大型真菌原生質(zhì)體的制備與再生研究

李晶瑩，孫婷婷，張國權(quán)，鄒莉

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱150040)

大型真菌原生質(zhì)體的制備與再生研究

李晶瑩，孫婷婷，張國權(quán)，鄒莉*

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱150040)

綜述了多種大型真菌原生質(zhì)體分離和再生技術(shù)，并分析了各因素對原生質(zhì)體分離和再生的影響，為今后大型真菌的菌種選育和轉(zhuǎn)基因研究提供理論基礎(chǔ)。

大型真菌；原生質(zhì)體；分離；再生

大型真菌營養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值突出，自古以來深受人們喜愛，其主要包括食用菌和藥用菌兩部分。食用菌含有豐富的糖類、多種蛋白質(zhì)、維生素和不飽和脂肪酸，味道鮮美，保健功能強(qiáng)。如木耳清爽可口，是“素中之葷”；香菇味道獨(dú)特，是“菇中之王”；金針菇口感清脆，小孩常食，能增強(qiáng)智力；猴頭菇不僅味道鮮美，更能養(yǎng)胃；雙孢蘑菇色質(zhì)白嫩，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是人們喜愛的菌類之一。藥用菌具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、保肝解毒、降血脂、抗血栓、抗輻射、抗菌、抗病毒、抗衰老等作用，對癌癥、腫瘤、肝臟疾病、心血管疾病等多種常見疾病均有治療保健作用，還能延緩衰老、美容養(yǎng)顏，提高人體免疫力[1]。如桑黃具有抗發(fā)炎、抑制腫瘤生成、抗氧化、增強(qiáng)免疫力，保護(hù)肝臟等作用；茯苓具有健脾和胃、寧心安神等功能，是中藥“八珍”之一，茯苓多糖對多種癌癥和腫瘤具有不同程度的抑制作用；冬蟲夏草可保肺腎、補(bǔ)精髓、化痰止勞咳；靈芝的提取物對高血壓、血管硬化、腦血栓、氣管炎及癌癥均有療效；樺褐孔菌精粉對糖尿病有特殊的療效；樟芝具有抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、保護(hù)肝臟等作用，可促進(jìn)肝細(xì)胞再生[2-3]。除此之外，裂褶菌、灰樹花、槐耳、層臥孔菌等對多種疾病都有特殊療效[4]。

然而大型真菌的產(chǎn)量不高，尤其是稀有食用菌和珍貴藥用菌，其有效成分的提取量更少，為此人們愈來愈多地使用原生質(zhì)體技術(shù)如原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體誘變、原生質(zhì)體再生育種、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化來獲得優(yōu)良菌株，而原生質(zhì)體制備和再生是原生質(zhì)體技術(shù)的前提和基礎(chǔ)。本文通過總結(jié)了多種大型真菌原生質(zhì)體分離和再生條件，并分析了各因素對原生質(zhì)體分離和再生的影響，為今后大型真菌的菌種選育和轉(zhuǎn)基因研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 原生質(zhì)體制備

早期人們曾探索使用研磨等機(jī)械方法和超聲波等物理方法來制備原生質(zhì)體，制備效果都不理想，目前人們主要采用酶法來制備原生質(zhì)體[5]。常用的酶有溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶和崩潰酶等。

1.1 菌齡對原生質(zhì)體制備的影響

菌齡不同，菌絲體的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同，代謝也不同。菌齡短的菌體細(xì)胞壁成分相對簡單，且較??；隨著菌齡增大，則相反，其次生代謝物增多，酶解壁難度增加。菌齡過短，菌絲量不足，也影響原生質(zhì)體得率[6]。因此，選擇在適宜的時(shí)期對菌絲進(jìn)行酶解反應(yīng)是十分必要的。梁清樂，郭成金等[7-8]認(rèn)為菌絲對數(shù)生長期是原生質(zhì)體釋放最適合的菌齡。

1.2 不同酶對原生質(zhì)體制備的影響

真菌的細(xì)胞壁成分主要由幾丁質(zhì)、甘露聚糖、葡聚糖等組成，其成分復(fù)雜。通常使用微生物產(chǎn)生的酶復(fù)合物或商品酶的混合液比單獨(dú)使用一種酶的效果好[9]。姜波[10]通過對蟲草菌原生質(zhì)體的制備及誘變研究，發(fā)現(xiàn)溶菌酶與纖維素混合酶處理菌絲體時(shí)形成的原生質(zhì)體質(zhì)量最好，達(dá)到1.145×107個/mL。張卉等[11]通過對姬松茸原生質(zhì)體形成和再生研究，發(fā)現(xiàn)溶壁酶+蝸牛酶+纖維素酶組成的酶系統(tǒng)效果最好。祝子坪等[12]通過對桑黃原生質(zhì)體的分離與再生研究，發(fā)現(xiàn)溶壁酶+崩潰酶的組合酶系的酶解效果最好。

1.3 不同酶液濃度對原生質(zhì)體制備的影響

制備原生質(zhì)體所使用的酶液并不完全純化，其含有雜質(zhì)酶，如溶壁酶(廣東微生物研究所)就含有核糖核酸酶和蛋白酶，這些酶對原生質(zhì)膜有損害作用[13]。一定范圍內(nèi)，酶濃度越高，原生質(zhì)體的產(chǎn)量也越大，當(dāng)酶的濃度超過一定值后，原生質(zhì)體的質(zhì)量開始下降，甚至急劇下降，這就是雜酶所造成的。并且，酶濃度過大，原生質(zhì)體脫壁太徹底，再生也會受到嚴(yán)重影響[5]。呂龍等[14]通過正交設(shè)計(jì)法探討茯苓原生質(zhì)體的最佳制備條件發(fā)現(xiàn)，酶解1 h茯苓原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高；2 h茯苓原生質(zhì)體的數(shù)量迅速下降；之后茯苓原生質(zhì)體的數(shù)量又逐漸增多，他分析可能是所用酶液濃度較高，菌絲體的菌齡較小，所以酶濃度和菌絲體的菌齡對原生質(zhì)體制備具有嚴(yán)重影響。此外，有研究表明高濃度的酶對原生質(zhì)體有一定的損傷[15-16]。

不同菌絲的細(xì)胞壁組成差異顯著，酶解所需的酶液濃度也隨之變化。王淑珍等[17]發(fā)現(xiàn)用2.5%溶壁酶+0.5%崩潰酶酶解松茸菌絲體得到原生質(zhì)體的效果較好；曹文芩等[18]等發(fā)現(xiàn)使用3%的溶壁酶和蝸牛酶的混合液酶解靈芝菌絲獲得原生質(zhì)體的效果最好；張麗霞等[19]發(fā)現(xiàn)使用2%溶壁酶酶解豬苓菌絲得到原生質(zhì)體的效果較好。

1.4 不同滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體制備的影響

常用的滲透壓穩(wěn)定劑主要是無機(jī)鹽、糖類或醇類，如氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，硫酸鎂，蔗糖，葡萄糖，甘露醇等。滲透壓穩(wěn)定劑常用濃度為0.5～0.6mol/L[17]。滲透壓穩(wěn)定劑能夠維持原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓平衡，對原生質(zhì)體形態(tài)和活性有著重要作用，然而不同原生質(zhì)體最適的滲透壓穩(wěn)定劑也不同。郭成金等[8]通過利用正交試驗(yàn)對冬蟲夏草原生質(zhì)體的制備與再生的研究，發(fā)現(xiàn)糖醇類物質(zhì)黏度過高，大大降低或抑制了酶的反應(yīng)活性，而以0.6mol/L的KCl作滲穩(wěn)劑，則有助于酶與底物的結(jié)合，對酶解反應(yīng)起促進(jìn)作用。李剛等[20]發(fā)現(xiàn)硫酸鎂很易和瓊脂反應(yīng)產(chǎn)生大量沉淀，從而難以凝固或凝固后仍有較高的流動性，妨礙再生實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

1.5 不同酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響

酶促反應(yīng)深受溫度的控制，在不同溫度下，酶活性不同，酶解效果也不同。低溫會降低酶促反應(yīng)速率，而高溫可能會降低酶活性和損傷已游離的原生質(zhì)體[19]。溶壁酶的最適酶解溫度為25～35℃，而每克菌絲細(xì)胞經(jīng)30～40mg蝸牛酶在37℃下保溫1h即可溶解細(xì)胞壁，破壁率達(dá)90%以上。不同菌類、不同的酶，其最適酶解溫度不同[6]。鄒莉等[21]發(fā)現(xiàn)在32℃條件下用溶壁酶酶解，亞側(cè)耳原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高。勾麗莉等[22]發(fā)現(xiàn)在34℃條件下，用1.5%溶壁酶+0.5%蝸牛酶酶解，血紅鉚釘菇原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高。王謙等[23]發(fā)現(xiàn)在25℃，1%蝸牛酶+1%纖維素酶條件下酶解，玉蕈原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，高于或低于25℃，原生質(zhì)體產(chǎn)量都會降低。另外，原生質(zhì)體活力最高時(shí)的溫度并非產(chǎn)量最高時(shí)的溫度[24]。

1.6 不同酶解時(shí)間對原生質(zhì)體制備的影響

一般地，隨著時(shí)間的延長，有越來越多的菌絲被酶解，釋放出球狀的原生質(zhì)體，但當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，抗逆能力差的原生質(zhì)體長時(shí)間暴露在酶液中，一些雜酶不斷破壞原生質(zhì)體膜，使得原生質(zhì)體破碎，原生質(zhì)體數(shù)量下降，活性也受到影響[25]。因此，確定好酶解時(shí)間是至關(guān)重要的。不同菌絲的細(xì)胞壁構(gòu)成和厚薄不同，使用的酶不同，所需要的酶解時(shí)間也不同。王昱等[26]發(fā)現(xiàn)酶解2.5h時(shí)靈芝原生質(zhì)體的數(shù)量最多。許謙[27]發(fā)現(xiàn)酶解3h時(shí)桑黃原生質(zhì)體的數(shù)量最多。

1.7 不同pH對原生質(zhì)體制備的影響

pH是影響酶活的重要因素，在不同的pH下，酶的活性大大不同。陳敏等[28]發(fā)現(xiàn)用溶壁酶酶解杏鮑菇菌絲，在酶液的pH 為4.5～5時(shí)效果最好。張李陽[29]發(fā)現(xiàn)溶壁酶酶液的pH為5.5時(shí)，靈芝原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，但在pH 5.0～6.5范圍內(nèi)，再生率的變化不甚明顯，建議采用緩沖液配制酶液。

1.8 不同預(yù)處理方式對原生質(zhì)體制備的影響

有研究表明酶解前對菌絲進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯不同。沙濤等利用2-硫基蘇糖醇(DDT)、硫代乙醇酸鈉和B-巰基乙醇等3種預(yù)處理液對松茸菌絲進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)2-硫基蘇糖醇(DDT)處理過的菌絲的原生質(zhì)體制備率明顯高于其它兩種預(yù)處理液處理過的菌絲以及未處理的菌絲[25]。

2 原生質(zhì)體再生

2.1 不同培養(yǎng)方式對原生質(zhì)體再生的影響

培養(yǎng)方式不同，原生質(zhì)體再生率不同。周禮紅等[30]通過對蛹蟲草原生質(zhì)體的制備與再生的研究，發(fā)現(xiàn)用雙層平板法培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生率高。李剛等[20]通過對靈芝原生質(zhì)體分離和再生的研究發(fā)現(xiàn)在雙層平板法中，上層瓊脂濃度越低，原生質(zhì)體再生率越高；當(dāng)上層瓊脂濃度為0.2%，原生質(zhì)體的再生效果最好(當(dāng)上層瓊脂濃度低于0.2%時(shí)，上層平板難以凝固，影響了再生菌落的計(jì)數(shù))。

2.2 不同再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生的影響

不同的菌種需要的養(yǎng)分不同，而不同的培養(yǎng)基所含有的養(yǎng)分也不同，所以選好再生培養(yǎng)基至關(guān)重要。周禮紅等[30]用含有0.6mol/L蔗糖的PDA、沙氏、Vogel’s培養(yǎng)基作再生培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)含有0.6mol/L蔗糖的PDA培養(yǎng)基的效果最好。祝子坪等[12]用含有0.6mol/L滲透壓穩(wěn)定劑的PDA再生培養(yǎng)基、PDA+桑枝再生培養(yǎng)基、麥芽糖酵母粉再生培養(yǎng)基、纖維二糖再生培養(yǎng)基培養(yǎng)桑黃原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)含有0.6mol/L滲透壓穩(wěn)定劑的PDA+桑枝再生培養(yǎng)基的效果最好。

2.3 不同滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體再生的影響

原生質(zhì)體分離和再生是兩個完全不同的過程，分離原生質(zhì)體是細(xì)胞壁的分解，而原生質(zhì)體再生是破碎的細(xì)胞壁的重新生成，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)，細(xì)胞正常分裂和生長的過程，而糖類和醇類作為再生培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定劑，既可以維持原生質(zhì)體的形態(tài)，又可以作為營養(yǎng)因子，提供其再生物質(zhì)的保證[8]。祝子坪，曹文芩等[12,18]發(fā)現(xiàn)甘露醇作為再生培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定劑再生率高；王昱, 周禮紅等[26,30]發(fā)現(xiàn)蔗糖作為再生培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)再生率高。祝子坪等[12]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以氯化鈣和硫酸鎂為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，培養(yǎng)基很難凝固，即使凝固后仍有較高的流動性，妨礙再生試驗(yàn)的進(jìn)行。

3 結(jié)語與展望

食用菌產(chǎn)業(yè)是一項(xiàng)集經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會效益于一體的短平快農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展項(xiàng)目，食用菌又是一類有機(jī)、營養(yǎng)、保健的綠色食品。發(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)符合人們消費(fèi)增長和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要，是農(nóng)民快速致富的有效途徑。如何獲得生長周期短、營養(yǎng)豐富、口感良好、抗病能力強(qiáng)的食用菌菌種是科研工作者一直努力的方向。

近年來，大型真菌藥劑的研制一直是新藥開發(fā)的重要領(lǐng)域。自1985年實(shí)施《藥品管理法》以來，經(jīng)部、省批準(zhǔn)的大型真菌單方或復(fù)方制劑有100多個品種，充分顯示出大型真菌制劑在醫(yī)藥方面的光明前景[31]。

原生質(zhì)體技術(shù)為上述問題的解決提供了研究思路。原生質(zhì)體的制備和再生是原生質(zhì)體技術(shù)的基礎(chǔ)和前提。在原生質(zhì)體制備和再生過程中可以引起菌種各種各樣的變化，如菌落形態(tài)、菌絲生長速度、營養(yǎng)缺陷型或抗藥性的回復(fù)突變、質(zhì)粒的消失以及產(chǎn)量、質(zhì)量等方面的變化。因此，原生質(zhì)體形成和再生技術(shù)也可以作為菌種改良的一種手段[32]。原生質(zhì)體融合和外緣DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體技術(shù)能夠有效克服遠(yuǎn)緣雜交的障礙，大大加快了育種進(jìn)程。逐步實(shí)現(xiàn)稀有大型真菌原生質(zhì)體的制備與再生，能夠更有效地保護(hù)、改良和利用野生種質(zhì)資源。

原生質(zhì)體制備和再生受多種條件影響，且不同菌種的制備和再生條件差異大，在原生質(zhì)體的制備和再生中應(yīng)綜合考慮各種因素，尋求最佳條件。

[1]林玉,金航,張金渝,等.中國藥用真菌概述[J].微生物學(xué)雜志,2007,27(2):57-61.

[2]劉春輝,陳體強(qiáng),林躍鑫,等.藥用真菌桑黃的研究進(jìn)展[J].菌物研究,2004, 2(2):53 -59.

[3]黃年來.中國最有開發(fā)前景的主要藥用真菌[J].食用菌,2005(1):3-4.

[4]章克昌.藥用真菌研究開發(fā)的現(xiàn)狀及其發(fā)展[J].食品與生物技術(shù),2002,21(1):100-103.

[5]孫劍秋,周東坡.微生物原生質(zhì)體技術(shù)[J].生物學(xué)通報(bào),2002,37(7):9-11.

[6]張志光. 真菌原生質(zhì)體技術(shù)[M]. 湖南: 湖南科學(xué)技術(shù)出版社, 2003:41-42; 44-46.

[7]梁清樂,王秋穎,曾念開,等.茯苓原生質(zhì)體制備與再生條件初探[J].中草藥, 2006(5) : 773-775.

[8]郭成金,趙潤.冬蟲夏草原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J].食品科學(xué), 2009(5): 166-170.

[9]Yali Cheng,Richard R.Belanger.Protoplast preparation andregeneration from spore of biocontrol fungus Pseudozyma flucculosa.FEMS Microbiology Letters,2000,190:287-291.

[10]姜波.蟲草菌原生質(zhì)體的制備及誘變[D].長春:吉林大學(xué),2004.

[11]張卉,劉長江.姬松茸原生質(zhì)體形成和再生的研究[J].微生物學(xué)雜志,2003,23(3):18-23.

[12]祝子坪,馬海樂.桑黃菌原生質(zhì)體的分離與再生研究[J].中國中藥雜志,2007,32(21):2232-2235.

[13]邱景蕓,廖漢泉,吳月嫦,等.一種溶高等擔(dān)子菌細(xì)胞壁酶的制備[J].遺傳,1982,4(4) :13- 14．

[14]呂龍,郭成金.正交設(shè)計(jì)法探討茯苓原生質(zhì)體的最佳制備條件[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,27(3):30-32.

[15]HonggSW. Formation and regeneration of protoplasts in Lentinus edodes[J].Mushroom Newsletter for the Tropics, 1988, 5 (4): 1-3.

[16]Cheng YL, Richard R, Belanger. Protoplast preparation and regeneration from spores of the biocontrol fungus Pseudozyma focculosa [J].FEMS Microbiology Letters, 2000, (190): 287-291.

[17]王淑珍,高雁,范俊,等.松茸原生質(zhì)體制備與再生的研究[J].食用菌,2002(3):6 -8.

[18]曹文芩,郭順星,徐錦堂,等.靈芝原生質(zhì)體制備、再生及融合的研究[J].菌物系統(tǒng),1998,17(1):52-56.

[19]張麗霞,郭成金.豬苓原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J].中國食用菌,2008, 27 (5) : 35-37, 55.

[20]李剛,李寶健,等.靈芝原生質(zhì)體分離與再生研究[J].菌物系統(tǒng),1999,18(1):79-88.

[21]鄒莉,楊民寶,王義,等.亞側(cè)耳原生質(zhì)體的制備與再生研究[J].中國食用菌,2009,28(3):53-55.

[22]勾麗莉,李莉,周建樹,等.血紅鉚釘菇原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化的研究[J].食用菌, 2008(4):19-21.

[23]王謙,王蕾,張浩軍,等.玉蕈原生質(zhì)體制備條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(7):2801-2802.

[24]李東屏,張志光,陳作紅,等.絲狀真菌原生質(zhì)體技術(shù)研究(Ⅵ)——高腳小傘原生質(zhì)體的制備與再生[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，1997,20(2):82-86.

[25]沙濤,張漢波,丁驊孫,等.松茸菌絲原生質(zhì)體形成與再生條件的研究[J].生物技術(shù),2001,11(2):11-14.

[26]王昱,王義,王康宇,等.靈芝原生質(zhì)的制備與再生[J].中草藥, 2013(16):184-188.

[27]許謙.桑黃菌原生質(zhì)體的高效分離探究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2014,28(11):1993-2000.

[28]陳敏,蔣予箭,姚善涇,等.杏鮑菇原生質(zhì)體制備技術(shù)的研究[J].食品科學(xué),2005,26(8):150-152.

[29]張李陽.靈芝原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J].南京曉莊學(xué)院學(xué)報(bào),2000,16(4):10-13.

[30]周禮紅,羅麗美.蛹蟲草原生質(zhì)體的制備與再生[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,48(7):1622-1624.

[31]宋志偉,樸惠善.大型藥用真菌對心血管作用的研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥,2006,8(10):29-31,47.

[32]鹿桂花,陳恒雷,呂杰,等.食用菌原生質(zhì)體技術(shù)的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2008,18(1):87-89.

Research on Formation and Regeneration of Protoplast of Macrofungi

Li Jingying , Sun Tingting, Zhang Guoquan, Zou Li*

(Northeast Forestry University, Harbin 150040)

This paper summarized protoplast preparation and regeneration technology of various macrofungi and analysed factors influencing protoplast preparation and regeneration of macrofungi, which provides theory basis for the research on breeding and transgene of macrofungi in the future.

Macrofungi; Protoplast; Formation; Regeneration

2015-04-08

Q813.2

A

*通訊作者：鄒莉(1966-)，女，教授，主要從事食藥用菌的教學(xué)與研究，E-mail：13903650896@163.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.04.038