豬圓環(huán)病毒分子生物學診斷技術及基因工程疫苗的研究進展

李天芝，于新友，沈志強，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬圓環(huán)病毒分子生物學診斷技術及基因工程疫苗的研究進展

李天芝1，于新友1，沈志強1，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

文章論述了豬圓環(huán)病毒分子生物學診斷方法，包括常規(guī)PCR 方法、套式PCR方法、多重PCR方法、PCRRFLP方法、熒光定量PCR方法、環(huán)介導等溫擴增技術等，并就其基因工程疫苗方面的研究進行了著重闡述。

豬圓環(huán)病毒；分子生物學診斷；基因工程疫苗

豬圓環(huán)病毒(PCV)是圓環(huán)病毒科、動物圓環(huán)病毒屬的成員。PCV可以分為PCV1和PCV2兩種血清型。PCV1無致病性。PCV2具有致病性，該病主要以進行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征，可引起斷奶豬和育肥豬生長緩慢、呼吸急迫、消瘦、貧血、出現(xiàn)黃疸現(xiàn)象，剖檢后發(fā)現(xiàn)有淋巴結腫大、肝硬變、多灶性黏液性氣管炎、間質性肺炎和腎炎，給養(yǎng)豬業(yè)造相當嚴重的經(jīng)濟損失。1991年，在加拿大首次暴發(fā)該病，隨后，世界各國家和地區(qū)都有該病的報道，并在患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)等病豬體內分離到PCV2，并證明PCV2與這些嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的疾病密切相關。目前該病毒引起了國內外獸醫(yī)界的廣泛關注。

1 分子生物學診斷

1.1 常規(guī)PCR 方法

PCR方法是根據(jù)目的片段設計引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。蔣成硯等根據(jù)GenBank中PCV2的序列設計1對特異性引物，用PCR方法擴增豬PCV2基因保守區(qū)序列，并對PCR擴增程序進行優(yōu)化，結果表明：該法具有快速、敏感、特異等優(yōu)點，可用于PCV2的檢測和流行病學調查等，178份臨床病料中有83份陽性樣品，陽性率為46.6%。李英等采用針對PCV2 ORF2設計的特異性引物對某豬場出現(xiàn)的PMWS典型癥狀的病豬進行PCR檢測，從病豬的組織樣品中檢測PCV2，從10頭發(fā)病豬的組織樣品中檢測PCV2，結果有7頭呈陽性結果。

1.2 套式PCR方法

套式PCR方法是設計內外2種引物，同時擴增2次，該法能節(jié)省模板，且敏感性較高。王貴平等根據(jù)GenBank登錄PCV2基因全序列，設計2對引物，建立了PCV2的套式PCR檢測方法，對該方法用序列分析、酶切等方法進行了鑒定，同時用該套式PCR方法對華南地區(qū)287個豬場的1 560份樣品進行了檢測，結果，983份為PCV2陽性，陽性率為63%。趙浩軍等根據(jù)Genbank中發(fā)表的PCV2全基因序列，設計2對PCV2特異性引物，建立套式PCR檢測方法。外測引物p1、p2擴增片段長度為647 bp，內測引物p3、p4擴增長度為219 bp。其中用外部引物可擴增DNA含量到10-5mg/mL，并且套式PCR比普通PCR靈敏性還要提高103倍。

1.3 多重PCR方法

多重PCR是一種特殊的PCR技術，它在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或2種以上的病毒DNA，它具有快速、靈敏度高、高效、特異性強等優(yōu)點而廣泛用于臨床的快速診斷。王隆柏等建立豬群常見CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV的5種疾病的的多重PCR診斷方法，該法特異性好，對SIV、JEV、SS2、PEDV核酸的檢測結果為陰性，能檢測到的CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV核酸濃度分別為220、1.6、72、400和370pg。付朋飛等根據(jù)PBoV PCV2基因序列，設計2對引物，通過對擴增條件進行優(yōu)化，建立了能夠同時檢測PBoV和PCV2的雙重PCR方法。該方法可以同時擴增出PBoV的209bp和PCV2的476bp特異性片段，而對偽PRV、PPV、沙門氏菌、大腸埃希氏菌DNA模板擴增結果均為陰性，對PBoV和PCV2的最低檢出量均為100拷貝/μL。單重PCR與雙重PCR檢測符合率為100%。

1.4 PCR-RFLP方法

PCR-RFLP方法通過設計保守引物，PCR擴增目的基因序列片段，然后用限制性內切酶酶切，通過觀察其酶切片段差異即可鑒定不同種或不同基因型。Fenaux等先以PCR快速而有效地擴增微量的豬圓環(huán)病毒DNA，然后再利用RFLP區(qū)分PCV1和PCV2，以此來進行豬圓環(huán)病毒的檢測和定型，他們根據(jù)PCV1和PCV2的243 bp片段，利用僅在PCV2上有的限制性酶切片段位點NcoI來鑒定PCV1和PCV2。PCV2的PCR產(chǎn)物可被NcoI切成168bp和750 bp的兩個片段，而在PCV1的PCR產(chǎn)物上則無NcoI的位點，所以不能被NcoI切割，這樣就可以直接區(qū)分PCV1和PCV2了。王新等用PCR-RFLP方法，對PK-15細胞，IBRS-2細胞以及疑似PMWS、豬皮炎與腎病綜合征的病變組織進行了PCV2檢測以及血清型的鑒定，結果顯示，IBRS-2細胞和1份PMWS病變組織中檢測出PCV1基因片段，1份PMWS病變組織和1份PDNS病變組織檢測出PCV2基因片段。

1.5 熒光定量PCR方法

熒光定量PCR技術是指采用SYBR GreenⅠ熒光染料或熒光探針通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來測定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離PCR產(chǎn)物，即能準確定量起始模板數(shù)。董林等建立了檢測PCV2的特異性熒光定量PCR方法，該法Ct值與標準品模板在3.21×100～4.16×108拷貝/μL范圍內呈良好的線性關系，相關系數(shù)為0.9988，斜率為-3.286。該方法與PCV1、PRV、PRRSV、PPV、CSFV、大腸桿菌基因組均無交叉反應，敏感性為3.21×100拷貝/μL，比常規(guī)PCR高1 000倍，批間和皮內重復試驗變異系數(shù)均小于3.00%。對臨床采集PCV2疑似陽性病料檢測結果表明，所建立的熒光定量PCR陽性檢測率為58.94%，顯著高于普通PCR檢測率。李鵬等根據(jù)PCV2 ORF1設計1對特異性引物，建立了SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，該法靈敏度可達10-100拷貝/μL，比常規(guī)PCR檢測方法靈敏度高10倍，而與PRRSV、PRV、CSFV、和PPV沒有交叉反應，與常規(guī)PCR相比，該法具有較高的靈敏度和特異性。

1.6 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)是在等溫條件進行擴增反應?；虻臄U增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴增效率和特異性高，可在15～60 min擴增109～1010倍，可只通過擴增產(chǎn)物的有、無來判別。申世川等建立了基于ORF2基因的PCV2 LAMP檢測方法，在BstDNA聚合酶的作用下對靶序列進行等溫核酸擴增。所建立方法在61 ℃反應1 h能夠成功的檢測出PCV2基因組DNA，結果可經(jīng)電泳檢測及肉眼觀察；敏感性和特異性試驗表明，檢測敏感度可以達到0.5 pg的DNA分子，所建立LAMP方法的陽性檢出率與國標PCR的陽性檢出率符合度為100%。楊澤曉等建立了快速檢測PCV2的LAMP方法，在64 ℃45 min條件下可擴增出大于1 345 bp的特異性梯狀DNA條帶，檢測限度可達10 copies/μL，用它對PCV1、PPV、PRV、PRRSV和CSFV的核酸進行擴增，但結果均為陰性。

2 基因工程疫苗

2.1 亞單位疫苗

只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激機體產(chǎn)生特應性免疫應答的一類疫苗，稱為亞單位疫苗。付玉潔等為評價豬圓環(huán)病毒(PCV)2a/2b兩種基因型病毒株及其重組Cap蛋白(rCap)之間的交互免疫，采用重組桿狀病毒表達的2種Cap蛋白(PCV2a-rCap和PCV2b-rCap)亞單位疫苗。免疫小鼠后進行攻毒，結果，以PCV2a和PCV2b各為指示病毒對病毒抗血清和rCap蛋白抗血清進行交叉中和試驗，同型病毒株與同型血清的中和抗體效價均高于異型病毒株。病理觀察顯示，免疫鼠均未見明顯病理變化，攻毒對照鼠肺臟出現(xiàn)一定程度的病理損傷。劉丹等以重組桿狀病毒表達的重組PCV2-Cap蛋白制備亞單位疫苗，免疫BALB/c鼠測定其抗體、中和抗體。結果表明，該蛋白亞單位疫苗能夠提供良好的免疫保護效果，能夠有效誘導小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫應答。

2.2 核酸疫苗

構建含有外源抗原基因的重組質粒，免疫動物后，表達的特異性抗原蛋白通過與MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類抗原分子結合，刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應答，該類疫苗稱為核酸疫苗，又名DNA疫苗。史小紅等將重組真核表達質粒pcDNAORF1-ORF2免疫小鼠，2周后加強免疫，同時設置pcDNA-ORF1、pcDNAORF2、pcDNA3.1-(+)、PCV2全毒疫苗和PBS對照。結果表明，該重組質粒誘導產(chǎn)生PCV2抗體水平與其他試驗組相比差異顯著。閆若潛等將豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）ORF2/豬白介素-2(PoIL-2)嵌合重組表達質粒(rpcDNA3.1/PCV2-1inker-PoIL-2)免疫10日齡健康仔豬，結果發(fā)現(xiàn)重組質粒對豬體的免疫和免疫保護效果顯著。

2.3 活載體疫苗

采用弱毒或無毒病原微生物作為表達載體，對其導入外源抗原基因，制成疫苗后，接種動物，誘導機休產(chǎn)生特異性免疫應答反應，這類新型疫苗稱為活載體疫苗。宮婷等構建了表達豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白重組復制缺陷型人5型腺病毒，對重組腺病毒的分子生物學鑒定和在小鼠上的初步免疫試驗結果表明，重組腺病毒可介導Cap蛋白在真核細胞中的表達，并且表達的靶蛋白具有較好的免疫原性，為進一步將其開發(fā)成新型PCV2疫苗奠定了基礎。王子龍等利用NDV LaSota弱毒疫苗株為活病毒載體，通過反向遺傳操作系統(tǒng)構建出表達PCV2Cap的重組病毒(rLa-PCV2/ Cap)，以及表達刪除核定位信號(NLS)的Cap(CapΔ41)的重組病毒(rLa-PCV2/CapΔ41)，并對外源蛋白的表達效果進行了檢測，為研究新型PCV2疫苗奠定基礎。鈔安軍等將PCV2ORF2基因插入到PRV通用載體pG中，成功構建了重組病毒PGO，并用該重組病毒免疫6周齡雄性小鼠并檢測分析了PGO的免疫原性，結果表明，該重組病毒能有效抵抗PCV2強毒攻擊。

3 前景展望

隨著分子生物學的不斷發(fā)展，目前已經(jīng)建立了PCV2多種分子生物學檢測方法，這些檢測方法各有利弊，如常規(guī)PCR方法具有特異性強、敏感性高、檢出率高等特點，但不能準確的定量、容易污染，且敏感性有限。熒光定量PCR儀器和探針的合成價格昂貴，檢測成本比較高，LAMP方法靈敏度高導致假陽性。最好幾種檢測方法結合起來，綜合判斷，才能使檢測結果更加準確可靠。近年來，PCV2新型疫苗研制，已經(jīng)取得了很大的進展，但由于種種原因近停留在實驗室階段，并沒有大規(guī)模推廣應用實際生產(chǎn)中，相信在不久的將來著病毒分子生物學的發(fā)展及對豬圓環(huán)病毒蛋白功能本質研究的深入，必將研制出安全、高效、廉價、易于保存和運輸?shù)男滦突蚬こ桃呙纭?/p>

略。

2015-06-13）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-06-011-14)，山東省自然科學基金項目(ZR2013CQ006)

李天芝(1985-)，女，漢族，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病研究。