復(fù)方替米考星口服液有效成分含量的測(cè)定方法研究

洪 濤杜航空歐陽(yáng)五慶

（1.陜西冠嘉高科生物技術(shù)有限公司,陜西西安 710061；2.西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西楊凌 712100）

復(fù)方替米考星口服液有效成分含量的測(cè)定方法研究

洪 濤1杜航空1歐陽(yáng)五慶2*

（1.陜西冠嘉高科生物技術(shù)有限公司,陜西西安 710061；2.西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西楊凌 712100）

復(fù)方替米考星口服液是由替米考星、黃芪多糖、綠原酸及板藍(lán)根多糖精制而成的中西藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、抗菌消炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多重功效。臨床用于畜禽呼吸道疾病的治療，效果較好。為控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者參照有關(guān)文獻(xiàn)，制定了復(fù)方替米考星口服液中各主要成分的含量測(cè)定方法。試驗(yàn)利用紫外-可見分光光度計(jì)，分別建立了獸用高效復(fù)方替米考星口服液（TMS）中替米考星、黃芪多糖和綠原酸含量檢測(cè)的分析方法。結(jié)果顯示：不同批次間獸用高效復(fù)方替米考星口服液（TMS）中替米考星、黃芪多糖和綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線均分別在 5～50 μg·ml-1、5～30 μg·ml-1和5～50 μg·ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均回收率為（99.18±1.89）%、（99.68±2.23）%和（99.23±1.17）%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.91%、2.24%和2.19%；日內(nèi)精密度（RSD）為0.62%、0.65%和0.59%，日間精密度（RSD）為1.32%、1.42%和1.27%，建立的TMS分析方法回收率、重復(fù)性和精密度均滿足要求。本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與藥品

替米考星標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)為K0311109，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；替米考星原粉，批號(hào)為1404001，寧夏泰瑞制藥股份有限公司提供；獸用高效復(fù)方替米考星口服液（TMS）（主要成分為：替米考星、黃芪多糖、綠原酸、板藍(lán)根多糖和螯合劑等），由陜西冠嘉高科生物技術(shù)有限公司中試生產(chǎn)提供，產(chǎn)品批號(hào)為20140508；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)為Z0260611，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

BT125D型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TMS中替米考星含量測(cè)定分析方法的建立

1.2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的替米考星對(duì)照品適量，加磷酸溶液溶解后，制成50 μg·ml-1的溶液，備用；精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1ml約含40μg的溶液，備用；精密稱取無(wú)水葡萄糖（黃芪多糖對(duì)照品）適量，加蒸餾水適當(dāng)稀釋后備用；另量取適量空白口服液（不含藥物的TMS）加適量蒸餾水稀釋后備用；取上述四種對(duì)照品溶液及空白口服液，用紫外－可見分光光度計(jì)在200～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描得知，替米考星的最大吸收波長(zhǎng)為292 nm，黃芪多糖的最大吸收波長(zhǎng)為490nm，綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為324nm，且TMS的所用輔料在該波長(zhǎng)處的紫外吸收對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，因此確定292 nm為測(cè)定替米考星含量的檢測(cè)波長(zhǎng)，490 nm為測(cè)定黃芪多糖含量的檢測(cè)波長(zhǎng)，324 nm為測(cè)定綠原酸含量的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.1.2 對(duì)照品和供試品溶液的配制

精密稱取替米考星對(duì)照品10.45 mg，用磷酸溶液溶解后定容至100 ml，得質(zhì)量濃度為100μg·ml-1的替米考星對(duì)照品溶液，作為替米考星對(duì)照品供試液備用。

精密稱取替米考星原料藥10.76 mg，用磷酸溶液溶解后定容至100ml，得質(zhì)量濃度為100μg·ml-1的替米考星原料供試液。

稱取黃芪多糖原料藥11.11 mg，用蒸餾水定容至100 ml，搖勻，得濃度為100μg·ml-1的黃芪多糖原料藥供試液。

稱取綠原酸原料藥11.23 mg，蒸餾水定容至100 ml，搖勻，得濃度為100μg·ml-1的綠原酸原料藥供試液。

精密量取TMS 1mL置于100 ml容量瓶中用蒸餾水定容，作為TMS供試液。同法制備空白口服液（不含替米考星的TMS）供試液。

1.2.1.3 方法專屬性試驗(yàn)

分別取替米考星對(duì)照品溶液、替米考星原料藥供試液、黃芪多糖原料藥供試液、綠原酸原料藥供試液、TMS供試液和空白口服液供試液，用紫外－可見分光光度計(jì)在200～500 nm范圍內(nèi)對(duì)此6種溶液進(jìn)行掃描。

1.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

稱取對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 ml，分別加蒸餾水定容到50ml，搖勻。在292nm波長(zhǎng)處測(cè)定上述對(duì)照品溶液的吸收度，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（μg·ml-1）為橫坐標(biāo)，紫外光吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.1.5 回收率試驗(yàn)

量取替米考星對(duì)照品貯備液，置10mL容量瓶中，加入適量空白口服液，然后加入蒸餾水定容至刻度，得到濃度分別為15、20、25μg·ml-1的待測(cè)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)3次，將測(cè)定的紫外光吸收度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出實(shí)測(cè)濃度，然后計(jì)算其回收率、平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.1.6 進(jìn)樣重復(fù)性和精密度試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)其中一待檢測(cè)樣品，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。分別配制低、中、高濃度為5、20、35 μg·ml-1的TMS 對(duì)照品待測(cè)液，進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度測(cè)定。日內(nèi)精密度試驗(yàn)于1 d內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定5次，日間精密度試驗(yàn)1 次/d，連續(xù)5 d。

1.2.2 TMS中黃芪多糖含量測(cè)定的方法建立

稱取黃芪多糖對(duì)照品適量，蒸餾水溶解并制成5μg·ml-1的溶液，另分別量取適量空白口服液和TMS，蒸餾水適當(dāng)稀釋后，用紫外－可見分光光度計(jì)在200～500 nm范圍內(nèi)對(duì)此3種溶液進(jìn)行掃描得知，黃芪多糖的最大吸收波長(zhǎng)為490 nm，且制備口服液的輔料在該波長(zhǎng)處的紫外吸收對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，因此確定490 nm為測(cè)定黃芪多糖含量的檢測(cè)波長(zhǎng)。

對(duì)照品和供試品溶液的配制、方法專屬性試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立、回收率試驗(yàn)、進(jìn)樣重復(fù)性和精密度試驗(yàn)同上述“1.2.1”中的（2）、（3）、（4）、（5）和（6）。

1.2.3 TMS中綠原酸含量測(cè)定的方法建立

稱取綠原酸對(duì)照品適量，加50%色譜甲醇溶液10ml溶解，加蒸餾水制成5 μg·mL-1的溶液，另分別量取適量空白口服液和TMS，加50%色譜甲醇溶液10ml，蒸餾水適當(dāng)稀釋后，用紫外－可見分光光度計(jì)在200～500 nm范圍內(nèi)對(duì)此3種溶液進(jìn)行掃描得知，綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為324nm，且制備口服液的輔料在該波長(zhǎng)處的紫外吸收對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，因此確定324nm為測(cè)定綠原酸含量的檢測(cè)波長(zhǎng)。

對(duì)照品和供試品溶液的配制、方法專屬性試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立、回收率試驗(yàn)、進(jìn)樣重復(fù)性和精密度試驗(yàn)同上述“1.2.1”中的（2）、（3）、（4）、（5）和（6）。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMS中藥物含量測(cè)定方法

2.1.1 TMS中藥物含量測(cè)定藥物專屬性考察

根據(jù)替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液、替米考星原料藥、黃芪多糖原料藥和綠原酸原料藥和TMS紫外吸收光譜圖結(jié)果可知，替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液、替米考星原料藥、黃芪多糖原料藥、綠原酸原料藥和TMS分別在292nm、490nm和324nm有最大吸收；且替米考星原料藥的最大吸收波長(zhǎng)基本與標(biāo)準(zhǔn)品溶液一致，說(shuō)明原料藥符合要求；復(fù)方內(nèi)藥物間測(cè)定無(wú)相互干擾。結(jié)果表明，黃芪多糖原料藥和綠原酸原料藥對(duì)替米考星的樣品測(cè)定無(wú)干擾，顯示該方法專屬性好。

對(duì)照品濃度和吸收度值結(jié)果見表5和圖12。通過(guò)線性回歸求得測(cè)定TMPL的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A＝0.0232C+0.1751（r＝0.9994），TMPL在1～30μg·ml-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

TMS中各藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表1、表2、表3和表4。

2.1.3 回收率及精密度測(cè)定試驗(yàn)

試驗(yàn)中，測(cè)TMS中藥物含量方法中，替米考星、黃芪多糖和綠原酸平均回收率為：（99.18±1.89）%、（99.68±2.23）%和（99.23±1.17）%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.91%、2.24%和2.19%；日內(nèi)精密度（RSD）為0.62%、0.65%和0.61%，日間精密度（RSD）為1.32%、1.42%和1.27%。

3 討論

3.1 替米考星、黃芪多糖、綠原酸和板藍(lán)根多糖的聯(lián)合用藥

替米考星為動(dòng)物專用抗生素，具有良好的抗菌活性和藥動(dòng)學(xué)特征，主要用于動(dòng)物肺炎、雞慢性呼吸道病和泌乳動(dòng)物的乳腺炎（郭騰等 2002）。本試驗(yàn)中TMS將替米考星、黃芪多糖、綠原酸和板藍(lán)根多糖進(jìn)行了配伍，發(fā)揮不同作用機(jī)制的互補(bǔ)作用，從而起到更強(qiáng)的抗菌、抗病毒、提高免疫力的效果。為克服替米考星水溶性差、生物利用度低等缺點(diǎn)，分別選用1，2-丙二醇和乙醇為助溶劑，提高了替米考星和綠原酸在水中的溶解度，另一方面螯合劑的使用，增加了藥物溶解穩(wěn)定性，減少了藥物與外相接觸的機(jī)會(huì)，提高制劑的治療效果，依據(jù)聯(lián)合用藥理論，將替米考星、黃芪多糖、綠原酸和板藍(lán)根多糖配伍并制備成獸用高效復(fù)方替米考星口服液制劑。

3.2 獸用高效復(fù)方替米考星口服液含量測(cè)定波長(zhǎng)的確定

本試驗(yàn)利用紫外-可見分光光度計(jì)，在200～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描得知，替米考星的最大吸收波長(zhǎng)為292 nm，黃芪多糖的最大吸收波長(zhǎng)為490nm，綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為324nm，且TMS的所用輔料在該波長(zhǎng)處的紫外吸收對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，因此確定292 nm為測(cè)定替米考星含量的檢測(cè)波長(zhǎng)，490nm為測(cè)定黃芪多糖含量的檢測(cè)波長(zhǎng)，324nm為測(cè)定綠原酸含量的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

獸用高效復(fù)方替米考星口服液為棕黃色澄明、均一溶液，流動(dòng)性良好。結(jié)果顯示，復(fù)方替米考星口服液含量測(cè)定方法重現(xiàn)性和專屬性強(qiáng)，為控制該制劑藥品質(zhì)量提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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表1 不同濃度替米考星溶液的紫外吸收度

表2 不同濃度黃芪多糖溶液的紫外吸收度

表3 不同濃度綠原酸溶液的紫外吸收度

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2013GB2G000475）

洪濤（1982-），女陜西商南人，碩士研究生，從事新獸藥研究。

歐陽(yáng)五慶（1960-），男，陜西鳳翔人，教授，博導(dǎo)。