細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞活性檢測方法進(jìn)展

石秀敏 牛 超 李 敏 金浩范 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，長春 130021)

細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)活性的測定是了解機體細(xì)胞免疫功能的重要方法。腫瘤免疫治療中使用腫瘤表位分子使特異性的CTL 激活并擴增，達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的［1］，抗病毒多表位DNA 疫苗也在快速發(fā)展［2］，這些研究中CTL 的定性和定量檢測非常重要，因此如何更好地檢測CTL 活性成為一個關(guān)鍵的問題。近年來，許多新的評估CTL 活性的方法得到發(fā)展，本文就此做以綜述。

1 第一代檢測方法

第一代CTL 活性的檢測方法是數(shù)十年前發(fā)展起來的，主要包括抗原刺激后的增殖實驗以及檢測細(xì)胞毒性的51Cr 釋放實驗。這兩種實驗均在整個細(xì)胞群體水平評價CTL 的活性，需要預(yù)先體外擴增，所以T 細(xì)胞活性的檢測依賴于細(xì)胞的增殖潛能，實驗結(jié)果受體外刺激過程的影響很大，限制了其在檢測體內(nèi)免疫活性方面的敏感性及應(yīng)用。

1.1 CTL 增殖實驗 常用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)及3H 胸腺嘧啶核苷摻入法。前者的基本原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源性MTT還原為不溶于水的紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)，甲瓚的生成量與細(xì)胞數(shù)目和/或細(xì)胞活性呈正相關(guān)，用二甲亞砜(DMSO)溶解所生成的甲瓚，通過檢測光密度值變化，可間接反映細(xì)胞生長及增殖活性。后者的原理是前體T 細(xì)胞受到特異性抗原刺激后增殖，具有放射性的3H-TdR 可作為合成DNA 的原料而攝入細(xì)胞內(nèi)，測定細(xì)胞內(nèi)放射性物質(zhì)的相對數(shù)量，就能客觀地反映前體T 細(xì)胞對抗原的應(yīng)答水平。但上述方法實驗周期較長，且不能檢測失能的T 細(xì)胞，可能使檢測值偏低。

1.251Cr 釋放實驗 Na251CrO4能進(jìn)入到增殖的細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞漿蛋白質(zhì)牢固地結(jié)合。當(dāng)標(biāo)記了51Cr的細(xì)胞死亡后，即可釋放出51Cr。51Cr 輻射γ 射線，通過測定死亡靶細(xì)胞釋放到上清中的51Cr，即可計算出效應(yīng)細(xì)胞活性。該方法曾被認(rèn)為是細(xì)胞毒性檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因其敏感性差、標(biāo)記率低，并存在同位素污染問題，目前已經(jīng)較少使用。

1.3 Calcein-AM 熒光法 Calcein-AM 是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的染色試劑，本身無熒光，穿透細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后，酯酶會將其水解為綠色熒光物質(zhì)Calcein(鈣黃綠素)。當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞作用于靶細(xì)胞，死亡的靶細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加，Calcein 就會釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的熒光，即可獲得效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率。不足的是Calcein-AM 在高濃度時可能損害細(xì)胞功能，且可發(fā)生熒光淬滅，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 第二代檢測方法

近十年發(fā)展起來的第二代體外CTL 活性的檢測方法明顯改善了我們檢測T 細(xì)胞活性的能力，這些方法是基于單個細(xì)胞水平的檢測，并且提供了細(xì)胞的量化結(jié)果。

2.1 HMC 四聚體法 對某一抗原而言，其特異性T 細(xì)胞的TCR 庫是有限制性的，因此可利用基于TCR 結(jié)構(gòu)特征的方法來檢測某一特定抗原的CTL的克隆的信息［3］。1996 年，Altman 等首次用主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC)Ⅰ類分子、抗原肽和熒光染料標(biāo)記聯(lián)接蛋白組成的單體物通過親和素鉸鏈成為四聚體復(fù)合物，用來檢測具有特定TCR 的CTL。該法避免了體外培養(yǎng)增殖或同位素殺傷過程，只需合成復(fù)合物就可進(jìn)行定量檢測，檢測到的T細(xì)胞數(shù)量比常規(guī)方法要高10 倍，且可通過流式細(xì)胞儀分選將特異性CTL 從淋巴細(xì)胞群中分離純化出來。其主要限制因素包括已知的確定的表位、針對各自表位/HLA 等位基因的合適四聚體、四聚體非特異性結(jié)合以及不能提供細(xì)胞功能方面的信息等。

2.2 檢測細(xì)胞因子及細(xì)胞毒性顆粒 活化的CTL分泌功能性細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性顆粒，如IL-2、IFNγ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶等，通過檢測細(xì)胞因子的分泌情況可反映T 細(xì)胞的活性，但是只有產(chǎn)生細(xì)胞因子的特異性T 細(xì)胞亞型才能被檢測到，并且腫瘤特異性T 細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子量通常低于病毒特異性的T 細(xì)胞，也可能低于ELISPOT 方法的檢測范圍。此外，功能分析對實驗條件的變化很敏感，非特異性細(xì)胞因子的分泌可能限制這些方法的靈敏度。

2.2.1 酶聯(lián)免疫斑點法(Enzyme-linked immunosorbent spot assay，ELISPOT) CTL 受抗原刺激后一旦分泌功能性細(xì)胞因子，就被預(yù)包被的抗體直接捕獲，通過局部形成的斑點數(shù)目得出分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞頻數(shù)，從而反映抗原特異性CTL 的活性。該方法靈敏度和特異性均很高，且所需T 細(xì)胞數(shù)量較少，節(jié)約臨床樣本，但此法也有一定的局限性，如果T 細(xì)胞無功能或分泌其他的細(xì)胞因子，就有可能低估CTL 的數(shù)量，另外除了CTL、NK 細(xì)胞等也可分泌相同的細(xì)胞因子，故還需結(jié)合細(xì)胞表型的分析［4］。Malyguine 等［5］分別對GrB ELISPOT 法、IFN-γ ELISPOT 法和51Cr 釋放法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示三者的相關(guān)性較好，并且GrB ELISPOT 法與51Cr 釋放法的反應(yīng)性非常接近，比IFN-γ ELISPOT 法和四聚體法更快速更直接。

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法 ELISPOT 法間接地提供分泌某種細(xì)胞因子的CTL 數(shù)目，而細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法則可以提供更直接、更準(zhǔn)確的信息。1993 年，Jung 等采用莫能星(Monesin)等藥物預(yù)孵的方法，阻斷胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)運，使其在細(xì)胞內(nèi)蓄積，然后應(yīng)用兩種免疫熒光抗體分別標(biāo)記CTL 表面的亞群標(biāo)志分子和胞內(nèi)細(xì)胞因子，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析，即可得到不同T 細(xì)胞亞群某一細(xì)胞因子的分泌情況。最近 Mitzi Donaldson 等［6］利用8 色細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法，定量測定了臨床前疫苗研究中恒河猴的T 細(xì)胞反應(yīng)。結(jié)果顯示，該方法具有很高的重復(fù)性，并且在組間、操作者之間及不同時間上的變異很低，是臨床前免疫原性檢測的一個標(biāo)準(zhǔn)方法［7］。

3 第三代檢測方法

第三代CTL 活性的檢測方法提供了更全面的T細(xì)胞表型和功能信息。這些分析方法可以多方面提供T 細(xì)胞活性的信息，包括T 細(xì)胞殺傷效應(yīng)、增殖以及遷移潛能等。

3.1 Caspase 抗體標(biāo)記凋亡靶細(xì)胞 T 細(xì)胞受體識別靶細(xì)胞表面的MHC-抗原肽復(fù)合物后，CTL 即可釋放穿孔素及粒酶或者激活Fas/FasL 信號通路，靶細(xì)胞繼發(fā)caspase 瀑布級聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)生凋亡，其中caspase-3 是一個重要的凋亡指示蛋白，在凋亡發(fā)生的早期就可以被激活。He 等［8］利用細(xì)胞示蹤染料DDAO-SE 標(biāo)記P815、EL4 和T2 淋巴瘤細(xì)胞，并用caspase-3 抗體對凋亡細(xì)胞染色。結(jié)果證明，該方法用于檢測一些人和鼠的抗原特異性CTL 活性是安全、可靠的。Chahroudi 等報道，利用可穿透細(xì)胞膜的熒光標(biāo)記caspase，檢測CTL 誘導(dǎo)的靶細(xì)胞caspase 激活，比傳統(tǒng)的51Cr 釋放法更快、更安全、更敏感，能在單個細(xì)胞水平檢測靶細(xì)胞，并可與其他檢測方法同時進(jìn)行。CTL 通過釋放穿孔素和粒酶以及激活FasL 和TRAIL 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但二者在作用時間上不同，Hassin 等［9］通過抗體熒光標(biāo)記caspase-8 激活和BID 的裂解，解釋了其原因是這兩種機制是同時跳躍式開始的，而FasL 的溶解作用滯后，所以caspase 抗體標(biāo)記靶細(xì)胞是一個很敏感的反映凋亡的方法。

3.2 Annexin V 標(biāo)記凋亡靶細(xì)胞 磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)是一種磷脂，正常情況下分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，細(xì)胞凋亡時外翻到細(xì)胞表面，可與外源性的Annexin V 高親和力結(jié)合，從而區(qū)分細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。Goldberg 等將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育后，用PE 結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞特異性單克隆抗體并標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞，不能與PE-mAb 結(jié)合的細(xì)胞即為靶細(xì)胞，再用FITC 標(biāo)記的Annexin V 來檢測細(xì)胞凋亡時出現(xiàn)在細(xì)胞表面的PS。結(jié)果顯示，該方法與51Cr釋放法在檢測細(xì)胞毒性方面有明顯相關(guān)性。

3.3 PI 或7-AAD 標(biāo)記死亡靶細(xì)胞 評價靶細(xì)胞死亡的方法中應(yīng)用最廣泛的是檢測DNA 嵌入熒光劑的攝取，如PI，可因死亡靶細(xì)胞膜通透性增加而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DNA 嵌合。已經(jīng)有很多方法聯(lián)合熒光染料和DNA 嵌入染料來直接鑒別死亡細(xì)胞，特別是Annexin V-FITC/PI 雙染法，已被廣泛用于區(qū)別細(xì)胞凋亡與死亡。例如，Ozdemir 等［10］將靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞用特異性的單克隆抗體染色，用Annexin V 和PI 組合來區(qū)分凋亡/死亡細(xì)胞。Sun［11］和Yang等［12］也使用Annexin V-FITC/PI 雙染法來區(qū)分凋亡/死亡細(xì)胞，結(jié)果證明這種方法是有效的，毫不遜色于51Cr 釋放法，且更快、更容易操作。

7-AAD 是一種最常用的PI 替代物，也可以穿透死細(xì)胞的細(xì)胞膜，插入到核酸的雙鏈中，研究證明死亡的靶細(xì)胞攝取7-AAD 和PI 的水平幾乎相同。被熒光標(biāo)記的Annexin V 與靶細(xì)胞膜結(jié)合，同時加入PI 或7-AAD，可以檢測細(xì)胞凋亡，并在單細(xì)胞水平上區(qū)分細(xì)胞凋亡的不同階段。Lecoeur 等［13］也通過標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞來區(qū)分效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞。用CFSE來標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞，在CFSE 陰性的靶細(xì)胞群中，用Annexin V-7AAD 來鑒別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。也有學(xué)者用PKH67 標(biāo)記靶細(xì)胞，Annexin V-PE 和7-AAD 評估死亡細(xì)胞［14］，結(jié)果顯示，流式細(xì)胞儀檢測靶細(xì)胞死亡率和51Cr 釋放法所得結(jié)果之間有明顯相關(guān)性。

該方法簡單、可靠，應(yīng)用廣泛，但是不能區(qū)分晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，而且必須要用活細(xì)胞來檢測，對細(xì)胞的活性要求較高，應(yīng)該是狀態(tài)最好的時候進(jìn)行檢測。

3.4 溶酶體相關(guān)膜糖蛋白(LAMPs)抗體標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞脫顆粒 細(xì)胞毒顆粒，即粒酶和穿孔素是膜包被的溶酶體，CTL 通過胞吐作用將其釋放后介導(dǎo)細(xì)胞死亡。包繞細(xì)胞毒顆粒的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)包含溶酶體相關(guān)膜糖蛋白(Lysosomal-associated membrane glycoproteins，LAMPs)，包括CD107a (LAMP-1)、CD107b (LAMP-2)和CD63 (LAMP-3)。CTL 在適當(dāng)?shù)拇碳は?，微管發(fā)生移動，將顆粒運送到CTL 的質(zhì)膜，隨后質(zhì)膜發(fā)生融合，粒酶和穿孔素被釋放到突觸中，繼而發(fā)生脫顆粒［15］，導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。在脫顆粒過程中，溶酶體膜和細(xì)胞膜融合的結(jié)果是，溶酶體膜表面的糖蛋白可表達(dá)于細(xì)胞表面，溶酶體相關(guān)膜糖蛋白(LAMPs)抗體與其結(jié)合，可標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞脫顆粒過程。

流式細(xì)胞儀檢測CD8+T 細(xì)胞上CD107a 和CD107b 的表達(dá)作為一種可靠的臨床監(jiān)測方法，已獲得越來越多的認(rèn)可。例如，Wang 等［16］人通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜上CD107a 的表達(dá)，建立了一種可量化評價NK 細(xì)胞及CTL 細(xì)胞毒性的方法，結(jié)果證明該方法可以快速、有效的篩查細(xì)胞毒性缺陷相關(guān)的疾病，如家族性噬血細(xì)胞淋巴組織增生綜合征及其他原發(fā)性免疫缺陷繼發(fā)的疾病。Yoshikawa等［17］在Glypican-3 (144-152)肽疫苗治療進(jìn)展期的肝細(xì)胞癌患者的I 期臨床試驗中，用Dextramer 和CD107a 抗體對Glypican-3 (144-152)肽特異性CTL細(xì)胞進(jìn)行單個細(xì)胞分選，建立了很多Glypican-3(144-152)肽特異性CTL 克隆，并證明了Glypican-3(144-152)肽疫苗誘導(dǎo)的CTL 能高效的識別并殺傷表達(dá)Glypican-3 的肝細(xì)胞癌細(xì)胞。

3.5 其他方法 CTL 被激活后通過表達(dá)TRAIL 和Fas-L 與靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體分子結(jié)合，啟動信號轉(zhuǎn)到途徑而誘導(dǎo)凋亡，故CTL 表面TRAIL 及Fas-L 的檢測，可以反映其活化程度和殺傷能力［18，19］;CTL 細(xì)胞因子受體及粘附抗原的檢測，可反映其遷移能力［20］;CFSE 稀釋法可反應(yīng)細(xì)胞的增殖能力;CTL 對稀釋后不同濃度抗原的反應(yīng)，提示TCR 與特異性抗原的親和力;抗原標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞在體內(nèi)的存活也可反映CTL 的活性，等等。

4 展望

CTL 活性檢測在鑒定CTL 優(yōu)勢表位、評估疫苗效果、預(yù)測移植排斥反應(yīng)等方面有重要的意義，各種檢測CTL 活性的方法已廣泛應(yīng)用于實驗研究和臨床研究，這些方法各有特點，研究者可根據(jù)具體需要進(jìn)行選擇，其中隨著熒光測定儀器的普及和新的熒光標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，熒光測定法將有可能取代傳統(tǒng)的方法，而微量和直接測定體內(nèi)CTL 活性的方法將為細(xì)胞免疫研究開辟新路。

［1］Takahashi R，Ishibashi Y，Hiraoka K，et al.Phase II study of personalized peptide vaccination for refractory bone and soft tissue sarcoma patients［J］.Cancer Sci，2013，104(10):1285-1294.

［2］Balamurugan A，Ali A，Boucau J，et al .HIV-1 Gag Cytotoxic T Lymphocyte Epitopes Vary in Presentation Kinetics Relative to HLA Class I Downregulation［J］.J Virol，2013，87 (15):8726-8734.

［3］Guillaume P，Dojcinovic D，Luescher IF.Soluble MHC-peptide complexes:tools for the monitoring of T cell responses in clinical trials and basic research［J］.Cancer Immun，2009，9:7.

［4］Meredith Slota，Jong-Baeck Lim，Yushe Dang，et al.ELISpot for measuring human immune response to vaccines［J］.Expert Rev Vaccines，2011，10(3):299-306.

［5］Malyguine A，Strobl S，Zaritskaya L，et al.New approaches for monitoring CTL activity in clinical trials［J］.Adv Exp Med Biol，2007，601:273-284.

［6］Kathryn E.Foulds，Mitzi Donaldson，Mario Roederer.OMIP-005:quality and phenotype of antigen-responsive rhesus macaque T cells［J］.Cytometry A，2012，81 (5):360-361.

［7］Donaldson MM，Shing-Fen Kao，Leila Eslamizar，et al.Optimization and qualification of an 8-color intracellular cytokine staining assay for quantifying T cell responses in rhesus macaques for pre-clinical vaccine studies［J］.J Immunol Methods，2012，386 (2012):10-21.

［8］He L，Hakimi J，Salha D，et al.A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells［J］.J Immunol Methods，2005，304:43-59.

［9］Hassin D，Garber OG，Meiraz A，et al.Cytotoxic T lymphocyte perforin and Fas ligand working in concert even when Fas ligand lytic action is still not detectable［J］.Immunology，2011，133(2):190-196.

［10］Ozdemir O.Flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay［J］.J Immunol Methods，2007，318:158-159.

［11］Sun F，Liu J Y，He F，et al.In vitro antitumor activity evaluation of hyperforin derivatives［J］.J Asian Nat Prod Res，2011，13(8):688-699.

［12］Yang L，Zhou X，Yang J，et al.Aspirin inhibits cytotoxicity of peptide PrP106-126 to neuronal cells associated with microglia activation in vitro［J］.J Neuro Immunol，2008，199(1-2):10-17.

［13］Lecoeur H，F(xiàn)evrier M，Garcia S，et al.A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cellmediated cytotoxicity［J］.J Immunol Methods，2001，253:177-187.

［14］Derby E，Reddy V，Kopp W，et al.Three-color flow cytometric assay for the study of the mechanisms of cell-mediated cytotoxicity［J］.Immunol Lett，2001，78:35-39.

［15］DeBenedette MA，Calderhead DM，Tcherepanova IY，et al.Potency of mature CD40L RNA electroporated dendritic cells correlates with IL-12 secretion by tracking multifunctional CD8(+)/CD28(+)cytotoxic T-cell responses in vitro［J］.J Immunother，2011，34(1):45-57.

［16］Wang J，Liu Z，Jiang LP，et al.Screening for cytotoxic defects with flow cytometric detection of CD107α on natural killer cells and cytotoxic lymphocyte cells［J］.Zhonghua Er Ke Za Zhi，2012，50(5):386-391.

［17］Yoshikawa T，Nakatsugawa M，Suzuki S，et al.HLA-A2-restricted glypican-3 peptide-specific CTL clones induced by peptide vaccine show high avidity and antigen-specific killing activity against tumor cells［J］.Cancer Sci，2011，102(5):918-925.

［18］Yang D，Torres CM，Bardhan K，et al.Decitabine and vorinostat cooperate to sensitize colon carcinoma cells to Fas ligand-induced apoptosis in vitro and tumor suppression in vivo［J］.J Immunol，2012，188(9):4441-4449.

［19］Diao Z，Shi J，Zhu J，et al.TRAIL suppresses tumor growth in mice by inducing tumor-infiltrating CD4(+)CD25 (+)Treg apoptosis［J］.Cancer Immunol Immunother，2013，62 (4):653-663.

［20］Weigelin B，Krause M，F(xiàn)riedl P.Cytotoxic T lymphocyte migration and effector function in the tumor microenvironment［J］.Immunol Lett，2011，138(1):19-21.