子宮內(nèi)膜異位癥中HIF—1α和VEGF的表達及臨床意義

戴星++++++周靜++++++胡鳴++++++孫玉芳

[摘要] 目的 探討子宮內(nèi)膜異位癥患者缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達及相關(guān)性，兩者在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中的意義。 方法 采用免疫組織化學ElivisionTM二步法分別檢測30例子宮內(nèi)膜異位癥（實驗組）異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜，以及30例正常子宮內(nèi)膜（對照組）中HIF-1α和VEGF的表達，并對兩者表達的相關(guān)性進行分析。 結(jié)果 HIF-1α在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位及在位內(nèi)膜中的表達水平均強于正常子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且在異位內(nèi)膜中的表達水平強于在位內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位及在位子宮內(nèi)膜中的表達強于正常子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且在異位內(nèi)膜中的表達強于在位內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；各組中的增生期和分泌期表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 結(jié)論 HIF-1α與VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜中的表達增高，且呈正相關(guān)。HIF-1α可能通過VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜異位癥；缺氧誘導因子-1α；血管內(nèi)皮生長因子；免疫組織化學

[中圖分類號] R711.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）12（b）-0017-04

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女的常見病、多發(fā)病，近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]，已成為嚴重影響婦女身心健康與生育功能的難以治愈的疾病。盡管子宮內(nèi)膜異位癥是良性疾病，但它卻有著惡性腫瘤類似的生物學特性，諸如侵襲、種植，甚至很可能遠處轉(zhuǎn)移。近年來國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，新生血管的生成是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過程中的關(guān)鍵一環(huán)。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能夠特異性地作用在血管內(nèi)皮細胞上，是眾多促血管生成因子中最重要的一個[2]，不僅能促使新生血管的生成，而且在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用[3]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是一種關(guān)鍵性的調(diào)控因子，它介導了細胞對缺氧微環(huán)境適應(yīng)的反應(yīng)，并在腫瘤侵襲過程中形成新生血管的環(huán)節(jié)上發(fā)揮著重要的作用。本研究旨在探討HIF-1α、VEGF與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并探討其如何發(fā)揮作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象來源于南昌大學第四附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2011年1月～2014年1月的手術(shù)病例。實驗組為子宮內(nèi)膜異位癥患者30例，術(shù)后經(jīng)病理證實，獲取異位病灶及子宮內(nèi)膜，其中增生期20例，分泌期10例，平均年齡（44.07±7.49）歲；對照組為因子宮肌瘤行子宮切除、盆腔結(jié)構(gòu)正常的患者30例，獲取子宮內(nèi)膜，其中增生期18例，分泌期12例，平均年齡（46.10±5.19）歲。所選病例術(shù)前3個月內(nèi)未應(yīng)用過激素類藥物，未接受放療、化療及手術(shù)治療，均無其他免疫疾病、急性炎癥及其他腫瘤病史。所取的組織標本全部經(jīng)病理學確診，月經(jīng)周期按第8版《婦產(chǎn)科學》教材，經(jīng)HE染色后分為增生期及分泌期。

1.2 主要試劑

鼠抗人VEGF單克隆抗體（即用型）、免疫組織化學ElivisionTM試劑盒、DAB染色試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。兔抗人HIF-1α多克隆抗體為濃縮劑，購自武漢博士德生物工程有限公司；試驗時稀釋濃度為1∶50。

1.3 方法

所有標本均由10%甲醛固定、石蠟包埋，連續(xù)3 μm切片，采用免疫組織化學ElivisionTM二步法非生物素檢測系統(tǒng)，已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色。實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.4 結(jié)果判斷

HIF-1α的蛋白陽性信號主要表達在腺上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)，顯微鏡下可見呈棕黃色顆粒。VEGF蛋白陽性主要表達在內(nèi)膜細胞胞質(zhì)內(nèi)和血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)內(nèi)。HIF-1α和VEGF蛋白表達的判定均參照Birner等[4]半定量測定的方法，據(jù)高倍鏡下綜合染色強度和陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比進行判定。著色弱但明顯強于陰性對照者為1分，染色清晰者為2分，染色強者為3分；陽性細胞占總細胞數(shù)的判定：10%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。以上兩項評分相加，陽性細胞<10%為（-），3分為弱陽性（+），4～5分為陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料采用精確概率法以及χ2檢驗，等級資料采用Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α的表達

HIF-1α蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中的陽性表達率分別為80.00%（24/30）、53.33%（16/30）、0（0/30），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=40.320，P<0.01）。在異位內(nèi)膜中的表達高于在位內(nèi)膜（χ2=4.8，P<0.05）；在異位和在位內(nèi)膜中的表達高于正常子宮內(nèi)膜（χ2=21.818，P<0.01）。異位和在位內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜中增生期和分泌期的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表1）。

表1 HIF-1α的表達（n）

2.2 VEGF的表達

VEGF蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中的陽性表達率分別為83.33%（25/30）、60.00%（18/30）、6.67%（2/30），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=37.067，P<0.01）。在異位內(nèi)膜中的表達高于在位內(nèi)膜（χ2=4.022，P<0.05）；在異位和在位內(nèi)膜中的表達高于正常子宮內(nèi)膜（χ2=19.100，P<0.01）。異位和在位內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜中增生期和分泌期的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表2）。

表2 VEGF的表達（n）

2.3 HIF-1α與VEGF表達的相關(guān)性分析

子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜中HIF-1α與VEGF表達的相關(guān)系數(shù)為0.635（P<0.01）（表3），說明HIF-1α與VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜中的表達均呈正相關(guān)。

表3 HIF-1α與VEGF表達的相關(guān)性分析

3 討論

缺氧誘導因子-1（HIF-1）是一種核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，存在于哺乳動物或人體內(nèi)，能夠在低氧條件下促使細胞對缺氧狀態(tài)進行適應(yīng)性應(yīng)答。α和β分別是它的兩個亞單位，其中能決定HIF-1的活性的、唯一的氧分子調(diào)節(jié)亞單位即是HIF-1α[5]。人HIF-1α基因定位于14號染色體q21～24區(qū)，其cDNA長3720 bp，可編碼含有826個氨基酸殘基的多肽鏈。Simon等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在低氧狀態(tài)進行應(yīng)答時起全局調(diào)控的作用，可以激活100多種低氧適應(yīng)性基因的表達，在血管發(fā)生及重建、細胞凋亡、紅細胞生成、糖酵解等的各個方面。HIF-1α能夠調(diào)節(jié)血管形成的各個階段，也是缺氧狀態(tài)下血管生成的關(guān)鍵性的調(diào)控因子[8-10]。Sharkey等[11]研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制之一就是在缺氧的條件下新生血管大量地形成。本研究結(jié)果中，HIF-1α在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜中呈高表達，在正常子宮內(nèi)膜中呈低表達，組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義，與任旭等[12]的報道一致，由此提示異位灶組織中HIF-1α有異常的生物學活性，與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生密切相關(guān)，在子宮內(nèi)膜異位癥的早期，異位和在位的內(nèi)膜相對處于缺氧狀態(tài)，引起細胞過度表達HIF-1α，促使新生血管形成，因而缺氧可能是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的一個誘因。HIF-1α在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜的表達明顯強于正常子宮內(nèi)膜，提示發(fā)生子宮內(nèi)膜異位癥的原因其中之一可能是月經(jīng)期脫落的子宮內(nèi)膜處在缺氧的狀態(tài)。

HIF-1α調(diào)節(jié)血管生成的作用主要是通過其靶基因VEGF實現(xiàn)的[13]。目前得到公認的、最強的促血管生成因子就是VEGF，它是血小板衍生生長因子超家族的成員，分子量為34～36 kDa，是一種多肽類生長因子。人類的VEGF基因位于6p21.3染色體，含有7個內(nèi)含子和8個外顯子，全長28 kb。它通過自分泌和旁分泌共同作用，與血管內(nèi)皮細胞的特異性受體結(jié)合，有強大的促內(nèi)皮增生、促血管生成作用[14]，因此可促進異位病灶的形成。VEGF表達高低直接反映了該組織的血管生成的活性。Maclaren等[15]研究顯示，實驗組子宮內(nèi)膜異位癥患者異位病灶和腹腔液中的VEGF呈高表達，明顯強于對照組，且新鮮紅色病灶中VEGF的含量遠遠大于顏色較暗的陳舊病灶，說明紅色病灶屬于異位內(nèi)膜種植的初始階段，血管生成十分活躍，也證實了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生依賴于新血管的形成。本研究結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位及在位內(nèi)膜中，VEGF高表達，陽性表達率分別為83.33%和63.33%，明顯高于正常子宮內(nèi)膜中的6.67%，與王春紅等[16]的報道一致，提示在子宮內(nèi)膜異位癥的血管形成中，VEGF起到了非常重要的作用，其具有更強的血管生長能力及增殖活性。VEGF含量的增高提示子宮內(nèi)膜血管生成增多，因此這可能是子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜能夠成功種植，進一步生長，最終導致子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的核心步驟和必備條件。

在VEGF的表達的調(diào)控中，多種因素共同作用，其中缺氧是誘導VEGF表達的核心因素。HIF-1α能夠在多個層面上[8，17]，在基因水平上廣泛調(diào)控VEGF的表達：它不僅能夠啟動VEGF的轉(zhuǎn)錄，促進VEGF mRNA的蛋白質(zhì)翻譯，還可以上調(diào)VEGF受體的轉(zhuǎn)錄。因此，在組織缺氧時，HIF-1α被激活，HIF-1α高表達導致VEGF的表達增加，VEGF與存在于血管內(nèi)皮表面的特異性受體（VEGFR1和VEGFR2）結(jié)合，從而發(fā)揮強大的促血管生成的作用，促使新生血管形成。然而，新生血管的結(jié)構(gòu)不如正常血管結(jié)構(gòu)完善，并不能改善組織缺氧，反而誘發(fā)更多的生長因子和新生血管形成。隨著異位內(nèi)膜的生長，血液供應(yīng)的相對不足，又引起缺氧，缺氧又反饋引起VEGF的表達，周而復始，促使子宮內(nèi)膜異位癥不斷發(fā)展。本研究顯示在子宮內(nèi)膜異位癥中HIF-1α和VEGF蛋白表達呈正相關(guān)，表明VEGF正是通過HIF-1α的調(diào)節(jié)，促進異位灶的血管形成，致使異位內(nèi)膜更易于種植在腹膜的表面，存活并增殖，病灶不斷擴大，從而促進子宮內(nèi)膜異位癥進一步發(fā)展。

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制十分復雜，是多因素綜合的動態(tài)發(fā)展過程，至今為止，發(fā)病機制仍在深入探索中。子宮內(nèi)膜的異位種植和生長離不開充足的血液供應(yīng)，新血管的形成是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。因此，抑制血管生成可能成為子宮內(nèi)膜異位癥預防和治療的新領(lǐng)域。HIF-1α和VEGF的研究有可能成為預防和治療子宮內(nèi)膜異位癥的新方法。

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（收稿日期：2014-10-22 本文編輯：郭靜娟）