基因修飾內(nèi)皮祖細(xì)胞在冠心病治療中的研究進(jìn)展

馬國(guó)棟 梁偉鈞（通訊作者）524000廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

基因修飾內(nèi)皮祖細(xì)胞在冠心病治療中的研究進(jìn)展

馬國(guó)棟 梁偉鈞（通訊作者）
524000廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

冠心病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制是冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮損傷和修復(fù)兩者間的平衡受到破壞。目前關(guān)于冠心病治療方法主要包括藥物治療、冠脈搭橋、支架介入等。內(nèi)皮祖細(xì)胞在一定條件下能分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生。但是內(nèi)皮祖細(xì)胞在人體組織中含量極低，遠(yuǎn)不夠?yàn)橐浦仓委熕?。另外，有多?xiàng)研究顯示，年齡大、冠心病、糖尿病、高血壓患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞相比正常者量更少，且其功能顯著下降。近年有許多學(xué)者提出通過基因修飾的內(nèi)皮祖細(xì)胞能解決上述問題。下面筆者為基因修飾內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療的研究予以綜述，為臨床治療冠心病提供新思路。

冠心?。粌?nèi)皮祖細(xì)胞；基因修飾

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease）又稱冠心病，是指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞導(dǎo)致心肌缺血缺氧而引起的心臟病，其中一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制是冠脈內(nèi)皮損傷和修復(fù)兩者間的平衡受到破壞。目前關(guān)于冠心病治療方法主要包括藥物治療、冠脈搭橋、支架介入等，這些方法雖可使閉塞的血管再通，但并不能挽救微小血管的損害，同時(shí)還有心肌缺血再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)。這迫使人們?nèi)ふ乙粋€(gè)更好的方法來治療冠心病。內(nèi)皮祖細(xì)胞是成體干細(xì)胞中的一種，在一定條件下能分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生。但是內(nèi)皮祖細(xì)胞在人體組織中含量極低，遠(yuǎn)不夠?yàn)橐浦仓委熕?。另外，有多?xiàng)研究顯示，年紀(jì)大、冠心病、糖尿病、高血壓患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞相比正常人數(shù)量更少，而且其功能顯著下降。近年有許多學(xué)者提出通過基因修飾的內(nèi)皮祖細(xì)胞能解決上述問題。下面筆者為基因修飾內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療的研究予以綜述，為臨床治療冠心病提供新思路。

內(nèi)皮祖細(xì)胞概要

內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial progenitor cell，EPCs），是成體干細(xì)胞中的一種，在一定條件下可分化為內(nèi)皮細(xì)胞且具有內(nèi)皮細(xì)胞功能。1997年，Asahara等首次證明了外周血中存在能在體外增殖、遷移并分化為內(nèi)皮細(xì)胞的EPCs[1]。隨著對(duì)EPCs進(jìn)一步研究證實(shí)，它主要來源于骨髓與臍帶血中，而外周血中只有極少量分布。2004年，Hur等發(fā)現(xiàn)人外周血中存在兩種不同類型的EPCs，即早期EPCs和晚期EPCs[2]。早期EPCs是指在體外培養(yǎng)3～5d后出現(xiàn)的梭形細(xì)胞，主要參與機(jī)體血液系統(tǒng)的發(fā)育及炎性免疫應(yīng)答，而沒有形成血管的功能；EPCs是指體外培養(yǎng)2周后出現(xiàn)的鋪路石樣細(xì)胞，它具有細(xì)胞增殖、遷移、粘連及在基底膜基質(zhì)上形成血管的能力。因其EPCs不具備內(nèi)皮細(xì)胞的功能，且不具有增殖能力，不能傳代培養(yǎng)，所以早期EPCs不是真正意義上的EPCs。而晚期EPCs能分化為內(nèi)皮細(xì)胞且具有內(nèi)皮細(xì)胞的功能，是真正意義的EPCs。

內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定

目前國(guó)際上比較認(rèn)可的是采用免疫細(xì)胞法與雙熒光染色法的共同鑒定EPCs。免疫細(xì)胞法主要有兩種，一種是免疫磁珠法，另一種是流式細(xì)胞分選法。這兩種方法各有優(yōu)劣，但共同點(diǎn)都是通過檢測(cè)細(xì)胞表面的特有抗原標(biāo)記物，如KDR+、CD133+、CD34+等。雖然以上細(xì)胞表面標(biāo)志物為鑒定EPCs的經(jīng)典標(biāo)記物，但是這些標(biāo)記物并不具有特異性。KDR主要存在于分化成熟且參與血管新生的內(nèi)皮細(xì)胞表面，同時(shí)它在來源于內(nèi)胚層的肝祖細(xì)胞的表面也有表達(dá)。而CD34主要表達(dá)于骨髓來源的造血干細(xì)胞表面，其在介導(dǎo)細(xì)胞間黏附作用中起到重要作用。CD133是造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記物，它能表達(dá)于人臍帶血來源CD34-造血干細(xì)胞的表面。同時(shí)它還能在EPCs表面表達(dá)，但不能表達(dá)于成熟的內(nèi)皮細(xì)胞表面。故一般用同時(shí)表達(dá)KDR+、CD133+、CD34+這三種特有標(biāo)記物來共同鑒定EPCs。雙熒光染色法是應(yīng)用EPCs具有吞噬DiI-Ac-LDL，結(jié)合FITC-UEA-1的特性，通過熒光顯微鏡觀察到，EPCs吞噬DiI-Ac-LDL而在細(xì)胞漿中呈現(xiàn)紅色熒光，EPCs結(jié)合FITC-UEA-1而在細(xì)胞膜上呈現(xiàn)綠色熒光[3]。

內(nèi)皮祖細(xì)胞與血管新生

血管新生（angiogenesis）是指在機(jī)體中內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、增殖、管腔形成并發(fā)展成一個(gè)有血流供應(yīng)系統(tǒng)的過程。多項(xiàng)研究表明，EPCs的增殖、動(dòng)員、募集在血管新生機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用。有研究表明當(dāng)機(jī)體血管受損、組織缺血缺氧時(shí)，骨髓EPCs會(huì)動(dòng)員到外周血中，通過定向靶位作用遷移到缺血區(qū)域，參與血管新生[4]。雖然這其中機(jī)制尚未明確，但多位學(xué)者研究表明，EPC相關(guān)細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子在其中發(fā)揮著重要作用。

EPCs移植治療局限性與新思路

雖然上述移植EPCs治療冠心病已經(jīng)被多項(xiàng)研究支持其可行性，但是EPCs在人體組織中含量極低，遠(yuǎn)不夠?yàn)橐浦仓委熕?。另外有多?xiàng)研究顯示，年紀(jì)大、冠心病、糖尿病、高血壓患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞相比正常者數(shù)量更少，而且其功能顯著下降。為了解決上述問題，最近很多學(xué)者提出通過對(duì)EPCs基因修飾來提高EPCs的增殖、血管再生能力，從而來克服上述提到的困難，并經(jīng)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究證明其可行性。

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄 酶 （The telomeras rever transcriptase TERT）是調(diào)節(jié)細(xì)胞生命周期的關(guān)鍵酶，其通過催化修飾端粒酶來提高端粒酶的活性來維持端粒的穩(wěn)定性，從而抑制細(xì)胞衰老或凋亡。2002年，Murasawa等通過將轉(zhuǎn)染hTERT的EPCs應(yīng)用于后肢循環(huán)缺血的大鼠模型中[5]，21 d后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs的增殖、遷移、抗衰老、再生血管能力較對(duì)照組有明顯增強(qiáng)。2012年，Shuai等通過將轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs移植于5/6腎臟切除的大鼠模型中，12周后發(fā)現(xiàn)其能減少腎間質(zhì)纖維化、增大毛細(xì)血管密度來提高腎功能[6]。這為我們用TERT基因修飾EPC治療冠心病提供理論依據(jù)。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因：研究表明內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS）是血管內(nèi)皮合成一氧化氮（NO）的關(guān)鍵酶，其催化內(nèi)皮細(xì)胞生成的NO為脂溶性的，能很快從細(xì)胞膜滲透于平滑肌細(xì)胞，使其松弛，達(dá)到擴(kuò)張血管調(diào)節(jié)血管張力，同時(shí)也能滲透進(jìn)入血小板，使血小板活性降低，抑制其凝集和向血管內(nèi)皮的黏附，從而防止血栓的形成，防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，在維持正常血管功能中起到重要作用。最近有研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、促紅細(xì)胞生成素、他汀類藥物、雌二醇等能增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的分泌，從而促進(jìn)EPCs遷移及提高損傷血管再內(nèi)皮化能力，而采用eNOS基因敲除或NOS抑制劑能抑制EPCs修復(fù)血管內(nèi)皮的功能。2014年，催等將經(jīng)eNOS基因轉(zhuǎn)染的EPCs經(jīng)尾靜脈途徑作用于頸動(dòng)脈內(nèi)皮受損的大鼠模型中，14 d后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染eNOS基因組較對(duì)照組，管內(nèi)膜的抗增生及改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能明顯增強(qiáng)[7]。

人組織型激肽釋放酶基因：人組織型激肽釋放酶（Human Tissue kallikrein，hTK）為激肽釋放酶（kallikrein，KLK）中的一員，是激肽系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，主要存在于胰腺、腎臟、血管等組織中，其能將低分子量激肽原（LMWK）轉(zhuǎn)化為具有舒張血管、抑制心肌重構(gòu)、抑制平滑肌增生及缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的緩激肽。2013年Fu等將轉(zhuǎn)染hTK-162基因的EPCs作用于后肢缺血的大鼠中[8]，21 d后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hTK-162基因的EPCs組較對(duì)照組，其后肢缺血周邊帶的毛細(xì)血管密度及血流灌注量增加。這說明通過hTK基因的轉(zhuǎn)染能增強(qiáng)EPCs血管再生能力。同年，Yao等將轉(zhuǎn)染hTK基因的EPCs應(yīng)用于急性心肌梗死小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)hTK基因的過表達(dá)能增加梗死周邊帶毛細(xì)血管密度、抑制心肌細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)左室射血功能[9]。這說明通過hTK基因的轉(zhuǎn)染能增強(qiáng)EPCs血管再生功能，這表明經(jīng)hTK基因轉(zhuǎn)染的EPCs在治療缺血性疾病中具有巨大的潛力。

蛋白激酶B與血紅素氧合酶-1：蛋白激酶B（protein kinase B）又稱AKT，是磷酸肌醇在細(xì)胞膜中被激活的一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，其在血管新生與維持血管功能中有著重要作用。2005年，Ackah等通過下調(diào)EPCs中AKT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EPCs的遷移能力及一氧化氮生物活性降低，最終導(dǎo)致后肢缺血小鼠模型梗死部位的加重[10]。血紅素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1，HO-1）是血紅素降解的關(guān)鍵酶，在血管新生的機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。2007年，Deshane等發(fā)現(xiàn)HO-1基因敲除的小鼠中，EPCs的遷移能力及成血管功能會(huì)嚴(yán)重受損[11]?；谶@兩種酶在血管新生的特性，2012年，Brunt等通過EPCs過表達(dá)Akt與HO-1，發(fā)現(xiàn)EPCs的遷移、黏附及新生血管能力得到提高，從而增強(qiáng)了EPCs在治療缺血性疾病的作用[12]。

展望

目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了多篇關(guān)于基因修飾EPCs治療缺血性疾病的研究，其中修飾的基因的種類是多種多樣的，也都顯示其能增強(qiáng)EPCs某方面的功能，證明經(jīng)基因修飾EPCs治療缺血性疾病的效果要優(yōu)于單純EPCs移植。但是關(guān)于基因修飾EPCs移植治療的研究目前只限于小規(guī)模的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。要充分評(píng)估這種新穎的治療方法的安全性和臨床應(yīng)用于冠心病患者的有效性還有很長(zhǎng)的路要走。但經(jīng)上述關(guān)于基因修飾EPCs的研究論證，我們有理由相信，基因修飾EPCs移植治療是個(gè)很有潛力的方法，能為臨床治療冠心病提供一個(gè)全新的途徑。

[1]Asahara T,Murohara T,Sullivan A,etal.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275（5302）：964-967.

[2]Hur J,Yoon CH,Kim HS,et al.Characterization of Two Types of Endothelial Progenitor Cells and Their Different Contributions to Neovasculogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24（2）：288-293.

[3]李嵐,姚玉宇,馬根山.芎嗪對(duì)體外血管內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào),醫(yī)學(xué)版,2009,28（3）：180-184.

[4]Steiner S,Niesaner A,Ziegler S,et al.Endurance training increases thenumber of endothelia progenitor cells in patients with cardiovascular riskand coronary artery disease [J].Athereselerosis,2005,181：305-310.

[5]Murasawa S,Llevadot J,SilverM,etal.Constitutive human telomerase reverse transcriptase expression enhances regenerative properties of endothelial progenitor cells[J].Circulation,2002,106（9）：1133-1139.

[6]Shuai L,Li X,He Q,et al.Angiogenic effectof endothelial progenitor cells transfected with telomerase reverse transcriptase on peritubularmicrovessel in five out of six subtotal nephrectomy rats[J].Ren Fail.2012,34（10）：1270-1280.

[7]Cui B,Huang L,Fang Y,et al.Transplantation of endothelial progenitor cells overexpressingendothelialnitric oxide synthaseenhances inhibition of neointimal hyperplasia and restores endothelium-dependent vasodilatation[J].Microvasc Res,2011,81（1）：143-150.

[8]Shen Shen Fu,Fu Ji Li,Yuan Yuan Wang,et al.Kallikrein Gene-Modified EPCs Induce Angiogenesis in Rats with Ischemic Hindlim lb and Correlatewith Integrin avβ3 Expression[J].PLoSOne,2013,8（9）：730.

[9]Yuyu Yao,Zulong Sheng,Yefei Li,et al.Tissue Kallikrein-modified human endothelial progenitor cell implantation improves cardiac function via enhanced activation of akt and increased angiogenesis[J].Laboratory Investigation,2013,93：577-591.

[10]Ackah E,Yu J,Zoellner S,et al.Akt1/protein kinase Balpha is critical for ischemic and VEGF-mediatedangiogenesis[J].J Clin Invest,2005,115：2119-2127.

[11]Deshane J,Chen S,Caballero S,et al.Stromal cell-derived fator1 promotes angiogenesis via a heme oxygenase1 dependent mechanism[J].JExp Med,2007,204：605-618.

[12]Brunt KR,Wu J.Ex vivo Akt/HO-1 gene therapy to human endothelial progenitor cells enhancesmyocardial infarction recovery[J].Cell Transplant,2012,21（7）：1443-1461.

Research progressofgenemodified endothelialprogenitor cells in the treatmentof coronary heart disease

Ma Guodong,LiangWeijun（Correspondingauthor）
InternalMedicine-CardiovascularDepartment,the Affiliated HospitalofGuangdongMedicalCollege 524000

Foundation item guangdong province science and technology plan project（00300200135561018）

The pathogenesis of coronary heart disease is complex,one of the important pathogenesis is the imbalance in the coronary endothelial injury and repair.Currently,treatmentof coronary heartdiseasemainly includes drug therapy,coronary artery bypass graft,bracket intervention and so on.Endothelial progenitor cells can differentiate into endothelial cells under certain conditions,to participate in angiogenesis.But the contentof endothelial progenitor cells is very low in human tissues,it is far from enough for transplantation.In addition,several studies have shown that,compared with normal person,endothelial progenitor cells in patients with old age,diabetes,hypertension,coronary heart disease is less,and its function is significantly decreased.In recent years,many scholars put forward thatgenemodified endothelial progenitor cells can solve the above problems.The author reviews the research ofgenesmodified endothelial progenitor cells transplantation treatment,to provide new ideas for clinical treatmentof coronary heartdisease.

Coronaryheartdisease；Endothelialprogenitor cells；Genemodification

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.20.1

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（00300200135561018）