白斑狗魚魚皮中抗凍蛋白的分離純化

田童童，鞏子路，朱新榮，張建*，牛玉靜，劉娟，李甜

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

白斑狗魚魚皮中抗凍蛋白的分離純化

田童童，鞏子路，朱新榮，張建*，牛玉靜，劉娟，李甜

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

以白斑狗魚為研究對(duì)象，選取魚皮組織為試驗(yàn)材料，通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)魚皮抗凍蛋白提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。以抗凍蛋白的熱滯活性（THA）作為考察指標(biāo)，對(duì)提取溫度、提取液的pH值、提取時(shí)間及料液比進(jìn)行探討。結(jié)果表明，在提取溫度8℃、提取液pH值為8.4、提取時(shí)間2 h，料液比1∶3.8（g∶mL）的工藝條件下，模型預(yù)測(cè)的熱滯活性為0.072 0℃。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其熱滯活性為（0.069 0±0.002 4）℃，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值差異較小，表明模型具有一定可靠性。通過柱層析對(duì)白斑狗魚魚皮抗凍蛋白進(jìn)行分離純化，純化后的抗凍蛋白達(dá)到電泳級(jí)，且其分子質(zhì)量約為6 400 u，熱滯活性大約為（0.050 2±0.002 2）℃。

白斑狗魚魚皮；抗凍蛋白；分離；純化

生存于極端寒冷環(huán)境中的硬骨魚類，都可以合成某種抗凍蛋白、抗凍多肽或者是抗凍糖蛋白，以此來保護(hù)自身免受寒冷的迫害[1-2]。抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）又稱熱滯蛋白，具有防止生物有機(jī)體遭受凍害的特殊功能。根據(jù)抗凍蛋白不同的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征將其分為4種類型，分別為AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ和AFPⅣ。然而，盡管蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)各不相同，但是所有的抗凍蛋白都可以通過與冰晶表面特異性的結(jié)合非依數(shù)性的降低溶液的冰點(diǎn)，從而抑制冰晶的進(jìn)一步生長(zhǎng)以達(dá)到保護(hù)體細(xì)胞的目的[3]。

起初，研究學(xué)者認(rèn)為抗凍蛋白的合成僅僅局限于肝臟器官（肝型抗凍蛋白）。肝臟分泌的抗凍蛋白進(jìn)入血液，通過血液流動(dòng)將抗凍蛋白帶入體細(xì)胞的周圍，從而起到保護(hù)體細(xì)胞免受凍害的作用。然而，最近的研究表明，冬季比目魚和杜父魚的上皮細(xì)胞組織中具有合成抗凍蛋白（皮膚型抗凍蛋白）的功能，盡管其具有同樣的熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA），但是這類抗凍蛋白在理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征上都不同于肝型抗凍蛋白[4-5]。

此外，通過上皮組織分泌的抗凍蛋白缺乏信號(hào)傳導(dǎo)功能且與肝型抗凍蛋白的基因序列大不相同，但他們直接存在于體細(xì)胞內(nèi)，因此同樣可以發(fā)揮其耐受寒冷環(huán)境的作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，皮膚型抗凍蛋白已經(jīng)被公認(rèn)為一種新型的抗凍蛋白，棲息于寒冷的海洋環(huán)境中的魚類都具有普遍的抗凍特征[6]。更有學(xué)者認(rèn)為，肝型抗凍蛋白是從皮膚型蛋白進(jìn)化而來[7-8]。

抗凍蛋白因其具有熱滯活性，在冷凍食品加工與儲(chǔ)藏、抗凍作物栽培、漁業(yè)養(yǎng)殖、醫(yī)學(xué)上器官移植和冷凍手術(shù)以及工業(yè)上高級(jí)防凍劑開發(fā)中具有誘人的應(yīng)用前景。盡管科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種抗凍蛋白，然而他們?nèi)匀徊粩鄰男碌馁Y源中尋找凍活性更強(qiáng)的抗凍蛋白，為開發(fā)高產(chǎn)量、高活性和低成本的抗凍蛋白提供更有價(jià)值的理論依據(jù)，新疆由于特殊的地理環(huán)境而使得生物具有特殊的生理特征，為研究者們尋找新的抗凍蛋白提供了良好的資源。

本試驗(yàn)以生存于新疆北部額爾齊斯河流域的白斑狗魚為研究對(duì)象，以魚皮作為試驗(yàn)原材料，通過傳統(tǒng)的分離方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取抗凍蛋白的工藝參數(shù)，并且通過陰離子交換柱層析及凝膠柱層析對(duì)抗凍蛋白進(jìn)行純化，以期為今后抗凍蛋白的開發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白斑狗魚：購(gòu)買于石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、考馬斯亮藍(lán)R-250、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylene-diamine，TEMED）：美國(guó)Sigma公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-50、弱陰離子（DEAE）高流速瓊脂糖凝膠：美國(guó)GE-Healthcare Bio-Sciences AB公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C精密酸度計(jì)、Heraeus Multifuge X3R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美瑞泰克科技有限公司；FA1004型電子天平：上海精科電子天平廠；Mini-protein III型電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)：日本Rikakikai公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將白斑狗魚麻醉，將其上皮組織從魚體剝離，用液氮冷凍后立即粉碎，于-70℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。稱取一定量的樣品與等體積的Tris-HCl（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）緩沖溶液充分混合，于4℃冷藏箱中靜置過夜。然后于5 000 r/min，4℃的條件下離心分離10 min，取上清液進(jìn)行冷凍干燥，即為抗凍粗蛋白[9]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以Tris-HCl緩沖液為提取液，分別探討不同提取溫度（-4 ℃、0 ℃、4 ℃、8 ℃、12℃）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL））、pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和提取時(shí)間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）對(duì)抗凍蛋白提取的影響。

熱滯活性（THA）參考VALERIO R P等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

為了得到魚皮抗凍蛋白提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以熱滯活性（THA）（Y）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）對(duì)魚皮抗凍蛋白的提取進(jìn)一步的優(yōu)化，因素與水平編碼如表1所示。

1.3.4 魚皮抗凍蛋白的純化

將抗凍粗蛋白溶解于pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液中，通過0.45μm的針孔濾膜過濾后過夜透析，期間更換透析液3～4次，超濾濃縮后上樣于陰離子柱，用4倍體積Tris-HCl（pH 8.0）洗脫，再用600 mL含0～0.8 mol/L NaCl的Tris-HCl進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，每5 min收集一管，分管收集。將具有活性的蛋白液濃縮至5 mL，以待下一步的凝膠層析[11]。凝膠層析參考DENG G J等[12]報(bào)道的方法。

1.3.5 SDS-PAGE電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）參照CHALKLEYRJ等[13]報(bào)道的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 料液比對(duì)魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

以pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液為提取液，提取溫度設(shè)定為4℃，提取時(shí)間為1.5 h。探討不同料液比對(duì)魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著料液比的不斷增加，抗凍蛋白的熱滯活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶3（g∶mL）時(shí)，魚皮抗凍蛋白的熱滯活性達(dá)到最高，其THA為（0.058 0±0.004 2）℃，繼續(xù)增加料液比的比例，熱滯活性逐漸降低。抗凍蛋白的熱滯活性之所以會(huì)呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榭箖龅鞍椎臐舛扰c其熱滯活性有關(guān)。起初抗凍蛋白的熱滯活性隨著料液比增加的增加，主要是因?yàn)槠淇箖龅鞍椎臐舛仍絹碓礁撸虼藷釡钚砸苍絹碓酱?，隨著提取液不斷增加，在樣品中總蛋白量不變的情況下，其抗凍蛋白的濃度則隨之降低，因而造成其熱滯活性下降。

2.1.2 pH值對(duì)魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

以Tris-HCl緩沖液為提取液，提取溫度設(shè)定為4℃，提取時(shí)間為1.5 h，料液比為1∶3（g∶mL），探討不同pH值的提取液對(duì)魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，抗凍蛋白的熱滯活性隨著pH值的升高而不斷地上升，當(dāng)提取液的pH值為8.0時(shí)，其熱滯活性達(dá)到最高，為（0.063 0±0.002 1）℃。當(dāng)提取的pH值＞8.0時(shí)，其熱滯活性似有下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶解度與提取液的酸堿性有關(guān)。在酸性條件下蛋白質(zhì)的溶解度較低而在堿性條件下溶解度較高而造成的。隨著pH值的增加，更多的抗凍蛋白溶出使其濃度升高，因而熱滯活性也在不斷的增加。然而，當(dāng)提取液pH值為9.0時(shí)，其熱滯活性似有下降趨勢(shì)。雖然堿性環(huán)境條件下有益于蛋白質(zhì)的溶出，但是強(qiáng)堿會(huì)破壞抗凍蛋白的空間結(jié)構(gòu)從而影響其功能性質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致其熱滯活性降低。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

以pH值為8.0的Tris-HCl緩沖液為提取液，提取溫度設(shè)定為4℃，料液比為1∶3（g∶mL），探討不同提取時(shí)間對(duì)魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，抗凍蛋白的熱滯活性隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，其熱滯活性達(dá)到最高，為（0.067 0±0.001 5）℃。然而當(dāng)提取時(shí)間＞1.5 h時(shí)，抗凍蛋白的熱滯活性基本保持穩(wěn)定不變。這主要是因?yàn)轸~皮抗凍蛋白在提取液中溶出速率有一定的相關(guān)性，在1.5 h之前，魚皮抗凍蛋白隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸溶解于緩沖溶液中，其濃度也隨之升高，因而熱滯活性逐漸增加。然而，當(dāng)提取時(shí)間＞1.5 h后，魚皮抗凍蛋白已經(jīng)基本完全溶解于緩沖溶液中，其濃度達(dá)到了最大，故熱滯活性在此之后基本保持不變。

2.1.4 不同溫度對(duì)魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響

以pH值為8.0 Tris-HCl緩沖液為提取液，提取時(shí)間為1.5 h，料液比為1∶3（g∶mL），探討不同提取溫度對(duì)魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，抗凍蛋白的熱滯活性隨著提取溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)提取溫度為8℃時(shí)，熱滯活性達(dá)到最高，為（0.075 0±0.001 9）℃。溫度過高會(huì)使本來生存于極端寒冷環(huán)境中的白斑狗魚魚皮蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，使得空間結(jié)構(gòu)排列緊密的蛋白質(zhì)變得松散，更有益于蛋白質(zhì)的溶出，如此抗凍蛋白的濃度升高，熱滯活性也逐漸增加。繼續(xù)升高溫度則會(huì)使蛋白質(zhì)的固有屬性發(fā)生質(zhì)的變化，進(jìn)而影響了抗凍蛋白的熱滯活性。

2.2 響應(yīng)面分析法結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了得到更優(yōu)的分離提取抗凍蛋白的工藝參數(shù)，利用Design-Expert 8.0軟件中的中心組合設(shè)計(jì)(center composite design，CCD)原理對(duì)4個(gè)單因素進(jìn)一步優(yōu)化。響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果如表3所示。

由表3可知，該響應(yīng)面模型的P=0.000 2＜0.001，因此試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果可靠，該模型適用于優(yōu)化本試驗(yàn)的工藝參數(shù)。PX2＜0.000 1，統(tǒng)計(jì)學(xué)表示差異極顯著，故pH值對(duì)其影響較大。各因素之間的交互作用對(duì)白斑狗魚魚皮抗凍蛋白提取的影響也較為顯著，如PX2X3=0.006 8＜0.05，說明pH值和提取時(shí)間的交互作用較顯著，同理PX2X4=PX3X4= 0.038 4＜0.05，表明pH值與料液比、提取時(shí)間與料液比之間的交互作用差異性也顯著。

各個(gè)因素經(jīng)過回歸擬合后的回歸方程為：

通過軟件求解方程，并根據(jù)實(shí)際操作條件得出最優(yōu)工藝條件為提取溫度8℃，提取液pH值為8.4，提取時(shí)間2 h，液料比1∶3.8（g∶mL），該條件下魚皮中抗凍蛋白熱滯活性為0.072 0 ℃。

響應(yīng)曲面圖是響應(yīng)值與各因素之間互相影響構(gòu)成的三維立體圖形及二維等高圖，能夠較為全面的反映出其中兩兩因素之間對(duì)響應(yīng)值的關(guān)系[14-15]，試驗(yàn)的響應(yīng)曲面如圖5所示。

由圖5A可知，對(duì)熱滯活性影響較為顯著的是pH值，而溫度影響較小。熱滯活性隨著pH值升高不斷增加，隨著提取溫度升高則未發(fā)生明顯變化。由圖5B可知，兩因素與響應(yīng)值并未形成明顯的曲面圖形，熱滯活性沒有增減趨勢(shì)。由圖5C可知，料液比對(duì)魚皮抗凍蛋白的熱滯活性的影響顯著，而提取溫度則對(duì)其沒有明顯影響。熱滯活性隨著溫度不斷升高未呈現(xiàn)出增減趨勢(shì)，而隨著液料比的不斷上升則先呈現(xiàn)增后減之趨勢(shì)，故液料比的影響較大。由圖5D可知，pH值與提取時(shí)間的交互作用對(duì)白斑狗魚魚皮抗凍蛋白的熱滯活性具有明顯的二次效應(yīng)，響應(yīng)曲面坡度較陡，說明二者之間的交互作用對(duì)其熱滯活性的影響極顯著。由圖5E可知，pH值和液料比對(duì)熱滯活性都表現(xiàn)出二次效應(yīng)，表明熱滯活性隨著緩沖液pH值和液料比的增加而升高，說明二者之間交互作用對(duì)熱滯活性的影響非常顯著。由圖5F可知，熱滯活性隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)并沒有明顯的變化，而隨著液料比的增加則呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。

綜上所述，提取溫度對(duì)白斑狗魚魚皮抗凍蛋白熱滯活性的影響較小，緩沖溶液的pH值對(duì)其影響較大。此外，pH值，提取時(shí)間與料液比三者之間，兩兩因素對(duì)其熱滯活性的差異性影響較為顯著。

2.3 魚皮中抗凍蛋白的分離純化

由圖6可知，經(jīng)DEAE-Sepharose陰離子交換柱后有一個(gè)吸收峰出現(xiàn)，將該峰下的收集液經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后為雜蛋白，如圖7A所示。將吸收峰較高的抗凍蛋白樣品收集合并，濃縮后過分子篩柱進(jìn)行純化。經(jīng)Sephadex G-50凝膠層析后也有吸收峰出現(xiàn)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)該峰處的蛋白質(zhì)達(dá)到電泳純，其分子質(zhì)量約為6 400 u，如圖7B所示，THA大約為（0.050 2±0.002 2）℃。

3 結(jié)論

白斑狗魚魚皮中抗凍蛋白提取的最佳工藝條件為提取溫度8℃、pH值為8.4、提取時(shí)間2 h，液料比1∶3.8（g∶mL），該條件下模型預(yù)測(cè)魚皮中抗凍蛋白的熱滯活性為0.072 0℃。為了驗(yàn)證模型的可靠性，進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示白斑狗魚魚皮中抗凍蛋白的熱滯活性為（0.069 0±0.002 4）℃，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。利用離子層析及凝膠層析獲得了電泳級(jí)的魚皮抗凍蛋白，且只含有一個(gè)分子質(zhì)量約為6400u的亞基。同時(shí)，測(cè)其THA大約為（0.0502±0.0022）℃。

[1]FLETCHER G L,GODDARD S V,DAVIES P L,et al.New insight into fish antifreeze proteins:physiological significance and molecular regulation[M].New York:Cambridge Press,1988.

[2]EWART K V,LIN Q,HEW C L.Structure,function and evolution of antifreeze proteins[J].Cell Mol Life Sci,1999,55(2):271-283.

[3]FLETCHER G L,HEW C L,DAVIES P L.Antifreeze proteins of teleost fishes[J].Annu Rev Physiol,2001,63(1):359-390.

[4]GONG Z,EWART K V,HU Z,et al.Skin antifreeze protein genes of the winter flounder,Pleuronectes americanus,encode distinct and active polypeptides without the secretory signal and prosequence[J].J Biol Chem, 1996,271(8):4106-4112.

[5]LOW W K,LIN Q,STATHAKIS C,et al.Isolation and characterization of skin-type,type I antifreeze polypeptides from the longhorn sculpin, Myoxocephalus octodecemspinosus[J]. J Biol Chem,2001,276(15): 11582-11589.

[6]KAO M H,FLETCHER G L,WANG N C.The relationship between molecular weight and antifreeze polypeptide precursor from the sea ravenHemitripterus americanus[J].J Biol Chem,1986,261(3):15690-15695.

[7]GONG Z,FLETCHER G L,HEW C L.Tissue distribution of fish antifreeze protein mRNA[J].Can J Zool,1992,70(4):810-814.

[8]SCHAGGER H,JAGOW G V.Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa[J].Anal Biochem,1987,166(1):368-379.

[9]EVANS R T,FLETCHER G L.Isolation and purification of antifreeze proteinsfromskintissueofsnailfish,cunner and sea raven[J].BBA:Proteins Proteom,2004,1700(2):209-217.

[10]VALERIO R P,KAO M H,FLETCHER G L.Thermal hysteresis activity in the skin of the cunner,Tautogolabrus adspersus[J].Can J Zool, 1990,68(5):1065-1067.

[11]FEI Y B,WEI L B,GAO S Q,et al.Isolation,purification and characterization of secondary structure of antifreeze protein fromAmmopiptanthus mongolicus[J].Chinese Sci Bull,2001,46(6):495-498.

[12]DENG G J,LAURSEN R A.Isolation and characterization of an antifreeze protein from the longhorn sculpin,Myoxocephalus octodecimspinosis[J].Biochem Biophys Acta,1988,1388(2):305-314.

[13]CHALKLEY R J,BURLINGAME A L.Identification of GlcNAcylation sites of peptides and alpha-crystallin using Q-TOF mass spectrometry [J]. J Am Soc Mass Spectr,2001,12(10):1106-1113.

[14]FIRATLIGIL-DURMUS E,EVRANUZ O.Response surface methodology for protein extraction optimization of red pepper seed(Capsicum frutescens)[J].LWT-Food Sci Technol,2010,43(2):226-231.

[15]MA T Z,WANG Q,WU H W.Optimization of extraction conditions for improving solubility of peanut protein concentrates by response surface methodology[J].LWT-Food Sci Technol,2010,43(9):1450-1455.

TIAN Tongtong,GONG Zilu,ZHU Xinrong,ZHANG Jian*,NIU Yujing,LIU Juan,LI Tian
(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

WithEsox luciusas the research object andE.luciusskin tissue as experimental material,the antifreeze protein(AFP)was isolated and purified by single factor experiment and response surface methodology.Using thermal hysteresis activity(THA)of AFP as index,four factors of extraction temperature,extraction buffer pH,extraction time and solid-liquid ratio was optimized.Eventually,the results showed that the THA of AFP from skin tissues was up to 0.072 0℃under the condition of extraction temperature 8℃,pH 8.4,extraction time 2 h and solid-liquid ratio 1∶3.8(g∶ml),respectively.Additionally,the verification experiment revealed that the THA was(0.069 0±0.002 4)℃,similar to the experiment value,which indicated that the model was reliable.The AFP separated and purified by column chromatography was electrophoresis level,the molecular weight was 6 400 u,and the THA was about(0.050 2±0.002 2)℃.

Esox luciusskin tissue;antifreeze protein;isolation;purification

Q51

A

0254-5071（2015）04-0072-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.016

2015-01-23

國(guó)家自然科學(xué)基金（31260366）；石河子大學(xué)青年骨干教師培訓(xùn)（3152SPXY01027）

田童童（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。

*通訊作者：張建（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)研究工作。