豬瘟病毒增殖特性研究進展

張玉杰，徐璐，張乾義，王琴

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

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豬瘟病毒增殖特性研究進展

張玉杰，徐璐，張乾義，王琴*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

從豬瘟病毒在體內外的增殖特性、病毒蛋白在RNA復制中的作用兩個方面對豬瘟病毒的增殖規(guī)律進行了闡述，以期為豬瘟病毒致病機理的研究提供參考。

豬瘟病毒；增殖特性；復制

豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員之一,為單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為12.3 kb，由5’-非編碼區(qū)(5’-UTR)、一個開放閱讀框(ORF)和3’-非編碼區(qū)(3’-UTR)三部分組成。CSFV基因組編碼一個由3898個氨基酸組成的多聚蛋白，之后被蛋白酶在信號肽處切割成4個結構蛋白，由絲氨酸蛋白酶介導切割成8個非結構蛋白。參與復制的CSFV蛋白根據(jù)參與復制的重要性不同，CSFV的基因可以分為復制必需基因和復制非必需基因。其中基因E0、E1、E2在病毒的脫衣殼與入核階段起到了重要的作用，而基因NS5A和NS5B在CSFV的復制過程中扮演著十分重要的角色。CSFV在高爾基體和內質網中裝配成熟后，成熟的感染性顆粒釋放到細胞外來完成CSFV完整的生活周期，而核衣殼C蛋白則在病毒的包裝功能上發(fā)揮著重要的作用。

病毒的生活周期包括病毒與細胞受體的吸附、病毒的變形內化、入胞、細胞內的再定位、病毒脫衣殼、入核、復制、包裝和釋放等過程[1]。其中，從病毒粒子的消失開始，到產生新的子代病毒粒子為止為病毒感染的隱蔽期，而隱蔽期又是病毒增殖過程中的主要階段[2]。本文對CSFV的生活周期進行了介紹，同時從CSFV在體內外的增殖特性以及病毒在RNA復制中的作用兩個方面對豬瘟病毒的增殖規(guī)律進行了詳細的闡述。

1 CSFV的生活周期

CSFV可在豬的骨髓、睪丸、肺、脾和腎的細胞培養(yǎng)物及白細胞中繁殖，卻不使細胞發(fā)生病變[3]。研究表明，CSFV在感染過程中首先與宿主細胞表面受體結合，通過其表面的E1和E2糖蛋白介導著與宿主細胞接觸，開啟CSFV的生活周期[4]，之后病毒與靶細胞表面的糖蛋白在一個低pH值的酸性環(huán)境下進行膜融合過程[4-5]，病毒的核酸從核衣殼釋放到細胞質中。一方面利用細胞的起始因子和核糖體以RNA為模板合成一個大分子多聚蛋白，然后被切割成12個成熟蛋白，當病毒蛋白合成完成后就啟動RNA復制[6]；另一方面以病毒RNA為模板，在RNA依賴性RNA聚合酶的作用下合成負鏈，即形成了正鏈與負鏈共價連接的雙鏈RNA中間復合體，然后再合成正鏈。在細胞蛋白和病毒非結構蛋白的作用下，從宿主細胞中釋放出由核衣殼C蛋白包裹著的成熟且有感染性的顆粒。至此，CSFV完成其在宿主細胞中的一個生活周期。其中病毒RNA的3’UTR是復制過程中的關鍵調控位點[7-9]，NS3蛋白具有解旋酶活性，是CSFV基因復制必不可缺的因素[10]。

2 CSFV在體內外的增殖特性

CSFV在抗原性、病原性、病理特性、病變特征和遺傳性等方面已呈多樣化模式。病毒因素與宿主之間的相互作用決定CSFV感染的病程和結果，導致CSFV流行毒株在臨床上呈現(xiàn)出強、中、低不同致病力特征[11]。急性CSF通常由強致病力毒株引起，在1到2周內致死感染豬；非典型和溫和性CSF通常認為是由中等或低致病力毒株所致[12]。

2.1 CSFV在體內的增殖特性 經口鼻途徑感染CSFV后，CSFV首先在豬的扁桃體隱窩上皮細胞增殖，隨后擴散到周圍的淋巴網狀組織，并在局部淋巴結中增殖后到達血液，繼而擴散到骨髓、內臟淋巴結、腸道相關淋巴組織、胸腺以及脾臟等組織器官。通常CSFV強致病力毒株在2天內就能夠擴散到全身大部分組織器官，而對于CSFV低致病力毒株來說，丹麥學者Utenthal A等[13]在試驗中發(fā)現(xiàn)接種Paderborn毒株后2 d血液也能檢測到CSFV RNA分子，這說明不管是強致病力毒株還是低致病力毒株，接種后2 d病毒已經完成由扁桃體侵入到血液中進行少量增殖。CSFV在宿主體內感染的靶細胞種類主要是骨髓源的細胞[14]，尤其是單核細胞(Monocytes)和巨噬細胞(Macrophages)，這些細胞構成了病毒入侵宿主后早期感染靶細胞，隨感染進程出現(xiàn)豬淋巴細胞缺失、血小板減少、凝血功能障礙和胸腺、骨髓萎縮等病理特征[15-16]，同時CSFV也對網狀內皮細胞有很高的親和性[16-18]。侵入宿主靶細胞是病毒起始生活周期的關鍵步驟，CSFV通過自身蛋白和易感細胞受體的結合侵入細胞。在脾臟中，CSFV可以侵入脾臟巨噬細胞、星狀膠質細胞、網狀細胞和淋巴細胞等。有研究證明，CSFV進入脾臟后最先在脾索巨噬細胞、邊緣區(qū)邊緣竇和動脈周圍淋巴鞘中檢測到CSFV E2蛋白，隨后能在星狀內皮細胞、中性粒細胞和脾臟淋巴細胞中檢測到CSFV抗原，含有CSFV抗原的陽性細胞數(shù)量隨病程發(fā)展而逐漸增加。在侵入過程中巨噬細胞數(shù)量在邊緣區(qū)和脾索以及脾小結等區(qū)域隨病程發(fā)展而顯著性增加，一般在4～7 d達到峰值，7 d以后除邊緣區(qū)以外其他區(qū)域巨噬細胞數(shù)量保持相對穩(wěn)定。此外CSFV對豬的淋巴組織有嗜性，并可導致豬免疫系統(tǒng)的損傷[19]。在急性感染時，CSFV感染巨噬細胞和單核細胞，并且巨噬細胞支持CSFV的體內增殖。此外分子病理學研究還發(fā)現(xiàn)了慢性感染病程中CSFV的主要增殖場所為淋巴器官，且對其具有持續(xù)性的、不可恢復性的損傷，但對其他組織的損傷是可恢復性的。說明CSFV慢性感染病程中免疫器官的損傷是導致機體免疫失敗的根本原因，從機制上揭示了免疫逃逸的原因[20]。CSFV感染后還會對中樞神經系統(tǒng)造成損傷，感染早期CSFV感染的細胞主要是端腦吻端的淋巴細胞和小膠質細胞，隨后擴散到其他區(qū)域，血管周圍浸潤的淋巴細胞和間質細胞部分出現(xiàn)凋亡，并且在這些淋巴細胞中可檢測到CSFV抗原。

2.2 CSFV在體外細胞中的增殖特性 CSFV在豬體內感染導致多種細胞發(fā)生病變，尤其強毒株能夠引起急性豬瘟，出現(xiàn)高熱、皮膚出血點、白細胞數(shù)快速下降等典型癥狀，致死率可達100%。在體外細胞中 CSFV 以低水平增殖，其在胞內增殖的主要部位是有豐富膜系統(tǒng)的細胞核周圍。成熟的病毒粒子多見于細胞質中的膜囊中，有時可觀察到在膜囊質膜處的開口以及周圍的成熟病毒，表明CSFV可能通過這一特殊的結構向外釋放[21]，且釋放的大多數(shù)病毒依然吸附在囊膜的無定型基質中，但產生的子代病毒滴度較低[22]。CSFV在豬淋巴瘤38A1D細胞系上增殖，細胞上清中病毒滴度可達5×107TCID50/mL[23]。將CSFV Alfort187株感染PK-15 Cytodex 3微載體培養(yǎng)系統(tǒng)，可獲得較常規(guī)單層細胞培養(yǎng)25倍的病毒量，且細胞可帶毒傳代，并在細胞分裂時將病毒傳至子代細胞中。徐興然等[2]對CSFV強毒株石門株在PK15細胞中的增殖特性進行了研究，結果顯示在病毒感染后8 h 能檢測到病毒蛋白的表達、病毒基因組復制中間體負鏈RNA 并能檢測到具有感染性的病毒粒子，這表明CSFV增殖過程的“隱蔽期”約為8 h；在病毒感染后的8～36 h病毒蛋白合成速度較慢，而在48 h之后合成速度加快。結果還顯示，在病毒感染后48～52 h，病毒滴度達到高峰, 隨后病毒的感染滴度開始逐漸下降。田宏等[24]，采用間接免疫熒光法也對石門株在PK15細胞上的增殖特性進行研究，結果顯示接毒9 h后培養(yǎng)細胞中的熒光充滿胞質,并可清晰地勾勒出細胞核的形狀；接毒24 h后，細胞中發(fā)出較強的熒光；CSFV石門株感染PK15細胞54 h后，感染細胞中熒光減弱。兩個小組對CSFV強致病力毒株在PK15細胞上的增殖特性的研究基本一致，為CSFV石門株生活周期的闡明提供了可靠的數(shù)據(jù)。此外，田宏[24]利用直接熒光抗體染色法對C株在SK6細胞上的增殖規(guī)律進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)在接毒8 h時，胞質中開始出現(xiàn)熒光斑；接毒9 h時，培養(yǎng)細胞中的熒光基本充滿胞質，可顯示出細胞的形狀；感染12 h后，細胞質中熒光增強；24 h后，感染的細胞中釋放出的子代病毒粒子擴散并感染了周圍細胞，使被感染的細胞由單個存在發(fā)展為成團分布。48 h后幾乎全部細胞均被CSFV感染，細胞中發(fā)出較強的熒光。而且早在2000年，王鎮(zhèn)等[25]就對C株在原代牛睪丸細胞上增殖的基本特性和規(guī)律進行了研究，接毒后每隔12 h進行采樣，結果顯示與傳代細胞相同，CSFV抗原主要存在于感染細胞的細胞質中[26]。接毒后12 h樣品中檢測不到熒光；接毒后24 h，樣品中可觀察到微弱的熒光；接毒48～72 h 樣品中出現(xiàn)熒光較強的 CSFV 感染細胞，但陽性細胞數(shù)量只占整個細胞群體的少數(shù)，陽性率不超過10%。接毒后72～108 h是病毒感染細胞的迅速增長期，在這段時間里，陽性細胞率達到50%左右。以上研究結果顯示，C株對不同的細胞系有不同的適應性，其增殖特性也會有很大的區(qū)別當C株感染SK6細胞時，在細胞群體中能快速的檢測到感染的細胞，具有較快的增殖速度，此特點可以用于SK6細胞快速的檢測疫苗株，用以區(qū)分疫苗株和其他毒株，也為疫苗株在細胞上增殖特性的研究提供了可參考的數(shù)據(jù)。

3 CSFV蛋白基因在RNA復制過程中的作用

CSFV包含4種結構蛋白：C、E0、E1和E2,7種非結構蛋白：Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，在病毒的復制和組裝過程中起到重要的作用。同時有報道稱C、E0、E1、E2、Npro、P7 和 NS2 蛋白對于病毒 RNA 復制是非必需的,而NS3、NS4A、NS4B 和 NS5A 會形成復制酶復合體與具有 RDRP(RNA 依賴性 RNA 聚合酶)活性的 NS5B蛋白共同參與病毒 RNA 的復制[27]。

其中E1和E2可以介導病毒粒子進入細胞[4],在外的E0和E2蛋白在病毒感染過程中對于吸附細胞具有協(xié)同作用，可以增強病毒的感染能力[28]。E2蛋白與E0蛋白不同的是，E0是與宿主細胞表面的特異性受體結合而E2是非特異性結合。最近有研究表明，結構蛋白E0在細胞內不僅可與宿主蛋白相互作用，還可與病毒的結構蛋白和非結構蛋白相互作用，在病毒感染和復制過程中發(fā)揮重要的作用[29]。除此之外E0還具有RNA酶活性，在病毒復制過程中的作用也非常重要。而賀番等[30]于2013年研究表明，E2的182～261位氨基酸和262～341位氨基酸兩個區(qū)域與宿主細胞的β-actin的95～188位氨基酸區(qū)域相互作用，在CSFV復制的早期階段起著重要的作用。

Npro是病毒編碼的第一個非結構蛋白，但該蛋白對病毒在細胞中的復制并沒有起關鍵的作用。研究中用鼠泛素基因將其取代，所得到的新的重組病毒的復制特性和親代病毒類似[31]。有趣的是該蛋白在細胞內的運輸會對病毒在復制周期的晚期造成一定的影響。李永峰在研究中構建了表達IRF3-Npro融合蛋白的突變體病毒vSM-IRF3和表達失去抑制干擾素產生功能的Npro-D136N的突變體vSM-D136N,結果顯示病毒的復制在復制周期的晚期(36～72h)受到明顯的抑制[32]。

體外實驗證明NS2蛋白對于CSFV RNA的復制是非必需的，但是它具有調控病毒復制的能力，可以延長轉染細胞中病毒RNA復制的時間[33]。同時2011年王茁[34]研究顯示：將轉染CSFV NS2基因的PK15細胞接種石門株，同時以正常PK15細胞做對照，在接種后24、48、72 h后收獲病毒總RNA，結果顯示在細胞含量相同的情況下前者病毒基因的拷貝數(shù)遠遠低于后者。而當病毒基因組缺失NS2時，亞基因組復制子在細胞中復制速度加快。

NS3蛋白具有多種功能，其RNA解旋酶活性和核苷酸磷酸酶活性功能是病毒基因組RNA復制必不可少的因素，此外還包括絲氨酸蛋白酶活性，三者相互協(xié)同對病毒的復制、組裝也都起到關鍵的作用。如絲氨酸蛋白酶可以增強其解旋酶活性進一步可增強核糖體結合位點介導的翻譯活性，而其活性的發(fā)揮又依賴于核苷酸磷酸酶為其提供能量。此外NS3可以通過絲氨酸蛋白酶結構域(30～70AA)與NS5B(63～99AA和611～642AA)結合，從而增強NS5B RNA依賴性RNA酶活性，反過來這種相互作用又可以同時調節(jié)NS3的NTP酶和解旋酶活性。關于NS4A、NS4B蛋白影響CSFV復制的相關研究還比較有限。 2007年Moulin等[35]研究NS4A是NS3蛋白的輔助因子，NS4A蛋白不但影響病毒RNA的復制，而且在感染性病毒顆粒形成過程中起重要作用。通過建立P7-RNA反轉錄聚合酶來表達P7-NS2-3-4A,在缺乏基因 NS2-3的情況下仍能產生感染性病毒粒子，說明 NS2 在復制中非必需,而NS4 與 NS2-3 和 NS3分別相互作用來影響病毒的復制。NS4B具有核苷三磷酸酶(ATPase和GTPase活性)活性，該功能是由A區(qū)域(209～216位氨基酸)和B區(qū)域(335～342位氨基酸)兩段保守區(qū)域協(xié)調完成，且該活性在CSFV的生活周期中病毒的復制過程起到至關重要的作用。2011年，Gladue等[36]為研究區(qū)域A和區(qū)域B在CSFV復制中的作用，構建了一系列的突變病毒，其中包括CSFV Bresica株的全長cDNA克隆的NS4B蛋白NTPase酶活性的關鍵位點突變，將突變的cDNA與提取自野生型CSFV的RNA分別轉染SK6細胞，培養(yǎng)后將其上清重新感染SK6細胞，只有后者檢測到CSFV，前者的復制能力明顯減弱,證明NS4B蛋白的核苷三磷酸活性與CSFV基因組復制密切相關。

NS5A是一種磷酸化蛋白，在CSFV的復制過程中NS5A的突變并不影響病毒的復制，但是當其被絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化后就會對其造成影響，同時它還可以通過調節(jié)NS5B與RNA 3’UTR區(qū)的結合影響病毒基因組的復制。但是當NS5A的濃度過高時，NS5A自身會與3’-UTR結合來抑制CSFV RNA的復制，相反低濃度的NS5A就會促使NS5B與3’UTR結合來促進CSFV RNA的復制。此外，在CSFV感染細胞的過程中NS5A蛋白可以介導并完成一個完整的自噬途徑來增強病毒RNA的復制，自噬途徑的一個重要的指示因子是LC3而CSFV感染細胞后使得LC3重新分布，2013年Pei等[37]將pEGFP-NS5A和pEGFP-N1空載體分別轉染PK15細胞，結果顯示pEGFP-NS5A與pEGFP-N1相比促進了宿主細胞內LC3的表達，最終使得RNA的復制效率增強。在體外昆蟲細胞及豬腎細胞中的表達已證明NS5B具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，李維維[38]從細胞水平，分子水平和蛋白質水平探究了CSFV 的NS5B蛋白、C蛋白在CSFV復制中的作用。其結果顯示：CSFV衣殼蛋白 C可增強NS5B蛋白的RNA 聚合酶活性。此活性在病毒的復制周期中起著至關重要的作用。在CSFV RNA的復制起始階段，它可以識別并結合正鏈RNA的3’UTR形成負鏈RNA，再以負鏈RNA為模板形成正鏈RNA。NS5B除具有RNA依賴的RNA聚合酶活性外還具有末端核苷酸轉移酶(TNTase)活性，研究表明黃病毒科的NS5B蛋白具有甲基轉移酶活性，該活性在病毒的生活周期中發(fā)揮著巨大的作用[39]。

4 結語

近年來，研究者們一直致力于CSFV在細胞上的增值特性研究，以此來闡釋CSFV在動物體內復制規(guī)律及致病機理，也對影響病毒復制的相關蛋白也做了進一步的研究。而本文通過CSFV在體內外的增殖特性及病毒蛋白在RNA復制中所發(fā)揮的作用，系統(tǒng)地闡明了CSFV在體內外機體中的增殖規(guī)律及特性，為更深入地了解CSFV在豬體內的復制規(guī)律奠定了理論基礎，也為豬瘟疫苗在生產中的應用提供了一定的參考價值。

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(編輯：李文平)

Research Progress of Multiplication Characteristics of Classical Swine Fever Virus

ZHANG Yu-jie,XU Lu,ZHANG Qian-yi,WANG Qin*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

This article elaborated on the multiplication rule of classical swine fever virus(CSFV)from two aspects including the multiplication characteristics of CSFVinvitroandinvivo, and the virus proteins’ impacts on RNA replication in order to provide reference for the patheogenesis research of CSFV.

classical swine fever virus;multiplication characteristics;replication

張玉杰，碩士研究生，從事預防獸醫(yī)學研究。

王琴。E-mail：wq551@vip.sina.com

2015-09-28

A

1002-1280 (2015) 11-0059-06

S852.65+1