest 2－DE 7.4.0對圖譜進行蛋白點的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹葉片細胞壁破碎程度檢測及顯微檢測

細胞壁的提取與葉片的破碎程度有關(guān)，葉片越破碎，細胞壁越易提取出來。在圖版Ⅰ，C～E 中，在用液氮研磨后的葉片進行光鏡檢測時，可以看到葉片組織塊較大，破碎程度?。▓D版Ⅰ，C）；經(jīng)超聲破處理5 min 后，葉片組織塊開始變?。▓D版Ⅰ，D），當超聲破處理10min后，葉片已成為非常小的碎片，這對后面的細胞壁蛋白的提取是有利的，因此在細胞壁的提取過程選擇超聲波處理10min效果較好（圖版Ⅰ，E）。

將5min 和10min超聲處理的細胞碎片懸浮液用碘化鉀和藍墨水染色后，可以看到胞內(nèi)結(jié)構(gòu)易著色，而細胞壁不易著色（圖版Ⅰ，F(xiàn)～G）。細胞破碎時間不同，細胞的結(jié)構(gòu)變化相差很大，超聲波處理5min后，可以看到大量細胞壁網(wǎng)絡(luò)，但胞內(nèi)細胞質(zhì)保留較多（圖版Ⅰ，F(xiàn)），而10min超聲破碎處理，其葉片細胞中細胞質(zhì)大部分已經(jīng)去除，只看到細胞壁連接而成的網(wǎng)絡(luò)，還可以觀察到大量氣孔存在，說明10min超聲破碎清除胞內(nèi)物質(zhì)的效果較好（圖版Ⅰ，G）。

2.2 楊樹葉片胞內(nèi)蛋白污染檢測

G－6－PDH 脫氫酶是植物細胞內(nèi)呼吸過程中重要的糖代謝酶，代表植物細胞的活力程度，也是判斷細胞活力強弱的標志酶，常被用來檢測細胞器提取液的純凈程度或污染程度［19］。從表1中可以看出，葉片細胞壁蛋白提取較純，該酶占總蛋白提取液的2.9%，而莖段質(zhì)外體蛋白提取液中該酶活性占總蛋白酶活性的14.1%，低于細胞壁提取液的純度，但仍在允許的范圍之內(nèi)。

2.3 楊樹胞外蛋白的電泳圖譜分析

2.3.1 楊樹葉片胞外蛋白SDS－PAGE分析 從圖1的C、D 泳道電泳膠中可以看出，分別用加CaCl2和LiCl提取的NL895楊葉片細胞壁蛋白條帶差異很大，CaCl2純化的蛋白較LiCl提取的蛋白條帶清晰、帶寬，而LiCl純化的胞外蛋白清晰度差，條帶數(shù)和條帶寬度都遠小于CaCl2。在此提取方法中CaCl2提取的細胞壁蛋白主要是以弱鍵形式與細胞壁結(jié)合的蛋白，大多屬于酶類，說明在細胞壁的提取液中與細胞壁和胞外基質(zhì)活動相關(guān)的酶類含量豐富，細胞代謝活動旺盛（圖1，C泳道）。

從圖1中還可以看出，提取樣品葉片的質(zhì)量與提取蛋白的含量關(guān)系密切，同樣用CaCl2提取胞外蛋白的方法中，用7g（圖1，C 泳道）葉片樣品電泳的多肽條帶清晰度差，條帶彌散不集中，但用15g（圖1，B泳道）葉片量提取的蛋白與前者比較，條帶數(shù)明顯增加，條帶清晰、帶寬，可以觀察到的條帶有12～14條，分子量主要分布在13～65kD 之間，其中豐度較高的亞基分布在4 3、3 0和25kD附近。在43kD 附近有較為豐富的蛋白存在，R－250染色深，亮度大。通過與總蛋白電泳膠（圖1，A 泳道）比較，1，5－2－P核酮糖羧化酶的大亞基（55kD）在B 泳道電泳膠中非常弱，說明細胞壁蛋白提取的純度較高（圖1，B）。而總蛋白的SDS－PAGE 圖譜中可以看到 標 志 酶1，5－2－P 核 酮 糖 羧 化 酶 的 大 亞 基（55 kD）存在，總蛋白圖譜中多肽的條帶多于胞外蛋白的條帶數(shù)（圖1，A 泳道）。經(jīng)真空滲入法提取的莖段胞外蛋白SDS－PAGE電泳見圖1，E泳道，可見在43kD 附近有較大的多肽帶存在，在40kD 以下有少量條帶存在，而在高分子量區(qū)域50～97kD 區(qū)域中多肽條帶稀少，說明楊樹的莖段質(zhì)外體蛋白主要分布在小分子量蛋白區(qū)域。

表1 胞外蛋白提取液中胞內(nèi)蛋白污染檢測Table1 Detection of intracellular contamination in ECPs

圖1 NL895楊胞外蛋白的1－D電泳圖譜Fig.1 SDS－PAGE image analysis of NL895poplar leaf CWPs（A－D）and stem（E）ECPs

2.3.2 楊樹葉片胞外蛋白的2－DE電泳分析

（1）不同pH 膠條和提取方法對楊樹葉片細胞壁蛋白2－DE圖譜的影響 為探究楊樹細胞壁蛋白最佳的pH 范圍，采用了pH 3～10和4～7、長為17 cm IPG 膠條進行研究。結(jié)果表明（圖2），從葉片提取的NL895楊細胞壁蛋白經(jīng)2－D 雙向電泳后，在不同pH 介質(zhì)中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)多肽斑點差異較大。在pH 3～10介質(zhì)條件下（圖2，A），電泳圖譜中蛋白質(zhì)斑點較少，而且不清晰，統(tǒng)計斑點數(shù)在50個左右，大部分在43～20kD 之間。而在pH 4～7介質(zhì)條件下（圖2，C），電泳圖譜中蛋白質(zhì)斑點較pH 3～10介質(zhì)條件下增多且斑點清晰，且在66～45kD 之間出現(xiàn)了蛋白斑點，45～35kD 之間是斑點最密集區(qū)域，25.0～18.0kD 之間斑點也比較密集，蛋白點最密集的條帶在31kD 左右，斑點數(shù)最多，最清晰，經(jīng)軟件統(tǒng)計的斑點數(shù)達150個左右，再次說明楊樹細胞壁蛋白（CaCl2）提取部分，弱堿結(jié)合的細胞壁蛋白的分子量主要分布在低分子量、酸性區(qū)域，即小分子量蛋白居多。

從上樣量來看，500μg（圖2，B）上樣量蛋白點較少，清晰度較差，特別是低豐度的蛋白分辨率差；1 000μg（圖2，C）上樣量無論從蛋白點的斑點數(shù)、清晰度、低豐度蛋白的表達量來講都最好，蛋白質(zhì)點呈圓形，重復(fù)性好，斑點數(shù)達300多個；而1 200μg（圖2，D）上樣量由于上樣量高，導(dǎo)致大多數(shù)蛋白質(zhì)點沒有完全分離，疊加在一起。

圖2 NL895楊葉片細胞壁蛋白2D 電泳圖譜（17cm IPG，pH 4～7）Fig.2 2－DE image analysis of NL895poplar CWPs extraction by andphenol－MeOH／NH4Ac（17cm IPG，pH 4～7）

盡管酚－甲醇／醋酸銨沉淀法在1 000μg上樣量、17cm 膠條、pH 4～7條件下獲得了較為滿意的蛋白質(zhì)圖譜，但由于膠條較窄，出現(xiàn)部分蛋白質(zhì)點的重疊和堆積，斑點仍然較少。在用TCA／丙酮沉淀法提取的細胞壁蛋白中，改進了提取技術(shù)，采用加大離心力到15 000×g、延長離心至30min，并在提取液中添加DTT 和PMSF，使細胞壁蛋白的提取效果大大增加，采用500μg（圖3）上樣量、24cm 膠條、pH 4～7條件下獲得了滿意結(jié)果，蛋白質(zhì)電泳圖譜清晰度提高，特別是蛋白質(zhì)斑點數(shù)大大增加，斑點數(shù)達550多個，比酚－甲醇／醋酸銨沉淀法多了200多個斑點，是較為有效的一種純化方法。

圖3 NL895楊葉片丙酮沉淀法細胞壁蛋白的2D 電泳圖譜（500μg，24cm IPG，pH 4～7）Fig.3 2－DE image analysis of NL895poplar CWPs extraction by TCA／acetone precipitation（500μg，24cm IPG，pH 4～7）

（2）楊樹莖段胞外蛋白的2－D 電泳分析 NL895楊細胞壁蛋白經(jīng)2－D 電泳后，在不同pH 介質(zhì)膠條下電泳出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點與在葉片中的pH范圍不同。在pH 3～10介質(zhì)條件下（圖4，A），電泳圖譜中蛋白質(zhì)斑點較多，而且清晰，在高分子量部分70～97kD 區(qū)域也有斑點存在，但較少，在31～66kD 區(qū)域蛋白主要分布在pH 5～7之間的中性區(qū)域；31～43kD 之間蛋白斑點最多，特別是在43kD左右，蛋白斑點最為集中，依然說明莖段胞外蛋白主要分布在小分子量的區(qū)域。而在pH 4～7 介質(zhì)條件下，電泳圖譜中蛋白質(zhì)斑點并沒有表現(xiàn)出比pH 3～10之間多的現(xiàn)象，也是主要在31～66kD 之間蛋白斑點最多，但斑點堆積現(xiàn)象明顯（圖4，B）。

3 討 論

目前胞外蛋白的提取方法主要有兩種，一種是細胞毀壞型即通常采用先提取細胞壁，再從細胞壁中純化出蛋白［14－15］，主要應(yīng)用于葉片；另一種是細胞非毀壞型即通過真空滲入法［17，19］將胞外蛋白提取出來，主要應(yīng)用于莖段。不同植物胞外蛋白的提取技術(shù)相差很大，在本研究中葉片細胞壁蛋白采用了第一種方法，在細胞壁的超聲破碎過程中，10 min超聲波對細胞壁的破碎程度最好，超聲波處理后溶液明顯比處理前溶液均勻，且粉末更加細致，這樣大大增加了與提取液接觸面積，進而提高了蛋白樣品質(zhì)量。通過染色鏡檢葉肉細胞中的胞內(nèi)物質(zhì)，可看出該法已將其大部分去除，檢測到大部分結(jié)構(gòu)為去除胞內(nèi)成分的細胞壁，結(jié)果與朱畇昊等［11］的方法一致，證明該法對細胞壁的破碎是可行的。用真空滲入法提取葉片胞外蛋白時，由于楊樹葉片汁液流動不及農(nóng)作物，因而提取的胞外蛋白量非常少，需要大量的葉片材料（資料未給出），因此利用前一種方法提取葉片胞外蛋白較好。在莖段質(zhì)外體液流蛋白的提取過程中，采用了多年生實生苗楊樹（春季嫩梢）和組培苗的莖段提取作對比，發(fā)現(xiàn)實生苗由于枝條較粗且已木質(zhì)化，酚氧化酶活性強，在提取過程中亦褐化，給提取質(zhì)外體液流蛋白帶來困難（資料未給出），而利用組培苗的幼嫩莖段提取質(zhì)外體液流蛋白，其效果較好。

圖4 NL895楊莖段胞外蛋白雙向電泳圖Fig.4 2－DE image analysis of NL895poplar apopalst proteins from stems

在樣品的用量方面，大部分文獻中通常介紹樣品量在5～10g之間，但在楊樹胞外蛋白提取過程中，發(fā)現(xiàn)低量（7g左右），只有用CaCl2純化的蛋白多肽條帶清晰，用LiCl提取的蛋白電泳后條帶不清晰，濃度低，不能用于分析。采用高質(zhì)量（10g 以上）樣品提取的胞外蛋白條帶清晰、帶寬、濃度高，說明楊樹細胞壁蛋白的提取需要較高的樣品用量，這與林梓浩等［6］在黃瓜中細胞壁蛋白提取只用5g的量相差很大，說明不同的植物細胞壁蛋白具有特異性，另外也可能與提取的方法有關(guān)。

在蛋白純化中，采用的方法主要有丙酮干粉法和飽和酚法。酚－甲醇／醋酸銨沉淀法主要是用于從富含次生代謝物的復(fù)雜樣品中提取蛋白質(zhì)的方法［20］；在酚－甲醇／醋酸銨沉淀法中本實驗獲得了300多個蛋白質(zhì)斑點，提取效果較好，與黃雅芳等［21］結(jié)果相似；而采用丙酮／沉淀法純化的細胞壁蛋白效果要好于上述方法，且采用24cm 的大膠條更有利于楊樹細胞壁蛋白斑點的展現(xiàn)，斑點達550個，是較為理想的純化方法。在本研究中影響雙向電泳蛋白斑點數(shù)量和清晰度的因素主要有2 個：一是膠條pH 范圍，pH4～7膠條對楊樹細胞壁蛋白的分辨率較有利，分離出的蛋白質(zhì)斑點多而密集、清晰度高，減少了蛋白斑點的堆積和重疊，而用pH 3～10 膠條蛋白質(zhì)斑點較少，低豐度蛋白不清晰，蛋白斑點堆積、重疊。相反，莖段質(zhì)外體蛋白采用pH 3～10的膠條效果更好，說明不同器官之間蛋白質(zhì)分子量區(qū)域有差異，需要的pH 值也不同。二是膠條長度，采用24cm 膠條比17cm 的膠條得到的蛋白斑點多。

楊樹是林木研究的模式樹種，而胞外蛋白在應(yīng)答環(huán)境脅迫和環(huán)境適應(yīng)性中具有非常重要的作用［3］。本研究利用NL895楊組培苗的葉片和莖段初步建立了楊樹胞外蛋白的雙向電泳技術(shù)體系，為開展楊樹細胞壁蛋白的研究提供了前提條件，為差異蛋白的分析奠定了基礎(chǔ)。莖段質(zhì)外體蛋白的提取、純化的方法還需進一步完善和探索。

圖版Ⅰ NL895楊組培苗（A、B）、葉片細胞碎片超聲波處理（C～E）及超聲波葉碎片顯微檢測（F、G）PlateⅠ Plantlets of NL895poplar（A，B）；detection of the cell breaking status by microscopic（C－G）

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