熒光定量PCR技術(shù)在臨床微生物檢測中的應(yīng)用

王 宇 靳偉東 蘭 凱 劉天堯

熒光定量PCR技術(shù)在臨床微生物檢測中的應(yīng)用

王 宇 靳偉東 蘭 凱 劉天堯

目的探討熒光定量PCR技術(shù)在臨床微生物檢測中的應(yīng)用。方法選取醫(yī)院收治的門診及住院102例患者的臨床標(biāo)本，利用熒光定量PCR技術(shù)對微生物進(jìn)行檢測，觀察微生物檢測結(jié)果。結(jié)果膿液標(biāo)本中，檢出金黃色葡萄球菌4株；在大便標(biāo)本中，檢出沙門氏菌21株、腸出血性大腸桿菌O157：H7 2株、副溶血性弧菌12株；熒光定量PCR技術(shù)檢測臨床微生物特異性和靈敏度良好，精確定量。結(jié)論熒光定量PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度好、精確定量的優(yōu)點，檢測結(jié)果良好。

熒光定量PCR技術(shù)；臨床微生物檢測；特異度；靈敏度

熒光定量PCR技術(shù)是指將熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系中，通過熒光信號累積，對整個PCR過程進(jìn)行實時監(jiān)測，最終，利用定量分析法，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上分析未知模板［1］。熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏、快速、精確定量的優(yōu)點，廣泛的應(yīng)用在臨床微生物檢測方面。本院以收治的102例患者為研究對象，采用熒光定量PCR技術(shù)對其標(biāo)本進(jìn)行微生物檢測，取得良好效果，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以醫(yī)院2013年7月～2014年7月收治的門診和住院患者102例為研究對象，男65例，女37例；年齡18～83歲，平均（42.8±5.7）歲；泌尿系感染13例，細(xì)菌性食物中毒8例，上呼吸道感染34例，流行性感冒32例，腎盂腎炎9例，慢性阻塞性肺病6例。102份標(biāo)本中，糞便63份，膿液39份。

1.2 方法

所有患者獲取的標(biāo)本均采用熒光定量PCR技術(shù)檢測，在1.5 ml的滅菌Epp管中，滴入1.5 ml樣本增菌液，振蕩混勻，高速離心機(jī)離心2 min。將上清清除干凈，剩余沉淀中直接加入100 μl DNA提取液，充分的混合均勻后，沸水?。?0±1）min，高速離心機(jī)離心5 min，將上清取出4 μl，進(jìn)行PCR反應(yīng)；利用PCR檢測儀，給予擴(kuò)增檢測；依據(jù)試劑盒說明書，配制反應(yīng)混合液，同時，設(shè)置循環(huán)參數(shù)、陽性梯度模板、陰性對照，判定結(jié)果時，嚴(yán)格按照檢測儀和試劑盒說明書來進(jìn)行。微生物菌分離完成后，各取5株進(jìn)行試劑盒特異性檢測。菌株檢測陽性后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，在試劑盒說明書的指導(dǎo)下，擴(kuò)增PCR，分析試劑盒的靈敏度。泛，可準(zhǔn)確的檢測出多種病毒。在B型肝炎病毒檢測中，以多份不同基本型混合的樣本為檢測對象，對其中混合的基因型進(jìn)行檢測，經(jīng)檢測結(jié)果可知，所有混合的基因型均可被檢測出來，由此說明，熒光定量PCR技術(shù)具有比較高的精確度［2］。在對手足口病患者進(jìn)行臨床診斷時，利用傳統(tǒng)ELISA法和熒光定量PCR技術(shù)對患者標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，熒光定量PCR技術(shù)的檢測速度快，能夠準(zhǔn)確的檢測出手足口病［3］。

3.2 細(xì)菌檢測中的應(yīng)用

近年來，熒光定量PCR技術(shù)在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用越來越廣泛，在TaqMan熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，形成了檢測結(jié)合分枝桿菌的方法，此種方法的靈敏度達(dá)到90%以上，特異性100%，高于傳統(tǒng)的圖片染色法和培養(yǎng)法［4］。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測沙門氏菌的ompF基因，其所包含的所有種型均可以被檢測出來，具有非常高的靈敏度和特異性，且檢測時間比較短，能夠快速的形成檢測結(jié)果，提升了檢測效率［5］。

3.3 在真菌檢測中的應(yīng)用

在真菌的檢測和鑒定中，熒光定量PCR技術(shù)也具有比較多的應(yīng)用。針對曲霉菌的18SRNA序列設(shè)計引物和探針對疑似臨床樣本進(jìn)行檢測，并進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果顯示，特異度為100%，能夠?qū)崿F(xiàn)精確檢測［6］。

3.4 小結(jié)

當(dāng)前，在部分微生物檢測中，F(xiàn)DA和CFDA已經(jīng)認(rèn)可熒光定量PCR檢測技術(shù)。隨著熒光定量PCR技術(shù)的不斷完善，臨床微生物檢測中越來越多的應(yīng)用此種檢測方法，可準(zhǔn)確的檢測出各種微生物，為臨床有效治療提供良好的依據(jù)，提升臨床治療效果。

2 結(jié)果

在63份糞便標(biāo)本中，檢出沙門氏菌21株，陽性率為33.3%，腸出血性大腸桿菌O157：H7 2株，陽性率為3.2%，副溶血性弧菌12株，陽性率為19.0%。在39份膿液標(biāo)本中，檢出金黃色葡萄球菌4株，陽性率為10.3%。

選取沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157：H7、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌陽性菌株各5株，利用試劑盒檢測特異性，結(jié)果顯示：特異性100%，無假陽性或假陰性檢出。

對沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157：H7、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌菌株進(jìn)行10倍系列系數(shù)檢測PCR技術(shù)靈敏度，結(jié)果顯示：102拷貝/ml核酸樣本為可進(jìn)行的最低核酸檢測限度。

3 討論

3.1 在病毒檢測中的應(yīng)用

在當(dāng)前的病毒檢測中，熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用的比較廣

［1］ 李海紅，侯錫苗. 實時熒光定量PCR技術(shù)及其在幾類病原體檢測中的應(yīng)用［J］. 職業(yè)與健康，2015，31（18）：2586-2589.

［2］ 楊洪毅，石潔，劉國棟，等. 熒光定量PCR技術(shù)在痰結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（8）：1483-1484.

［3］ 郭丹桂，許少洪. 實時熒光定量PCR技術(shù)在疫情和食物中毒檢測中的應(yīng)用［J］. 職業(yè)與健康，2013，29（21）：2857-2858.

［4］ 周曉紅，徐佩華，孫明華，等. 實時熒光定量PCR技術(shù)在食源性致病菌快速檢測中的應(yīng)用［J］. 上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，26（6）：313-317.

［5］ 鄭志芬，戴榮繼. 實時熒光定量PCR技術(shù)在臨床腫瘤檢測中的應(yīng)用［J］. 生命科學(xué)儀器，2014，12（3）：20-23.

［6］ 劉小榮，張笠，王勇平. 實時熒光定量PCR技術(shù)的理論研究及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（2）：329-332.

Fluorescence Quantitative PCR Technology in Clinical Application of Microbiological Detection

WANG Yu JIN Weidong LAN Kai LIU Tianyao The Prison Administration Center Hospital of Heilongjiang Province，Harbin 150080，China

Objective To study the fluorescence quantitative PCR technology in clinical application of microbiological detection.MethodsTo select 102 clinical specimens from outpatients and inpatients in our hospital，using the fluorescent quantitative PCR technology for microbial testing，observation of microbial test results.ResultsThe pus，check out the 4 aureus strains. In the fecal specimen，21 strains of salmonella， 2 strains of e.coli O157：H7，12 strains of deputy hemolytic vibrio. Fluorescence quantitative PCR technique to detect the clinical microbiology had specificity and sensitivity，and had good precision quantitative.ConclusionThe fluorescence quantitative PCR technique with high specificity，sensitivity，the advantages of accurate quantitative widely applied in clinical microbiology tests.

Fluorescence quantitative PCR technique，Clinical microbiological detection，Specific degrees，Sensitivity

中圖分類號】R459.7

A

1674-9316（2015）30-0151-02

10.3969/j.issn.1674-9316.2015.30.113

150080哈爾濱，黑龍江省監(jiān)獄管理局中心醫(yī)院