干細胞移植治療腦缺血的研究進展

干細胞移植治療腦缺血的研究進展

高海軍劉朋飛金明月1牟青春2黃海燕

(吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)腫瘤外科，吉林長春130021)

關(guān)鍵詞〔〕干細胞移植；腦缺血

中圖分類號〔〕R743.31〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：黃海燕(1963-)，男，副教授，博士生導師，主要從事顱內(nèi)腫瘤的診斷治療和膠質(zhì)瘤的光動力和內(nèi)放射治療及脊髓及先天性疾病顯微外科治療研究。

1吉林大學第一醫(yī)院兒科超聲室

2牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院神經(jīng)外科

第一作者：高海軍(1987-)，男，碩士在讀，主要從事顱腦相關(guān)腫瘤研究。

缺血性腦卒中是老年人致死致殘的主要疾病，且發(fā)病有逐年上升趨勢〔1〕。干細胞具有自我更新并分化為多種細胞系的能力〔2〕。在體外實驗中誘導型多能干細胞(iPS)可以來自成人的正常細胞，并分化成為特定類型的神經(jīng)細胞。有報道〔3，4〕指出腦缺血大鼠在干細胞移植治療后繼發(fā)了腫瘤形成。iPS誘導腫瘤形成的可能，限制了這一治療的臨床應用。在體外實驗中，胚胎干細胞(ESCs)具有分化為人體所有類型細胞的能力，并且可以無限制的自我更新。人類ESCs是多能分化的，并且可以從5d大的人類囊胚中獲得。然而由于倫理問題和導致腫瘤生成的風險〔5〕，ESCs移植的臨床試驗評估并不樂觀。除了誘導型多能干細胞和ESCs，成人干細胞是PS并可以從多種渠道獲得。成人干細胞移植的優(yōu)點是其適用于自體和同種異體移植。目前，成人干細胞治療缺血性腦卒中可以分為內(nèi)源性和外源性兩種。前者是應用內(nèi)源性干細胞；后者與外源性的干細胞移植有關(guān)。然而，成人干細胞移植和iPSCs及ESCs相比在分化潛能上并沒有優(yōu)勢。

1內(nèi)源性干細胞移植

1.1神經(jīng)干細胞(NSCs)在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些區(qū)域存在內(nèi)源性NSCs，主要分布于青壯年海馬和室管膜下區(qū)(SVZ)，但這些內(nèi)源性NSCs處于休眠狀態(tài)。腦缺血促進了海馬和室管膜下區(qū)細胞增殖和神經(jīng)母細胞的形成，從而促進內(nèi)源性NSCs遷移至缺血區(qū)域并分化為神經(jīng)元整合到受損區(qū)域發(fā)揮作用〔6〕。腦缺血后在海馬和室管膜下區(qū)都觀察到了NSCs的增殖和分化增強。最近研究表明，刺激內(nèi)源性神經(jīng)細胞生成可以促進腦卒中后大鼠神經(jīng)功能的恢復〔7〕，但由內(nèi)源性NSCs產(chǎn)生的神經(jīng)元數(shù)量極低，這與缺血環(huán)境不適合新生的神經(jīng)元生存有關(guān)。這些新生的神經(jīng)細胞大多數(shù)死亡或者分化為膠質(zhì)細胞。因此，刺激成人內(nèi)源性NSCs對于缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能恢復的作用是有限的。

1.2造血干細胞(HSCs)另一種內(nèi)源性干細胞療法是使用粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，一種作用于HSCs的生長因子。G-CSF是一種調(diào)節(jié)原始中性粒細胞增殖和分化的糖蛋白。在大鼠腦缺血模型中，G-CSF通過促進內(nèi)源性神經(jīng)細胞生成發(fā)揮神經(jīng)保護作用和神經(jīng)再生的作用，從而減小缺血面積，改善行為，促進感覺運動功能恢復〔8〕。但G-CSF對HSCs的作用是否適用于人類尚不清楚。事實上，受缺血環(huán)境的影響，內(nèi)源性HSCs存活增殖和分化的可能性很小。因此，通過內(nèi)源性干細胞難以完成缺血后腦組織損傷修復。

2外源性干細胞移植

2.1ESCs具有無限制的自我復制和多潛在的多種分化能力，來源于胚泡早期的囊胚內(nèi)細胞群，具有在特殊條件下分化成機體NSCs多種干細胞的潛能，使得ESCs成為進行細胞移植最為理想的細胞來源〔9,10〕。機體內(nèi)ESCs首先由Evans等〔11〕從小鼠囊胚分離獲得,而體外ESCs則由Thomson等〔12〕從冷凍的體外受精多余囊胚中分離獲得。研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)育和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均存在著NSCs〔13〕，目前通過采用ESCs移植的動物的大量實驗顯示ESCs源性的神經(jīng)元細胞移植入動物后，可以和動物的大腦吻合在一起〔14〕，這為臨床上腦缺血的細胞替代治療提供了一種理想的細胞。目前利用ESCs誘導分化NSCs較公認的方法是：利用堿性成纖維細胞生長因子譜系選擇法。其中堿性成纖維細胞生長因子是早期神經(jīng)前體細胞生存、增殖的重要因子，這一方法由Okabe等〔15〕所建立，通過該誘導方法得到的神經(jīng)元細胞，傾向于中腦、后腦部位的神經(jīng)元。雖然取得了很大的突破，但是ESCs在臨床上應用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病還是存在很大問題，如安全性、細胞系在體外的保存、移植后排斥反應、致畸性及倫理、法律問題〔5〕，上述情況均限制了ESCs移植在腦缺血治療方面的發(fā)展。

2.2NSCs外源性的NSCs多來源于胚胎或胎兒。關(guān)于動物模型的研究表明移植后的NSCs可以生存、增殖、分化為神經(jīng)細胞，并移行至缺血區(qū)域發(fā)揮神經(jīng)保護作用〔16〕。而且外源性NSCs在促進缺血性腦卒中患者功能恢復的同時不會引起腫瘤形成〔17〕。人NSCs可從嬰兒紋狀體和大腦皮質(zhì)中分離而來。將人NSCs植入腦缺血的大鼠腦內(nèi)，NSCs可移行至缺血區(qū)域，增殖分化為神經(jīng)元，并改善感覺運動功能〔17〕。有人研究發(fā)現(xiàn)將NSCs移植入腦缺血大鼠腦內(nèi)，能明顯修復缺血性腦損傷。然而，存活并分化為神經(jīng)元的NSCs很少，這些細胞要么死亡要么停止分化〔18〕。NSCs的另一個缺點是從患者體內(nèi)分離出的NSCs在臨床應用方面不具可行性。由于人NSCs的神經(jīng)營養(yǎng)作用及其較小的致腫瘤生成的風險，在過去的10年中它被廣泛應用于臨床前期腦缺血的研究。最近一個由英國公司發(fā)起的臨床試驗，結(jié)果顯示，所有進行移植的患者均未發(fā)生移植相關(guān)不良反應。臨床試驗發(fā)現(xiàn)患者的感覺運動功能在移植人NSCs6～12w后有所改善〔19〕，這表明對缺血性腦卒中患者進行NSCs移植是安全可行的。

2.3間充質(zhì)干細胞(MSCs)MSCs具有分化為神經(jīng)細胞包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的能力。關(guān)于動物腦缺血模型的研究表明MSCs移植能顯著促進神經(jīng)功能恢復。這種功能恢復主要是由于這些細胞可以分泌大量的細胞因子和生長因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，參與血管生成，愈合及組織修復過程〔20〕。人類MSCs可來源于成人骨髓、外周血、臍帶血及脂肪組織，它們可以分化為多種組織如骨、軟骨及脂肪組織等。骨髓MSCs能在腦缺血大鼠體內(nèi)通過下調(diào)細胞凋亡蛋白酶3基因的表達，從而抑制腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡。Honmou等〔21〕用自體人MSCs移植第一次評估了干細胞治療缺血性腦卒中的可行性與安全性。對這些患者5年的隨訪并沒有發(fā)現(xiàn)不良反應，但功能恢復也不是很明顯。人MSCs可以對灰質(zhì)或白質(zhì)或兩者都產(chǎn)生顯著作用〔22〕，MRI檢查顯示腦梗死面積在移植后1w減少了20%。臨床研究表明hMSCs能促進腦缺血患者功能恢復，而且沒有副反應。由于rMSCs能從自體器官獲得，因而移植后無需進行免疫抑制治療，這是其主要優(yōu)點。人MSCs不會引起倫理方面的爭議。MSCs易獲得和增殖，并能定向遷移至受損腦組織，分泌細胞因子和生長因子，調(diào)節(jié)炎性反應〔23〕。

2.4HSCs(CD34+) 另一種可用于移植的PS為HSCs。同樣，有大量將HSCs移植用于腦缺血患者治療的研究。臨床前研究已經(jīng)表明HSCs移植對腦缺血大鼠具有明顯的作用。其中一些研究已經(jīng)證實在大鼠腦缺血后48 h移植HSCs(CD34+)，大鼠腦缺血半暗帶區(qū)血管生成增加，隨后神經(jīng)再生增加。這種血管再生能調(diào)節(jié)腦缺血后神經(jīng)重塑和神經(jīng)再生〔24〕。研究表明，在腦缺血后1w的大鼠顱內(nèi)直接移植HSCs(CD34+)能提高大鼠神經(jīng)和血管再生。這些移植的細胞還能夠分化為神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞。人臍帶血可以是HSCs的來源，但實際能獲得的HSCs很少。骨髓為自體HSCs移植提供了最佳選擇，盡管獲取過程比較痛苦〔25〕。目前，HSCs移植已用于臨床實驗如腦缺血的治療，腦缺血的實驗模型已經(jīng)表明其具有提高神經(jīng)保護和再生的作用〔26〕。人HSCs在維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面具有重要作用。HSCs的優(yōu)點在于它適用于自體細胞移植也適用于同種異體移植，而且也不會引起倫理方面的問題。缺點是其與從骨髓中獲得的細胞數(shù)量和分化的一致性有關(guān)，尤其對于老年患者。不同來源的HSCs(CD34+)移植的安全性與可行性仍處于臨床試驗當中。

2.5骨髓單核細胞(BMMNCs)BMMNCs包括間充質(zhì)和HSCs。它們易于從骨髓獲得并且適用于自體及同種異體移植。在腦缺血動物模型中BMMNCs被發(fā)現(xiàn)可以改善神經(jīng)功能缺陷并減小腦缺血面積〔27〕。BMMNCs的優(yōu)點是其易于從骨髓獲得，這使其更適用于臨床應用。很多臨床實驗表明BMMBCs已經(jīng)應用于慢性腦缺血的病人〔28〕。經(jīng)過6個月的隨訪，并沒有發(fā)現(xiàn)與治療有關(guān)的不良反應。所有的患者在移植后2h都可以發(fā)現(xiàn)細胞遷移。

3腦缺血的干細胞療法(SCT)

3.1SCT的時間選擇干細胞移植治療缺血性腦卒中的最佳移植時間取決于治療目的。如果治療目標是獲得神經(jīng)保護作用，則急性期移植是可取的。如果治療目標是為了促進內(nèi)源修復和抑制神經(jīng)細胞凋亡，則急性或亞急性治療是必要的。動物實驗研究表明，在腦缺血后24h和72h進行BMMNCs移植，神經(jīng)功能得到顯著改善;而腦缺血后7d后進行注射則沒有明顯效果〔29〕。目前，最佳治療時間尚需進一步研究。

3.2SCT的劑量大劑量的干細胞可能會增加潛在風險，如增加腫瘤形成和動脈內(nèi)注射形成血栓的風險等。因此，臨床前研究仍須對移植細胞數(shù)量相關(guān)毒性進行評估。

3.3SCT的移植途徑在臨床研究和臨床前實驗研究中有幾個移植途徑。立體定向顱內(nèi)移植能將干細胞直接注入受損區(qū)域，這一路徑效果更好。但此路徑為有創(chuàng)性操作，并且可能破壞鄰近腦組織。另一方面，動脈內(nèi)注射可能導致很高的死亡率〔30〕。靜脈內(nèi)注射最簡單最安全，為非侵入性過程，但可能使干細胞向非耙器官聚集，如肺、肝及脾等，使得腦內(nèi)缺血區(qū)干細胞不足〔31〕。移植途徑必須考慮有效性與安全性的問題。目前，移植的最佳路徑尚未確定。

3.4細胞追蹤非侵入性的影像學手段對于評估缺血區(qū)域非常重要。追蹤干細胞并監(jiān)測干細胞的存活、遷移及對大腦功能的影響。在目前的臨床前期研究中，其中一種追蹤方法是應用超順磁氧化鐵顆粒(SPIO)標記細胞的方法。此外，磁共振成像(MRI)、生物發(fā)光成像(BLI)、PET、SPECT也能用于對體內(nèi)移植的干細胞進行追蹤。最近一項研究證實PET能用于測量內(nèi)源性NSCs在體內(nèi)的活化情況，尤其是腦缺血后SVZ區(qū)的情況。然而，如果干細胞與標志物發(fā)生分離，追蹤則會失敗或是導致追蹤信號極度減弱。另外，如果干細胞死亡或被巨噬細胞吞噬，獲得的信號就會具有誤導性。一些納米粒子如PVBM涂層γ-Fe2O3的納米顆粒和熒光量子點已經(jīng)被證實沒有細胞毒性，并且干細胞標記在動物模型中很有效。納米粒子為干細胞移植研究帶來了光明的前景，尤其對于體內(nèi)細胞追蹤，這對干細胞治療研究的幾個障礙產(chǎn)生了重要影響。

4小結(jié)

對大鼠腦缺血模型的研究使腦缺血病人的干細胞移植治療充滿前景。這一治療通過調(diào)節(jié)多種機制發(fā)揮作用，可能涉及新的神經(jīng)通路形成，抑制細胞凋亡和炎癥反應，促進血管和神經(jīng)再生，這與內(nèi)源性修復一致。目前，大量臨床試驗已經(jīng)證實了不同途徑干細胞療法的有效性、安全性和可行性。然而何種來源的干細胞(hNSCs、hMSCs、HSCs等)最適用于治療缺血性腦卒中尚不清楚。此外，在動物模型中干細胞移植后的生物學行為改變不能完全反映這些細胞在患者體內(nèi)是如何活動的。而且動物模型不能完全模擬腦缺血患者各方面的病理情況?？傊杉毎浦驳呐R床應用還面對諸多挑戰(zhàn)，仍需進一步研究。但無疑，干細胞移植將為未來治療腦缺血提供新的方法。

5參考文獻

1中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2010〔J〕.中國醫(yī)學前沿雜志(電子版)，2010;2(4):50-69.

2MontiM,PerottiC,DelFC,et al.Stemcells:sourcesandtherapies〔J〕.BiolRes,2012;45(3):207-14.

3JiangM,LvL,JiH,et al.Inductionofpluripotentstemcellstransplantationtherapyforischemicstroke〔J〕.MolCellBiochem,2011;354(1-2):67-75.

4KawaiH,YamashitaT,OhtaY,et al.Tridermaltumorigenesisofinducedpluripotentstemcellstransplantedinischemicbrain〔J〕.JCerebBloodFlowMetab,2010;30(8):1487-93.

5SeminatoreC,PolentesJ,EllmanD,et al.Thepostischemicenvironmentdifferentiallyimpactsteratomaortumorformationaftertransplantationofhumanembryonicstemcell-derivedneuralprogenitors〔J〕.Stroke,2010;41(1):153-9.

6HouSW,WangYQ,XuM,et al.Functionalintegrationofnewlygeneratedneuronsintostriatumaftercerebralischemiaintheadultratbrain〔J〕.Stroke,2008;39(10):2837-44.

7KernieSG,ParentJM.Forebrainneurogenesisafterfocalischemicandtraumaticbraininjury〔J〕.NeurobiolDis,2010;37(2):267-74.

8Popa-WagnerA,StockerK,BalseanuAT,et al.Effectsofgranulocyte-colonystimulatingfactorafterstrokeinagedrats〔J〕.Stroke,2010;41(5):1027-31.

9YaoS,ChenS,ClarkJ,et al.Long-termself-renewalanddirecteddifferentiationofhumanembryonicstemcellsinchemicallydefinedconditions〔J〕.ProcNatlAcadSciUSA,2006;103(18):6907-12.

10TrounsonA.Theproductionanddirecteddifferentiationofhumanembryonicstemcells〔J〕.EndocrRev,2006;27(2):208-19.

11EvansMJ,KaufmanMH.Establishmentincultureofpluripotentialcellsfrommouseembryos〔J〕.Nature,1981;292(5819):154-6.

12ThomsonJA,Itskovitz-EldorJ,ShapiroSS,et al.Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts〔J〕.Science,1998;282(5391):1145-7.

13BremnesRM,VeveR,GabrielsonE,et al.High-throughputtissuemicroarrayanalysisusedtoevaluatebiologyandprognosticsignificanceoftheE-cadherinpathwayinnon-small-celllungcancer〔J〕.JClinOncol，2002;20(10):2417-28.

14CarpenterMK,CuiX,HuZY,et al.Invitroexpansionofamultipotentpopulationofhumanneuralprogenitorcells〔J〕.ExpNeurol,1999;158(2):265-78.

15OkabeS,Forsberg-NilssonK,SpiroAC,et al.Developmentofneuronalprecursorcellsandfunctionalpostmitoticneuronsfromembryonicstemcellsinvitro〔J〕.MechDev,1996;59(1):89-102.

16BacigaluppiM,PluchinoS,Peruzzotti-JamettiL,et al.Delayedpost-ischaemicneuroprotectionfollowingsystemicneuralstemcelltransplantationinvolvesmultiplemechanisms〔J〕.Brain,2009;132(8):2239-51.

17DaadiMM,MaagAL,SteinbergGK.Adherentself-renewablehumanembryonicstemcell-derivedneuralstemcellline:functionalengraftmentinexperimentalstrokemodel〔J〕.PLoSOne,2008;3(2):e1644.

18OhabJJ,FlemingS,BleschA,et al.Aneurovascularnicheforneurogenesisafterstroke〔J〕.JNeurosci,2006;26(50):13007-16.

19MackGS.Reneuronandstemcellsgetgreenlightforneuralstemcelltrials〔J〕.NatBiotechnol,2011;29(2):95-7.

20ChenN,KamathS,NewcombJ,et al.Trophicfactorinductionofhumanumbilicalcordbloodcellsinvitroandinvivo〔J〕.JNeuralEng,2007;4(2):130-45.

21HonmouO,OnoderaR,SasakiM,et al.Mesenchymalstemcells:therapeuticoutlookforstroke〔J〕.TrendsMolMed,2012;18(5):292-7.

22HonmouO,HoukinK,MatsunagaT,et al.Intravenousadministrationofautoserum-expandedautologousmesenchymalstemcellsinstroke〔J〕.Brain,2011;134(6):1790-807.

23LiuR,ZhangZ,LuZ,et al.Humanumbilicalcordstemcellsameliorateexperimentalautoimmuneencephalomyelitisbyregulatingimmunoinflammationandremyelination〔J〕.StemCellsDev,2013;22(7):1053-62.

24ShyuWC,LinSZ,ChiangMF,et al.Intracerebralperipheralbloodstemcell(CD34+)implantation induces neuroplasticity by enhancing beta1 integrin-mediated angiogenesis in chronic stroke rats〔J〕.J Neurosci,2006;26(13):3444-53.

25NerviB,LinkDC,DiPersioJF.Cytokinesandhematopoieticstemcellmobilization〔J〕.JCellBiochem,2006;99(3):690-705.

26BoyS,SauerbruchS,KraemerM,et al.MobilisationofhematopoieticCD34+precursor cells in patients with acute stroke is safe-results of an open-labeled non randomized phase Ⅰ/Ⅱ trial〔J〕.PLoS One,2011;6(8):e23099.

27Giraldi-GuimardesA,Rezende-LimaM,BrunoFP,et al.Treatmentwithbonemarrowmononuclearcellsinducesfunctionalrecoveryanddecreasesneurodegenerationaftersensorimotorcorticalischemiainrats〔J〕.BrainRes,2009;1266:108-20.

28FriedrichMA,MartinsMP,AraujoMD,et al.Intra-arterialinfusionofautologousbonemarrowmononuclearcellsinpatientswithmoderatetoseveremiddlecerebralarteryacuteischemicstroke〔J〕.CellTransplant,2012;21(1):S13-21.

29YangB,StrongR,SharmaS,et al.Therapeutictimewindowanddoseresponseofautologousbonemarrowmononuclearcellsforischemicstroke〔J〕.JNeurosciRes,2011;89(6):833-9.

30LiL,JiangQ,DingG,et al.Effectsofadministrationrouteonmigrationanddistributionofneuralprogenitorcellstransplantedintoratswithfocalcerebralischemia,anMRIstudy〔J〕.JCerebBloodFlowMetab,2010;30(3):653-62.

31BlissT,GuzmanR,DaadiM,et al.Celltransplantationtherapyforstroke〔J〕.Stroke,2007;38(suppl2):817-26.

〔2015-04-25修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)