黃曲霉毒素的提取、檢測(cè)及防治方法研究進(jìn)展

李從虎，劉毅然，李肖純，邢朝鳳，王志勇，黃曉平，2

（1.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶246011；2.泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建泉州362000）

黃曲霉毒素的提取、檢測(cè)及防治方法研究進(jìn)展

李從虎1，劉毅然1，李肖純1，邢朝鳳1，王志勇1，黃曉平1，2

（1.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶246011；2.泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建泉州362000）

黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有致癌、致畸和致突變的作用，主要損害機(jī)體的肝臟和腎臟等組織，對(duì)人類危害極大。該文介紹了黃曲霉毒素的危害、提取和檢測(cè)方法，并綜述了黃曲霉毒素的防治方法，為進(jìn)一步加強(qiáng)黃曲霉毒素的控制提供參考。

黃曲霉毒素；檢測(cè)；防治

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一類具有高度氧化雜環(huán)的真菌毒素，主要是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）在霉變的食物（如堅(jiān)果、花生、醬類等）中分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］。這類真菌毒素自20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已被確認(rèn)為具有致癌、致畸和致突變作用的化合物，主要損害機(jī)體的肝臟、腎臟等其他多種組織［2-4］。為保證食品安全和促進(jìn)人類健康，世界各國(guó)和地區(qū)對(duì)黃曲霉毒素均制定了嚴(yán)格的限量和進(jìn)出口標(biāo)準(zhǔn)。歐盟規(guī)定在花生、干果等原料中黃曲霉毒素B1含量≤2 ng/g，而黃曲霉毒素總量≤4 ng/g［5］；我國(guó)規(guī)定黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)為5～20 ng/g［6］。

在我國(guó)，由于某些企業(yè)生產(chǎn)過程開放、原料多樣且管理不善等，使得黃曲霉毒素污染仍難以完全杜絕。為降低黃曲霉毒素的污染，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了科學(xué)的研究。黃曲霉毒素的分析通常包括3個(gè)主要步驟［7-9］：（1）提取，充分提取樣品中黃曲霉毒素為后續(xù)的檢測(cè)和防治提供有力保障；（2）檢測(cè)，快速靈敏的檢測(cè)提供了精確的數(shù)據(jù)來(lái)源；（3）防治，有效防治黃曲霉毒素污染，是保證食品安全和人類健康的根本。

本文綜合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，綜述了食品中黃曲霉毒素的提取、檢測(cè)和防治方法，為進(jìn)一步加強(qiáng)食品中黃曲霉毒素的控制提供參考。

1　黃曲霉毒素的提取

現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18979—2003《食品中黃曲霉毒素的測(cè)定—免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》介紹了大米、花生、植物油脂、醬油和食醋等食品中黃曲霉毒素的提取方法。其提取過程（以花生制品為例）：精確稱取研磨（粒度＜2 mm）樣品25.0 g置于250 mL具塞錐形瓶中，加入NaCl（5.0 g）和甲醇水混合溶液（甲醇∶水=7∶3）至125 mL，用勻質(zhì)器高速攪拌2 min，隨后用定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取15 mL濾液并加入30 mL水稀釋，最后用玻璃纖維濾紙過濾1～2次，至濾液澄清，備用［10］。COLE R J等［11］利用不同溶劑和不同溶劑/樣品比例提取花生中的黃曲霉毒素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液和體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈水溶液分別在樣本率為3∶1和2∶1時(shí)，黃曲霉毒素的提取效果最好；而體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈水溶液在樣本率4∶1時(shí)提取效果最差。

此外，STARR J M等［7］采用超臨界流體萃取技術(shù)（supercritical fluid extraction，SFE）在17.2 MPa和70℃等優(yōu)化條件下得到土壤中黃曲霉毒素的回收率為72%。隨后，SHEIBANI A等［12］將SFE技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，采用增壓流體萃取技術(shù)（pressurized fluid extraction，PFE）提取開心果中的黃曲霉毒素，該法具有高回收率、低量和需要萃取溶劑較少的優(yōu)點(diǎn)；研究結(jié)果表明，壓力越高，回收率越高，在80℃和萃取溶劑流量為0.5 mL/min時(shí)，黃曲霉毒素回收率比AOAC法提取黃曲霉毒素高20%左右。

2　黃曲霉毒素檢測(cè)方法

黃曲霉毒素的檢測(cè)方法最初以薄層層析法為主，后發(fā)展到高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法和微柱篩選法等多種方法普遍應(yīng)用。這類新方法和新手段為黃曲霉毒素的檢測(cè)提供了廣泛的選擇余地，適應(yīng)了不同的檢測(cè)目的和要求。

2.1薄層層析法

薄層層析法（thin-layer chromatography，TLC）是最早被用來(lái)檢測(cè)黃曲霉毒素的方法之一，其原理是利用黃曲霉毒素的熒光特性，根據(jù)熒光斑點(diǎn)的強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較而確定黃曲霉毒素的含量［13］。TLC法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但具有對(duì)人和環(huán)境污染系數(shù)較大，且操作過程繁冗，靈敏度較低，處理多樣品時(shí)工作量大等缺點(diǎn)。為了提高TLC法的精度，可將TLC法儀器化，通過薄層掃描法來(lái)測(cè)定黃曲霉毒素。BRADBURN N等［14］開發(fā)了雙向高效薄層層析法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定黃曲霉毒素，該法將樣品通過點(diǎn)板，氯仿-二甲苯-丙酮（6∶3∶1）混合溶液展開后，通過熒光光密度法在波長(zhǎng)366 nm處檢測(cè)黃曲霉毒素含量，以樣品斑點(diǎn)面積積分值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，得到黃曲霉毒素含量。

2.2高效液相色譜法

高效液相色譜法定量測(cè)定黃曲霉毒素的工作原理是將樣品中的黃曲霉毒素經(jīng)柱層析分離后，通過測(cè)定色譜峰的面積實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。該法具有分析定量精準(zhǔn)、穩(wěn)定和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于檢測(cè)各種食品和糧食中的黃曲霉毒素［15］。GIRAY B等［16］利用安捷倫1100高效液相色譜儀、熒光檢測(cè)器（激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm）和Spherisob S5ODS2柱分析了土耳其小麥樣品中的黃曲霉毒素含量，其流動(dòng)相為水∶乙腈∶甲醇（62∶16∶22，V/V），流動(dòng)速率1 mL/min，進(jìn)樣量100 μL。結(jié)果顯示，在41種小麥樣品中的黃曲霉毒素的含量為10.4～643.5 ng/g。

目前，HPLC法已發(fā)展為多種方法相結(jié)合檢測(cè)黃曲霉毒素含量。FU Z等［17］采用超高壓液相色譜配紫外檢測(cè)器法（ultra performance liquid chromatography-ultraviolet，UPLCUV）快速檢測(cè)了玉米和花生中黃曲霉毒素的含量，該法將黃曲霉毒素經(jīng)MycoSep#226 AflaZon+柱純化，流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶水（17.5∶17.5∶65），流速0.25 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，結(jié)果表明，該法對(duì)黃曲霉毒素B1、B2的檢測(cè)限分別為0.32 ng/g和0.19 ng/g，定量限分別為1.07 ng/g和0.63 ng/g，回收率達(dá)到83.4%～94.7%。此外，免疫親和柱高效液相色譜法（immunoaffinity column-high performance liquid chromatography，IAC-HPLC）具有快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確、安全等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于黃曲霉毒素的定量檢測(cè)。該法的工作原理：利用抗原與抗體的特異吸附特性，免疫親和柱只能特異性、選擇性地吸附黃曲霉毒素，利用洗脫液將黃曲霉毒素洗脫下來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。姜兆興等［18］利用免疫親和柱-高效液相色譜法配熒光檢測(cè)器法測(cè)定飼料中黃曲霉毒素，其色譜條件為色譜柱為MYCOTOXTM黃曲霉毒素分析柱，柱溫42℃，流動(dòng)相甲醇∶乙腈∶水=22∶22∶56，流速1.0 mL/min，激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm，進(jìn)樣量10 μL，衍生液為0.05%碘液，衍生流速0.3 mL/min，反應(yīng)管溫度90℃；結(jié)果表明，該法對(duì)黃曲霉毒素的回收率高達(dá)84%以上，檢測(cè)限達(dá)到0.5 ng/g。考慮到通過強(qiáng)氧化劑（三氟乙酸等）或鹵族元素及其衍生物（碘、溴等）對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行衍生時(shí)，由于這些試劑具有腐蝕性、揮發(fā)性，使得定量穩(wěn)定性較差。馬良等［19］將過渡金屬離子（氯化汞）作為衍生劑與免疫親和柱高效液相色譜相結(jié)合，用于黃曲霉毒素的熒光分析，結(jié)果表明，回收率為83%～100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.51%～4.98%，黃曲霉毒素B1的檢出限和定量下限分別達(dá)到0.05 ng/g和0.17 ng/g。

2.3酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorband assay，ELISA）是20世紀(jì)70年代初期出現(xiàn)的一種抗原與抗體的特異性結(jié)合而成的免疫分析新技術(shù)。該技術(shù)首先是抗原（抗體）結(jié)合到固相載體表面并仍具有免疫活性；其次抗體（抗原）與酶結(jié)合后仍保持免疫活性和酶活性；最后結(jié)合物與相應(yīng)的抗原（抗體）反應(yīng)后，結(jié)合的酶仍能催化底物，生成有色物質(zhì)，而顏色深淺可定量抗體（抗原）的含量。應(yīng)用于黃曲霉毒素檢測(cè)時(shí)，黃曲霉毒素與定量特異性抗體反應(yīng)，而游離抗體與固相包被抗原結(jié)合，同時(shí)加入酶標(biāo)物和底物后顯色并終止反應(yīng)，與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較并由此定量計(jì)算出黃曲霉毒素的含量。ELISA法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性較強(qiáng)和對(duì)環(huán)境污染較小等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于食品、飼料和肉類等行業(yè)中黃曲霉毒素的檢測(cè)［20］。

AYCICEK H等［8］利用ELISA法檢測(cè)了土耳其2002年9月至2003年9月223種乳制品中黃曲霉毒素M1的含量，其中8.52%的樣品中黃曲霉毒素M1含量超過土耳其食品委員會(huì)的限量標(biāo)準(zhǔn)。NURYONO N等［21］采用ELISA法檢測(cè)了2006年印尼5個(gè)不同區(qū)域的113種新鮮乳制品中黃曲霉毒素M1含量，結(jié)果表明48種乳制品中黃曲霉毒素M1含量低于5 ng/L，31種樣品中黃曲霉毒素M1含量為5～10 ng/L，34種樣品黃曲霉毒素含量高于10 ng/L。PEI S C等［22］利用分離的單克隆抗體結(jié)合ELISA法分析了中國(guó)乳制品中黃曲霉毒素M1的含量，其回收率達(dá)到98%，檢測(cè)限0.04 ng/mL。

2.4其他檢測(cè)法

AMMIDA N H等［23］利用一種電化學(xué)免疫傳感器，使用微分脈沖伏安法檢測(cè)大麥中的黃曲霉毒素B1，檢測(cè)限達(dá)到30 pg/mL。

VELKY J T等［24］設(shè)計(jì)了一種輕便、微型的免疫親和熒光生物傳感器，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)、高靈敏度和快速定量檢測(cè)黃曲霉毒素，其檢測(cè)范圍可達(dá)0.1～500 ng/g。

3　黃曲霉毒素防治方法

黃曲霉毒素具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，巴氏消毒不能解除黃曲霉毒素的污染。因此，自1960年黃曲霉毒素被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者研究了黃曲霉毒素的防治措施。迄今的研究成果可分為物理化學(xué)法和生物法兩大類。

3.1物理化學(xué)法

物理化學(xué)方法主要是通過一些物理方法和化學(xué)試劑達(dá)到黃曲霉毒素的去毒目的，主要包括：吸附、熱處理［25］、輻射、堿處理和氧化處理等方法。DESHENG Q等［26］用蒙脫石吸附黃曲霉毒素B1，發(fā)現(xiàn)在pH 2.0和8.0時(shí)，黃曲霉毒素B1的吸附率分別達(dá)到613.5 μg/g和628.9 μg/g，并證明其吸附機(jī)理是黃曲霉毒素B1吸附于蒙脫土的雙氫鍵，但其分子并未滲透到蒙脫土的夾層區(qū)域中。INAN F等［27］采用臭氧質(zhì)量濃度分別為33 mg/L和66 mg/L處理紅辣椒60 min，可使紅辣椒的黃曲霉毒素的去除率分別達(dá)到80%和93%。

3.2生物防治法

生物防治主要利用微生物或其代謝產(chǎn)物去除黃曲霉毒素，由于該法具有對(duì)處理對(duì)象無(wú)污染、高度專業(yè)，不影響處理對(duì)象的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且能夠避免其他毒素的產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)，因此成為黃曲霉毒素去毒研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。

利用微生物之間競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，篩選出對(duì)產(chǎn)黃曲霉毒素生長(zhǎng)有抑制作用的微生物作為拮抗菌，通過優(yōu)化培養(yǎng)使其能夠達(dá)到最佳抑制效果，是預(yù)防黃曲霉毒素污染的第一類重要方法。DORNER J W等［28-29］發(fā)現(xiàn)將不產(chǎn)毒的寄生曲霉菌株播撒在花生生長(zhǎng)的土壤中可以使食用花生中黃曲霉毒素含量降低83%～98%；接種量越高，其對(duì)土壤中黃曲霉毒素的抑制越明顯，且在接種2年后仍具有抑制作用。

通過微生物，如細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌菌絲體的吸附作用，是黃曲霉毒素去毒的第二類重要方法。這類微生物能夠與黃曲霉毒素形成復(fù)合體，當(dāng)形成復(fù)合體后，其對(duì)機(jī)體的吸附能力減弱，因而易與黃曲霉毒素一起排出體外，降低黃曲霉毒素的污染風(fēng)險(xiǎn)。NAGENDRA S等［30］發(fā)現(xiàn)2株乳桿菌和4株雙歧桿菌對(duì)黃曲霉毒素B1的吸附能力達(dá)到20%～50%，用蒸餾水洗滌吸附黃曲霉毒素B1的菌體后，仍有10%～40%的黃曲霉毒素B1吸附在乳酸菌上，表明乳酸菌對(duì)黃曲霉毒素有較強(qiáng)的吸附作用，其吸附機(jī)理是黃曲霉毒素B1通過非共價(jià)方式與乳酸菌細(xì)胞壁的多聚糖組分結(jié)合形成復(fù)合物。也有研究報(bào)道稱無(wú)論是活菌，還是經(jīng)滅活的乳酸菌，對(duì)黃曲霉毒素B1均具有良好的吸附作用［31］。

基于微生物及其代謝產(chǎn)物降解黃曲霉毒素的目的是將黃曲霉毒素降解成無(wú)毒或低毒的物質(zhì)。GUAN S等［32］利用嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在37℃時(shí)培養(yǎng)72 h可去除82.5%的黃曲霉毒素B1，并探究了降解的影響因素，結(jié)果表明37℃和pH 8.0時(shí)，其降解效率較高，Mg2+和Cu2+可激活其降解效率，但Zn2+是強(qiáng)抑制劑，同時(shí)蛋白酶K、蛋白酶K加上SDS以及高溫均可降低其降解效率。LIANG Z等［33］利用香豆素為碳源篩選出一株假單胞菌屬，其對(duì)黃曲霉毒素B1的降解率達(dá)到85.7%，經(jīng)硫酸銨提取的粗酶液對(duì)黃曲霉毒素也具有良好的降解效果。MOTOMURA M等［34］從糙皮側(cè)耳中分離純化一種酶，該酶分子質(zhì)量約為90 ku，經(jīng)薄層層析分析，該酶在pH 4.0～5.0和溫度25℃時(shí)可有效降解黃曲霉毒素。此外，從真菌中分離的蟲漆酶也可有效的去除黃曲霉毒素的毒性［35］。

4　黃曲霉毒素防治的發(fā)展趨勢(shì)

黃曲霉毒素的研究目是對(duì)其進(jìn)行有效防治，降低污染風(fēng)險(xiǎn)，保證人類健康。近些年，人們通過不斷地研究和探索，已從各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域獲得黃曲霉毒素的相關(guān)信息。利用物理化學(xué)法去除黃曲霉毒素雖具有一定的效果，但可能會(huì)影響產(chǎn)品品質(zhì)并帶來(lái)其他副產(chǎn)物甚至毒性副產(chǎn)物產(chǎn)生，因此，未來(lái)關(guān)于黃曲霉毒素的防治主要集中在生物防治領(lǐng)域。首先，可利用基因工程技術(shù)將產(chǎn)毒相關(guān)基因敲除，使其喪失產(chǎn)毒能力并轉(zhuǎn)化為不產(chǎn)毒菌株。其次，篩選出可抑制產(chǎn)毒菌株生長(zhǎng)繁殖的微生物，使其與產(chǎn)毒菌株發(fā)生拮抗作用，降低黃曲霉毒素的污染。再次，篩選出優(yōu)勢(shì)菌株，具有明顯降解黃曲霉毒素的能力，該菌株應(yīng)具備：（1）毒素被破壞或者被轉(zhuǎn)化成無(wú)毒化合物；（2）真菌孢子和菌絲體應(yīng)被破壞，以避免有新的毒素產(chǎn)生；（3）處理對(duì)象應(yīng)該保持它原有的營(yíng)養(yǎng)水平和風(fēng)味；（4）不明顯改變?cè)系奈锢硇誀睿医?jīng)濟(jì)可行。

利用生物防治方法降低黃曲霉毒素污染雖然還有很長(zhǎng)的路要走，但它為真菌毒素類的污染防治提供了一種具有前景的生物學(xué)策略，其關(guān)鍵是尋找高效、廉價(jià)的微生物及其制劑。

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Research advances of extraction，detection and prevention for aflatoxins

LI Conghu1，LIU Yiran1，LI Xiaochun1，XING Chaofeng1，WANG Zhiyong1，HUANG Xiaoping1，2
（1.College of Life Sciences，Anqing Normal University，Anqing 246011，China；2.College of Chemistry and Life Sciences，Quanzhou Normal University，Quanzhou 362000，China）

Aflatoxins are secondary metabolites mainly secreted byAspergillus flavusandAspergillus parasiticus，which are caicinogenic，teratogenic and mutagenic.They mainly harm liver，kidney and other organisms.Therefore，aflatoxins are very harmful to human.In this paper，the hazard，extraction and the detection of aflatoxins were discussed.Furthermore，the prevention method of aflatoxins was suggested to provide a reference for further strengthening aflatoxin control.

aflatoxins；detection；prevention

Q815

A

0254-5071（2015）10-0005-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.002

2015-09-13

國(guó)家青年自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81502687）

李從虎（1987-），講師，博士，研究方向?yàn)槲⑸锛吧镔|(zhì)資源化利用。