安丘市雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

張 強(qiáng) 張錄娟

（山東省安丘市畜牧局,山東安丘 262100）

安丘市雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

張 強(qiáng) 張錄娟

（山東省安丘市畜牧局,山東安丘 262100）

該試驗(yàn)從安丘市部分雞場無菌采集疑似大腸桿菌病的37只病死雞的心血和肝臟，進(jìn)行病原菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果共分離出大腸桿菌21株，其中，有16株對小鼠具有致病性。用臨床上常用的22種抗生素紙片對分離出的致病性大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離的雞源大腸桿菌均對菌必治（頭孢曲松）敏感，對丁胺卡那霉素（阿米卡星）、先鋒噻肟、氨曲南和復(fù)達(dá)欣（頭孢他啶）4種藥物也具有較高的敏感性，其敏感率分別為87.5%、87.5%、81.3%和75%，對環(huán)丙沙星、克拉霉素、萬古霉素和紅霉素完全耐藥。本試驗(yàn)結(jié)果為山東安丘地區(qū)雞場合理用藥防控大腸桿菌病提供了參考。

雞 大腸桿菌 分離鑒定 藥敏試驗(yàn)

雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌感染所引起的一種傳染病，不同品種和日齡的雞均可發(fā)病，但肉用仔雞最易感。在臨床上雞大腸桿菌病可表現(xiàn)為精神沉郁、消瘦、腹瀉和呼吸困難等，病理剖檢表現(xiàn)為心包炎、肝周炎、氣囊炎、臍炎、關(guān)節(jié)炎等，發(fā)病率高，死亡率也高。此外，大腸桿菌可與其他呼吸道疾病，如慢性呼吸道病混合感染而使雞的死亡率升高。在引起雞發(fā)病的細(xì)菌性病原中，大腸桿菌病占據(jù)了首位[1]。由于大腸桿菌血清型眾多，不同血清型大腸桿菌之間無交叉保護(hù)性，因此，主要通過抗菌藥物來防治大腸桿菌病。然而，抗生素的使用不當(dāng)會導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。隨著近年來我國養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，以及抗菌藥物在雞大腸桿菌臨床治療中應(yīng)用率的逐漸提高，大腸桿菌的耐藥性問題也逐漸引起了人們的關(guān)注。為了更好地了解安丘地區(qū)引起雞發(fā)病的致病性大腸桿菌的藥物敏感性，以指導(dǎo)該地區(qū)養(yǎng)雞中合理用藥，本試驗(yàn)對臨床上疑似雞大腸桿菌病的病料進(jìn)行了分離鑒定，并進(jìn)行致病性試驗(yàn)和藥物敏感試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

疑似大腸桿菌感染的37份病料來自于安丘市13個不同規(guī)模的養(yǎng)雞場，無菌采取有典型病變的心血和肝臟組織以備細(xì)菌的分離和鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基及藥敏紙片

牛肉膏、蛋白胨、普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂及各種微量發(fā)酵管，藥敏紙片包括頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢呋辛、萬古霉素、妥布霉素、鏈霉素、呋喃妥因、丁胺卡那霉素（阿米卡星）、慶大霉素、克拉霉素、紅霉素、左氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、先鋒噻肟、氟嗪酸（氧氟沙星）、菌必治（頭孢曲松）、氨曲南、氟哌酸（諾氟沙星）、利福平、復(fù)方新諾明和復(fù)達(dá)欣（頭孢他啶），購自杭州天和微生藥試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物

昆明系健康小白鼠66只，體重為20～23 g／只，購自山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鏡檢

取病死雞的肝和心血接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24 h。然后挑取細(xì)菌在營養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂平板上劃線接種，37℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的培養(yǎng)特性，并進(jìn)行涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察其形態(tài)。再鉤取單個典型菌落接種鮮血瓊脂斜面37℃培養(yǎng)24 h，4℃保存。

1.2.2 致病性試驗(yàn)

將分離菌接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃震蕩培養(yǎng)18 h。每株菌接種3只小白鼠，于小鼠腿部肌肉注射肉湯純培養(yǎng)物0.2 ml/只，對照組小白鼠注射滅菌肉湯 0.2 ml/只。觀察并記錄小白鼠發(fā)病及死亡情況，對發(fā)病死亡的小白鼠進(jìn)行剖解，觀察病變，取其病料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2.3 生化試驗(yàn)

取分離菌肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖的發(fā)酵試驗(yàn)，同時進(jìn)行吲哚、MR、VP、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)和硫化氫試驗(yàn)。將細(xì)菌分別接種到相應(yīng)的微量發(fā)酵管中，置37℃培養(yǎng)。糖發(fā)酵試驗(yàn)在24h觀察結(jié)果，其他生化試驗(yàn)在48～72 h內(nèi)觀察結(jié)果[2]。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

無菌條件下取細(xì)菌純培養(yǎng)物密集劃線接種于整個營養(yǎng)瓊脂平板，將藥敏片均勻貼放到平板上，每個平板5片。將平板倒置于37℃培養(yǎng)24 h，觀察藥物的抑菌情況，測定各種藥物抑菌圈的大小[3]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性及鏡檢

從37份病料中共分離出21株細(xì)菌。所分離的細(xì)菌在普通肉湯中均生長良好，均勻混濁，管底有灰白色沉淀，輕搖呈云霧狀；在普通瓊脂平板為灰白色、半透明、表面隆起、光滑圓潤、邊緣整齊的菌落；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長出周圍粉紅色，中心深紅色的菌落。染色顯示，分離菌為兩端鈍圓、中等大小、革蘭氏陰性小桿菌，多呈單個散在排列。

2.2 生化試驗(yàn)

所分離的細(xì)菌均能能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；能發(fā)酵蔗糖，不產(chǎn)氣；吲哚和MR試驗(yàn)陽性；VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)和尿素分解試驗(yàn)為陰性。結(jié)合培養(yǎng)特性及鏡檢結(jié)果，均鑒定為大腸桿菌。

2.3 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，16株雞源致病性大腸桿菌均對菌必治（頭孢曲松）敏感，對丁胺卡那霉素（阿米卡星）、先鋒噻肟、氨曲南和復(fù)達(dá)欣（頭孢他啶）4種藥物也具有較高的敏感性，分別為87.5%、87.5%、81.3%和75%。對呋喃妥因、慶大霉素、頭孢呋辛、鏈霉素、氟哌酸（諾氟沙星）、利福平等表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，而對環(huán)丙沙星、克拉霉素、萬古霉素和紅霉素完全耐藥（見表1）。

3 分析討論

3.1 大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性的原因

大腸桿菌是動物體內(nèi)的常在細(xì)菌，是一種重要的條件性致病菌，凡能引起機(jī)體抵抗力降低的各種因素，均可誘發(fā)大腸桿菌病?？股睾突瘜W(xué)藥物在防控大腸桿菌病中發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用。由于在生產(chǎn)中不合理的使用藥物來預(yù)防和治療大腸桿菌病，使得大腸桿菌耐藥性日益嚴(yán)重。臨床上不合理用藥包括：（1）不能在正確診斷疾病的基礎(chǔ)上用藥；（2）不進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以選擇敏感的抗菌藥物；（3）不注意藥物的劑量、療程和用藥時機(jī)；（4）過早使用二線藥物預(yù)防；（5）不注意穿梭用藥和輪換用藥，長期傾向于使用特定的一種或幾種藥物[3]。

3.2 安丘地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥情況

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，安丘地區(qū)雞源大腸桿菌對第三代頭孢類抗生素菌必治（頭孢曲松）、先鋒噻肟（頭孢噻肟）和復(fù)達(dá)欣（頭孢他啶）具有很好的敏感性，其中，對菌必治（頭孢曲松）的敏感率達(dá)100%，因此，在臨床病例治療中可以適當(dāng)選用。然而分離菌對第一、二代頭孢類抗生素頭孢唑啉和頭孢呋辛表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，這可能與這兩類抗生素在臨床預(yù)防和治療中廣泛應(yīng)用直接相關(guān)。此外，丁胺卡那霉素（阿米卡星）對雞源致病性大腸桿菌也具有良好的抑殺效果。本研究還發(fā)現(xiàn)，安丘地區(qū)雞源大腸桿菌對氨曲南的敏感性亦達(dá)81.3%，這可能與該藥在獸醫(yī)領(lǐng)域尚未廣泛使用有關(guān)。本試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果表明，所分離的雞源致病性大腸桿菌對喹諾酮類抗菌藥物環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氟沙星均表現(xiàn)出了極高的耐藥性，這可能是因?yàn)榧?xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制一致，細(xì)菌對常用藥物環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐受性后，必將引起對同類其他藥物的耐受性[4]。利福平是治療結(jié)核病的重要藥物之一，由于在禽病防控中違規(guī)使用該藥，雞源大腸桿菌對利福平也表現(xiàn)出極高的耐藥率，這與李曉柳等報(bào)道的山東地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性情況相似，然而對其他藥物如卡那霉素、氨曲南的藥敏結(jié)果卻差異較大，這可能與不同區(qū)域及不同養(yǎng)雞場分離的菌株差異有關(guān)。