利用熱帶假絲酵母發(fā)酵處理玉米秸稈堿法制漿廢液的研究

范金石，劉祝兵，管斌，*，孔青

（1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

利用熱帶假絲酵母發(fā)酵處理玉米秸稈堿法制漿廢液的研究

范金石1，劉祝兵1，管斌1，2*，孔青2

（1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

以玉米秸稈堿法制漿廢液為原料，對熱帶假絲酵母的培養(yǎng)條件進行了研究。菌種經(jīng)過培養(yǎng)、馴化和優(yōu)化，最終得出了處理廢液的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度28℃、pH值5.5、發(fā)酵時間48 h、磷酸氫二鉀1.5 g/L、硫酸鎂1.0 g/L、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、搖瓶裝液量50 mL/250 mL，菌體生物量能達到8.583 g/L，化學(xué)需氧量（CODCr）去除率達到62.8%，生物需氧量（BOD5）去除率達到53.7%，為玉米秸稈堿法制漿廢液資源化利用和降低廢水排放量提供了新的途徑。

玉米秸稈；堿法制漿廢液；熱帶假絲酵母

造紙業(yè)是傳統(tǒng)的用水大戶，也是造成水污染的重要污染源之一。目前我國造紙工業(yè)廢水排放量及化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）排放量均居我國各類工業(yè)排放量的首位，未經(jīng)處理的廢液中CODCr較高，由此帶來的環(huán)境問題備受人們的關(guān)注[1]。堿法制漿廢液中含有大量的有機物、氮（N）等營養(yǎng)成分，很多能為微生物利用。

熱帶假絲酵母（Candida tropialis）是酵母單細(xì)胞生物。它具有生長速度快、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點，是目前最重要的微生物蛋白的來源之一[2]。利用熱帶假絲酵母發(fā)酵法處理高濃度玉米秸稈堿法制漿廢液，既可降低廢液化學(xué)耗氧量（CODCr）和生物耗氧量（biochemical oxygen demand，BOD5），又能生產(chǎn)微生物飼料—飼料酵母。

本研究利用熱帶假絲酵母發(fā)酵處理過濾后的玉米秸稈堿法制漿廢液，探討最佳玉米秸稈堿法制漿廢液的生物污水處理工藝條件，旨在為熱帶假絲酵母處理廢液并降低廢水的COD和BOD提供依據(jù)。本研究考察培養(yǎng)基質(zhì)成分調(diào)節(jié)以及發(fā)酵時間、培養(yǎng)液pH值和發(fā)酵溫度等處理條件對處理玉米秸稈堿法制漿廢液效果的影響，以期為玉米秸稈堿法制漿廢液資源化利用和降低廢水排放量提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

玉米秸稈：產(chǎn)于青島市膠南；熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）2.0637：中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基采用瓊脂固體培養(yǎng)基：10°Bx麥芽汁，加2%的瓊脂，pH 5.5，121℃滅菌20 min。。

種子培養(yǎng)基采用葡萄糖培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、麩皮浸出液（麩皮∶水=1∶10）100mL/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

馴化培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、麩皮浸出液（麩皮∶水=1∶10）100 mL/L，pH 5.5，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米秸稈堿法制漿廢液100 mL、葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、麩皮浸出液（麩皮∶水= 1∶10）100 mL/L、121℃滅菌20 min。

廢液：取玉米秸稈500 g，NaOH 90 g，蒸餾水630 mL于高壓蒸煮鍋中，升溫至140℃，蒸煮2 h后倒出物料，收集廢液以備用。

1.1.3 化學(xué)試劑

NaOH、稀鹽酸（0.1 mol/L HCl）、高錳酸鉀（K2MnO4）、濃硫酸（98%H2SO4）、硫酸銅（CuSO4）、重鉻酸鉀（K2Cr2O7）、酒石酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀（HOOCC6H4COOK）均為分析純：臨沂雙潤化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQS1型電熱蒸煮鍋：陜西科技大學(xué)機械廠；AR213電子分析天平：上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱：東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；LDS-10B型離心機：北京雷博爾離心機有限公司；BCM-1000型超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；ZDX-35BI型自動滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；COD-571型化學(xué)需要量分析儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)方法

菌種活化：將菌種用接種環(huán)接入斜面培養(yǎng)基中，放入28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h。

液體種子的制備：將斜面上生長良好的菌種制成懸浮液，用移液槍接入50mL種子培養(yǎng)基（裝液量50mL/250mL）中，放到恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)48 h，備用。

搖床培養(yǎng)：將馴化后的菌種按10%接種量接入由堿法制漿廢液（過濾后）組成的培養(yǎng)基中（裝液量100 mL/250 mL），瓶口用8層紗布封好后，再放到恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。

1.3.2 分析方法

廢液pH值的測定：采用酸度計測定；廢液密度、固形物含量、殘堿的測定：根據(jù)文獻[3]中方法進行測定；總糖及還原糖的測定[4]：斐林試劑熱滴定法[5]；CODCr測定：重鉻酸鉀化學(xué)法[5]；BOD5測定：稀釋接種法[6]。

1.3.3 菌體干質(zhì)量的測定

發(fā)酵液經(jīng)過4 000 r/min離心后所得菌體，用去離子水沖洗后，在100℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，稱菌體質(zhì)量（以絕干計），并測定發(fā)酵液其他各項指標(biāo)。

1.3.4 蒸煮廢液木質(zhì)素脫除處理

取蒸煮廢液500mL于燒杯，滴加足量稀硫酸（6 mol/L），靜置24 h后，過濾，收集濾液，用于后期廢液處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 廢液的制備及其主要成分

廢液的成分與性質(zhì)會直接影響菌體的發(fā)酵結(jié)果，因此對玉米秸稈堿法制漿廢液主要成分進行了分析，結(jié)果如表1所示。從表1可看出，在秸稈堿法制漿廢液的pH值為9.2，其中所含的糖類、有機碳等物質(zhì)都是易為熱帶假絲酵母利用的營養(yǎng)成分，可作為微生物發(fā)酵處理的原料。

2.2 熱帶假絲酵母處理堿法制漿廢液發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

2.2.1 磷源對菌體生長和CODCr、BOD5去除率的影響

微生物主要是從無機磷化物中獲得磷，本實驗在50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中添加磷酸氫二鉀和磷酸氫二鈉兩種磷源（起始添加量均為1.5 g/L），考察磷源對菌體生長和CODCr、BOD5去除率的影響，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可看出，玉米秸稈堿法制漿廢液不能為菌體的生長提供足夠的磷。比較磷酸氫二鉀和磷酸氫二鈉作為磷源時的發(fā)酵結(jié)果，磷酸氫二鉀添加量1.5 g/L時菌體干質(zhì)量和CODCr、BOD5去除率均達到最大值，分別為8.564 g/L、62.5%、54.3%；磷酸氫二鈉添加量1.5 g/L時菌體干質(zhì)量和CODCr、BOD5去除率均達到最大值，分別為8.397g/L、59.4%、53.1%。所以，前者發(fā)酵效果較好。因此，選擇磷酸氫二鉀1.5 g/L為最佳磷源添加量。

2.2.2 氮源對菌體生長和CODCr、BOD5去除率的影響

酵母生長需要添加一定量的氮源，發(fā)酵液中氮源含量有限，本實驗選擇硝酸銨和硫酸銨兩種常見的無機氮源，考察氮源對菌體生長和CODCr、BOD5去除率的影響，發(fā)酵結(jié)果如圖2所示。

從圖2（A）可知，隨著硝酸銨添加量的增加，發(fā)酵效果更加理想。當(dāng)添加量為1.0 g/L時，菌體干質(zhì)量和CODCr、BOD5去除率達到最大值，分別為8.639 g/L、63.2%、55.2%。由圖2（B）可看出，硫酸銨對發(fā)酵效果影響較為緩和，添加量在0～2 g/L時，菌體干質(zhì)量、CODCr、BOD5去除率逐漸升高，添加量＞2 g/L時，3個指標(biāo)開始降低?？赡艿脑蚴前l(fā)酵液中含有SO42-離子，抑制菌體生長，且硫酸銨添加量在2 g/L時，菌體干質(zhì)量達到最大值為8.601 g/L，此時CODCr、BOD5去除率分別為62.5%、52.8%。結(jié)果表明，硝酸銨發(fā)酵效果優(yōu)于硫酸銨，故選擇硝酸銨1.0 g/L為最適氮源添加量。

2.2.3 無機鹽對菌體生長和CODCr、BOD5去除率的影響

微生物在生長繁殖和生產(chǎn)過程中，需要某些無機鹽作為微生物生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物。本實驗選擇MgSO4和MnSO4兩種無機鹽添加到廢液中，考察了無機鹽對菌體生長和CODCr、BOD5去除率的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3（A）可知，MgSO4添加量為1.0 g/L時，發(fā)酵效果最好，CODCr、BOD5去除率分別能達到63.6%、55.1%，此時菌體干質(zhì)量能達到8.655 g/L。由圖3（B）可知，MnSO4添加量為1.0 g/L時，發(fā)酵結(jié)果較好，CODCr、BOD5去除率達到61.2%、53.8%，此時菌體干質(zhì)量為8.413 g/L。結(jié)果表明，MnSO4發(fā)酵效果不如MgSO4。故選擇MgSO41.0 g/L作為熱帶假絲酵母發(fā)酵的最佳無機鹽添加量。

2.2.4 發(fā)酵時間對菌體生長和CODCr、BOD5去除率的影響

在培養(yǎng)液pH值為5.5，發(fā)酵溫度28℃，接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下，不同發(fā)酵時間下處理結(jié)果如圖4所示。

由圖4可看出，隨著發(fā)酵時間的變化，菌體干質(zhì)量和CODCr、BOD5去除率均隨之變化。在0～48 h，菌種生長較為旺盛，菌體干質(zhì)量和發(fā)酵液CODCr、BOD5去除率逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵時間在48 h時，菌體干質(zhì)量和CODCr、BOD5去除率達到最高，分別為8.012 g/L、51.2%、48.7%；發(fā)酵時間＞48 h后，可能后期發(fā)酵液中有機物被消耗，菌種代謝緩慢，各指標(biāo)逐漸下降，因此確定熱帶假絲酵母處理玉米秸稈堿法制漿廢液的發(fā)酵時間為48 h。

2.2.5 發(fā)酵溫度對菌體生長和CODCr、BOD5去除率的影響

在發(fā)酵時間48 h、培養(yǎng)液pH值5.5、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、搖瓶裝液量50 mL/250 mL的條件下，在不同發(fā)酵溫度條件下進行發(fā)酵的結(jié)果見圖5。

由圖5可看出，溫度對發(fā)酵結(jié)果影響較為顯著。發(fā)酵溫度在24～28℃時菌體快速生長，CODCr、BOD5去除率也逐漸上升。當(dāng)溫度＞28℃，菌體干質(zhì)量和CODCr、BOD5去除率開始下降，說明溫度過高不利于熱帶假絲酵母發(fā)酵生長。溫度在28℃時菌體干質(zhì)量達最大值為7.954 g/L，CODCr、BOD5去除率均達到最高值，分別為52.3%、41.8%，所以確定最佳發(fā)酵溫度為28℃。

2.2.6 培養(yǎng)液pH值對菌體生長和CODCr、BOD5去除率的影響

在發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度28℃、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、搖瓶裝液量50 mL/250 mL的條件下，不同培養(yǎng)液pH值下進行發(fā)酵的結(jié)果如圖6所示。

由圖6可看出，培養(yǎng)液pH值對菌種發(fā)酵的影響非常顯著。pH值在5.0～6.5之間菌種生長較為良好，CODCr、BOD5去除率也有較好的效果。過高或過低的pH值不易于菌種發(fā)酵生長。當(dāng)pH值為5.5時，菌體干質(zhì)量達最大值7.944 g/L，發(fā)酵液CODCr、BOD5去除率達到最高值，分別為50.8%、43.7%，所以確定最適培養(yǎng)液pH值為5.5。

2.2.7 最佳條件下處理廢液實驗

通過探討各因素（發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、pH值、磷源、氮源和無機鹽）對玉米秸稈堿法制漿廢液處理結(jié)果的影響，確定熱帶假絲酵母處理玉米秸稈堿法制漿廢液的最優(yōu)條件為：發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度28℃、pH值為5.5、磷酸氫二鉀1.5 g/L、硝酸銨1.0 g/L、硫酸鎂1.0 g/L。

在優(yōu)化條件下，熱帶假絲酵母對玉米秸稈制漿廢液進行處理后，發(fā)酵液CODCr由原來的128 g/L下降至47.6 g/L，CODCr去除率達到62.8%，BOD5去除率為53.7%，為進一步處理玉米秸稈堿法制漿廢液提供了一定的基礎(chǔ)；同時熱帶假絲酵母在制漿廢液中生長良好，菌體干質(zhì)量達到8.583g/L。因此，利用熱帶假絲酵母處理玉米秸稈堿法制漿廢液，可以達到廢水生物處理和飼料酵母生產(chǎn)的雙重目的。

2.3 發(fā)酵液成分分析

對熱帶假絲酵母在最佳條件下處理后的廢液（發(fā)酵液）進行主要成分分析，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，玉米秸稈堿法制漿廢液經(jīng)過熱帶假絲酵母處理后，廢液中各主要成分含量均有不同程度的下降。其中以還原糖和CODCr下降最為明顯，說明熱帶假絲酵母發(fā)酵需要消耗大量的糖，同時說明玉米秸稈堿法制漿廢液中所含的碳、糖等能為熱帶假絲酵母的生長提供必要的營養(yǎng)成分，有利于其生長。另外，CODCr、BOD5較高的去除率，使發(fā)酵液檢測指標(biāo)達到國標(biāo)3544—2001《造紙工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》中的相關(guān)規(guī)定，也為廢水處理提供一種新途徑。

3 結(jié)論

玉米秸稈堿法制漿廢液中含有可供熱帶假絲酵母發(fā)酵所需的氮和糖類等營養(yǎng)成分，可用來發(fā)酵生產(chǎn)飼料酵母。

熱帶假絲酵母處理玉米秸稈堿法制漿廢液的最佳工藝條件為發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度28℃、pH值為5.5、接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，搖瓶裝液量50 mL/250 mL。在此最佳條件下，菌體干質(zhì)量8.583 g/L，CODCr去除率62.8%，BOD5去除率53.7%。

發(fā)酵后發(fā)酵液中的各主要成分與原廢液相比均有不同程度的下降，熱帶假絲酵母對廢液中的有機物和無機物利用能力較強，使處理發(fā)酵液達到國標(biāo)3544—2001《造紙工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》污水排放標(biāo)準(zhǔn)，也為廢水處理提供一種新途徑。

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FAN Jinshi1,LIU Zhubing1,GUAN Bin1,2*,KONG Qing2
(1.College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science&Technology,Qingdao 266042,China; 2.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Using alkaline pulping spent liquor of corn stalks as raw materials,theCandida tropicalcultivation conditions were studied.By strain cultivation,domestication and optimization,the optimum fermentation conditions of alkaline pulping spent liquor were obtained.The results indicated the optimal conditions were fermentation temperature 28℃,pH 5.5,time 48 h,K2HPO41.5 g/L,MgSO41.0 g/L,inoculum 10%,rotation speed 160 r/min, shake bottle volume 50 ml/250 ml.Under these conditions,the dry cell weight ofC.tropicalwas 8.583 g/L,removal rates of CODCrand BOD5were 62.8%and 53.7%,respectively.The method provided a new way to treat alkaline pulping spent liquor of corn stalks and to reduce the pollution of spent liquor.

corn stalks;alkaline pulping spent liquor;Candida tropialis

X793

A

0254-5071（2015）04-0118-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.027

2015-03-05

青島市公共領(lǐng)域科技支撐計劃項目（11-2-3-63-nsh）；啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室開放課題（K2012002）

范金石（1969-），男，副教授，博士，主要從事天然生物質(zhì)資源開發(fā)與利用的研究工作。

*通訊作者：管斌（1957-），男，教授，博士，主要從事發(fā)酵工程方面的研究工作。