基于PD-1靶點(diǎn)的免疫診斷和治療策略①

王　芳　付　潔　宋海峰　(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室，北京100850)

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基于PD-1靶點(diǎn)的免疫診斷和治療策略①

王芳付潔宋海峰(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室，北京100850)

①本文為國家“十二五”重大專項(xiàng)(2012ZX09301003-001-007)、國家自然科學(xué)基金(81272701)。

腫瘤免疫治療已成為繼腫瘤手術(shù)、放療和化療同等重要的第四種腫瘤治療模式?；趯δ[瘤生物學(xué)和免疫學(xué)原則的不斷深入研究，提高抗腫瘤細(xì)胞免疫功能、消除腫瘤細(xì)胞對免疫細(xì)胞抑制性因素，已發(fā)展為免疫治療的重要策略。細(xì)胞程序性死亡-1 (Programmed Death 1，PD-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的負(fù)性刺激分子之一，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子大小為55 kD，屬于CD28型家族，作為抑制分子表達(dá)于活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞表面。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)和分泌細(xì)胞程序性死亡配體-1(Programmed Death 1 Ligand，PD-L1)，PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表面的PD-1分子結(jié)合后，會抑制T、B淋巴細(xì)胞的活性，是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫的主要原因之一［1］。因此在腫瘤免疫治療中，基于PD-1為靶點(diǎn)的免疫治療藥物成為研發(fā)的熱點(diǎn)?，F(xiàn)就PD-1/PD-L1通路在免疫調(diào)節(jié)中的作用及其在免疫治療方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　PD-1/PD-L1在免疫調(diào)節(jié)中的作用

1.1 PD-1/PD-L1與細(xì)胞免疫PD-1/PD-L1通路對T、B細(xì)胞免疫應(yīng)答具有重要調(diào)控作用。1992年，Keir等［2］首次發(fā)現(xiàn)PD-1是T細(xì)胞激活、誘導(dǎo)外周耐受和維護(hù)耐受的主要調(diào)節(jié)器。PD-L1作為協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合，通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)單向信號傳送刺激，使T細(xì)胞受體信號途徑的分子如Zap70、磷脂酰肌醇-3激酶等酪氨酸殘基脫磷酸化，導(dǎo)致T細(xì)胞受體的信號傳導(dǎo)減弱，進(jìn)而引發(fā)免疫功能無法正常執(zhí)行［3］。同樣，PD-L1與B細(xì)胞表達(dá)的PD-1分子相互作用，協(xié)同BCR抑制下游信號途徑分子如syk、磷脂酰肌醇-3激酶、磷脂酶-3等酪氨酸殘基磷酸化，從而抑制B細(xì)胞激活［1］。此外，有研究表明，PD-1的敲除或封閉小鼠將引起自身免疫疾病［2］，如自發(fā)狼瘡樣綜合癥、亞急性Ⅰ型糖尿病或擴(kuò)張型心肌?。?］。而PD-L1的缺失小鼠則失去了清除感染性病毒的能力［5］，并且在非造血細(xì)胞中，PD-L1的表達(dá)能抑制免疫介導(dǎo)的組織損傷［6］，這些數(shù)據(jù)提示PD-L1和PD-1的結(jié)合能夠維持外周淋巴細(xì)胞對自身抗原的免疫耐受，該負(fù)性調(diào)節(jié)作用是對自身免疫性疾病發(fā)生的一種自我防護(hù)。

1.2 PD-1/PD-L1與腫瘤免疫調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)對變異細(xì)胞具有監(jiān)視和清除的能力，癌變細(xì)胞表達(dá)的特異性抗原會被宿主T細(xì)胞識別，激活機(jī)體免疫活性抗擊癌細(xì)胞，然而免疫系統(tǒng)很難對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行大量清除。其原因?yàn)樵谀[瘤早期，癌細(xì)胞通過改變其表型逃脫免疫監(jiān)控［8］，在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的PD-L1分子與T細(xì)胞表面的PD-1相結(jié)合，可選擇性抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖和活化，同時降低IL-10、INF-γ、IL-2的表達(dá)和分泌，下調(diào)細(xì)胞免疫功能，誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷性T細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸［9，10］。一些數(shù)據(jù)已證實(shí)PD-L1在腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等患者［11-16］體內(nèi)高表達(dá)，并且高表達(dá)PD-L1的患者預(yù)后差。因此，PD-L1表達(dá)的高低也逐漸成為腫瘤患者的預(yù)后指標(biāo)之一。同時PD-L1的表達(dá)對腫瘤起上調(diào)作用，通常誘導(dǎo)浸潤T細(xì)胞釋放干擾素-c(IFN-c)［17，18］，誘導(dǎo)T細(xì)胞高表達(dá)PD-1。此外，一些細(xì)胞因子或炎癥因子如IFN-γ、IL-4、脂多糖(LPS)等，對腫瘤微環(huán)境PD-L1也具有上調(diào)的功能，從而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，并非所有的腫瘤PD-L1的表達(dá)都具有預(yù)后不良［12，19］。對于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤(MEL)病人，一般研究表明病變腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞要比外周血或癌旁組織中PD-1的表達(dá)高。然而，Ahmadzadeh等［20］的研究顯示，PD-L1+MEL病人比PD-L1－MEL病人的存活率要長。研究者推測腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞可能通過分泌細(xì)胞因子(如IFN-c)發(fā)揮抑制作用，進(jìn)而驅(qū)動了腫瘤PD-L1的表達(dá)。

1.3 PD-1/PD-L1與慢性病毒感染慢性病毒感染的成因主要包括病毒迅速變異導(dǎo)致對機(jī)體的免疫逃避，以及人體內(nèi)的特異性T細(xì)胞出現(xiàn)功能缺失而不能有效清除病毒。而慢性病毒感染導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵機(jī)制是由于PD-1/PD-L1通路對T細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)。周筱英等［21］觀察105例慢性HBV病毒感染病人CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)55例免疫清除的患者比50例免疫耐受患者的CD8+T細(xì)胞表達(dá)量高(t= 18.08，P＜0.01)，但表達(dá)PD-1的CD8+T細(xì)胞少，PD-1 mRNA也在PBMC中表達(dá)低(t=30.89，P＜0.01)，說明PD-1/PD-L1通路在病毒的清除中存在一定的作用。為驗(yàn)證阻斷PD-1/PDL1后免疫系統(tǒng)的變化，Liu等［22］體外抑制了肝炎病毒感染土撥鼠的PD-1/PD-L1通路，發(fā)現(xiàn)HBV特異性T細(xì)胞的功能得到了恢復(fù)，說明PD-1/PD-L1通路在慢性HBV病毒感染中，具有負(fù)性調(diào)控的作用。在HIV感染期間，病人B細(xì)胞和T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)量明顯升高，并且B細(xì)胞和CD4+CD8+T細(xì)胞均無反應(yīng)活性，當(dāng)抗體封閉PD-1或使用RNAi手段干擾下調(diào)抑制性受體后，部分T細(xì)胞、B細(xì)胞恢復(fù)了活化增殖和產(chǎn)生抗HIV特異性抗體的能力［23］。同時為探討不同慢性病毒感染階段封閉PD-1是否具有上述同樣效果，Velu等［24］建立了獼猴感染慢性自身免疫缺陷病毒(SIV)的模型，在早期和晚期慢性感染中，封閉PD-1后，獼猴可快速表達(dá)病毒特異性CD8+T細(xì)胞，并引起記憶性B細(xì)胞增殖和分泌特異性SIV包膜抗體的增加，T細(xì)胞免疫反應(yīng)得到增強(qiáng)，致使血液中SIV病毒載量明顯減少，從而延長了獼猴的壽命。研究說明在感染不同階段，阻斷PD-1受體，均可以達(dá)到一定的治療效果。此外，在Fuller等［25］模擬的獼猴感染HCV模型中有1/3的獼猴在接受PD-1抗體治療后HCV病毒顯著減少，無明顯肝細(xì)胞損害，并且與未進(jìn)行PD-1抗體封閉獼猴相比，對記憶性B細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了以PD-1為靶點(diǎn)的免疫治療的有效性。

1.4生物標(biāo)志物PD-1/PD-L1通路除在免疫治療中具有重要作用外，抗PD-1抗體還可以作為癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物發(fā)揮重要作用。Matsumoto等［26］對52例Ⅰ型自身免疫性肝炎(AIH)、24例肝損傷(DILI)、30例病毒性肝炎(AVH)、11例原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)和62名健康志愿者血清中抗-PD-1抗體進(jìn)行檢測，其含量分別為63%、8%、13%、18%和3%。AIH患者血清中PD-1抗體含量明顯高于其他組，并且Ⅰ型AIH患者血清抗PD-1抗體含量的高低與血清中膽紅素(r=0.31，P=0.030)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)(r= 0.31，P=0.027)。這些數(shù)據(jù)提示抗PD-1抗體將可作為AIH診斷的一個輔助檢測指標(biāo)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一指標(biāo)的可行性，Miyake等［27］檢測71例Ⅰ型AIH患者和37例DILI患者血清中抗PD-1抗體，結(jié)果表明Ⅰ型AIH患者比DILI患者(P＜0.001)抗PD-1抗體水平高，研究充分說明血清中抗PD-1抗體可作為Ⅰ型AIH輔助診斷的有用標(biāo)志物。

2　抗PD-1抗體的研發(fā)進(jìn)展

如上所述，抑制PD-1/PD-L1途徑可以部分恢復(fù)T細(xì)胞和B細(xì)胞的效應(yīng)功能，提高抗腫瘤免疫應(yīng)答，削弱腫瘤細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)，證實(shí)了PD-1為T細(xì)胞的一個典型性抑制受體。此外T細(xì)胞表面還存在其他抑制受體，如(如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原) CTLA-4，Nishimura等［28，29］的小鼠模型證實(shí)CTLA-4是集中參與和預(yù)防自身免疫性疾病發(fā)展的調(diào)節(jié)位點(diǎn)，而PD-1是防止自身組織損傷的慢性感染和炎癥反應(yīng)的位點(diǎn)。隨著近年來對腫瘤免疫逃逸機(jī)制研究的深入，使用單克隆抗體藥物阻斷共刺激分子CTLA-4和PD-1通路，消除腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞的免疫抑制策略具有重要應(yīng)用前景，并且大量抗體藥物在臨床研究中已取得了巨大進(jìn)展［30］?？笴TLA-4單克隆抗體ipilimumab在晚期黑色素瘤的治療中率先取得歷史性突破，在臨床研究中首次改善了晚期黑色素瘤患者的總生存期，并于2011年被FDA批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，同年被EMA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)的晚期黑色素瘤［31］。同樣，抗PD-1抗體藥物也取得了一定的成果，在臨床研究中抗PD-1抗體對多種實(shí)體瘤治療具有良好的療效，并且部分抗PD-1抗體藥物在藥物報批過程中也進(jìn)展順利。

2.1抗PD-1抗體臨床研究進(jìn)展目前有40多例在研的抗PD-1抗體藥物處于臨床研究階段，其中已有兩個抗體藥物率先獲批上市。施貴寶公司(BMS)的BMS-936558(Nivolumab)抗體，在2014年7月于日本獲得上市批準(zhǔn)，是全球首個獲批的抗PD-1抗體藥物;同年9月默沙東公司(Merck)的抗PD-1抗體MK-3475(Lambrolizumab)，也經(jīng)過FDA加速審批通道，成為在美國獲批的首個抗PD-1藥物。另外針對PD-L1靶點(diǎn)的兩個抗體藥物(羅氏和Medimmune公司)也已進(jìn)入到臨床Ⅲ期的研究，預(yù)計(jì)到2017年上市。

Nivolumab是一個全人源的抗PD-1單克隆抗體，該藥在長期治療晚期實(shí)體瘤中具有良好的療效，對304例晚期實(shí)體瘤患者(127例非小細(xì)胞肺癌，107例黑色素瘤，34例腎細(xì)胞癌，19例結(jié)腸癌，17例前列腺癌)進(jìn)行Nivolumab抗體治療，數(shù)據(jù)顯示ORR達(dá)到16%～33%，OS最高達(dá)到50%［32］。Topalian等［33］對Nivolumab在臨床前療效的評價顯示，203例腫瘤患者(給藥方案: 10 mg/Kg，間隔2周，給藥4 次)具有良好療效，非小細(xì)胞肺癌、惡性黑色素瘤、腎細(xì)胞癌患者的有效率分別為14%(14/76)、8% (26/94)、27%(9/33)。現(xiàn)在Nivolumab對膀胱癌、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和其他適應(yīng)癥處于臨床Ⅲ期的研究，其上市針對的主要適應(yīng)癥為黑色素瘤。

Lambrolizumab(MK-3475)是一種人源化IgG4的抗PD-1單克隆抗體。Lambrolizumab臨床Ⅰ期實(shí)驗(yàn)對135例黑色素瘤患者(給藥方案: 10 mg/Kg，間隔2或3周，共6次)具有良好的療效，接受抗體治療后患者的免疫應(yīng)答率為38%～52%，且免疫應(yīng)答可維持11個月之久，并且這135例病人中有過半數(shù)量的病人腫瘤無進(jìn)展期可達(dá)7個月［34］?，F(xiàn)在Lambrolizumab對非小細(xì)胞肺癌處于臨床Ⅲ期的研究，同時lambrolizumab與化療的Ⅱ期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中，其上市的適應(yīng)癥同樣是針對黑色素瘤。

BMS公司的另一個抗體藥物BMS-936559是一種全人源的抗PD-L1單克隆抗體(能夠抑制PD-L1 與PD-1、CD80結(jié)合)，對207例進(jìn)展性癌癥(75例非小細(xì)胞癌、55例黑色素瘤、18例結(jié)腸癌、17例腎細(xì)胞癌、17例卵巢癌、14例胰腺癌、7例胃癌、4例乳腺癌)患者進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化療后，接受6個療程抗體治療結(jié)果顯示有效率在6%～17%，并且12%～14%患者具有可長達(dá)24周的緩解［35］。

2.2抗PD-1抗體臨床研究安全性評價抗PD-1抗體治療癌癥在臨床研究階段取得了可觀的療效，然而Nivolumab和Lambrolizumab阻斷PD-1/PD-L1通路后，激活了效應(yīng)T細(xì)胞功能，可引起機(jī)體對自身抗原的免疫反應(yīng)，其所產(chǎn)生的不良反應(yīng)目前主要有疲勞、輸液反應(yīng)、腹瀉、關(guān)節(jié)痛、皮疹、惡心、瘙癢、頭痛等，此外還對肝功能和內(nèi)分泌腺(包括垂體、甲狀腺、腎上腺和性腺)的功能有影響。

Nivolumab臨床Ⅰ期的安全性評估顯示，207例癌癥病人中引起皮疹(12%)，瘙癢癥(9%)，腹瀉(11%)，轉(zhuǎn)氨酶(3%～4%)，甲狀腺的變化(2%)，輸液反應(yīng)(3%)，肺炎(3%)，3～4級(腹瀉、皮疹、甲狀腺異常等)不良反應(yīng)(14%)。Lambrolizumab臨床Ⅰ期的安全性評估顯示，135例晚期黑色素瘤患者在治療中會引起輕微的臨床疲勞、瘙癢、腹瀉等臨床反應(yīng)［34］。Nivolumab與Ipilimumab聯(lián)合治療的臨床Ⅰ期毒副安全評價結(jié)果顯示［36］，多達(dá)53%病人有3～4級臨床反應(yīng)。單克隆PD-1抗體引起的不良反應(yīng)多為輕度，并且多為劑量依賴，而聯(lián)合抗體治療引起的不良反應(yīng)中有過半病人的不良反應(yīng)較嚴(yán)重，因此進(jìn)行聯(lián)合治療時的劑量可能更要嚴(yán)格把關(guān)。抗PD-L1抗體［36］引起的不良反應(yīng)高達(dá)91%，但大部分為1～2級輕度不良反應(yīng)，此外還引起輸液反應(yīng)(10%)和3 ～4級不良反應(yīng)(9%)。這些藥物引起的不良反應(yīng)可能是由潛在的免疫反應(yīng)所引起的，在接受了糖皮質(zhì)激素類藥物治療后病人的不良反應(yīng)可得到緩解，補(bǔ)償療法可以緩解由于病人接受抗體治療引起的內(nèi)分泌失調(diào)，抗組胺劑、解熱劑、糖皮質(zhì)激素類藥物可以改善病人的輸液反應(yīng)。值得注意的是，抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體藥物的療效顯著，并且毒副作用與Ipilimumab相比更溫和，且耐受良好。因此抗PD-1抗體藥物在免疫治療的安全性評價上更具有優(yōu)勢。

2.3抗PD-1抗體與其他藥物聯(lián)合治療基于PD-1通路的免疫治療和化療、放療以及針對其他靶點(diǎn)的免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用，可能在未來的疾病治療中更具有意義。Deng等［37］利用高劑量電離輻射(IR)與抗PD-L1抗體聯(lián)合治療小鼠乳腺癌，結(jié)果聯(lián)合治療降低了小鼠腫瘤浸潤髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)的局部聚集，減弱了對T細(xì)胞的抑制，活化了細(xì)胞毒性T細(xì)胞，改變了腫瘤免疫微環(huán)境。該實(shí)驗(yàn)為IR、PD-1/PD-L1和T細(xì)胞之間的密切關(guān)系提供了依據(jù)，并且這種聯(lián)合治療方式也為后續(xù)合理的免疫調(diào)節(jié)與放療的聯(lián)合治療提供新的設(shè)計(jì)思路。在小鼠卵巢癌的研究中，Lu等［38］合并anti-PD-1和GITR(激活Tregs的功能標(biāo)志物)抗體對建立的小鼠腹膜ID8卵巢癌模型進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療比單獨(dú)單抗治療表現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果，anti-PD-1和GITR抗體的聯(lián)合治療明顯促進(jìn)了CD8+T細(xì)胞的增殖，增加了效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ的頻率，降低免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和髓樣抑制性細(xì)胞的數(shù)量，改變了小鼠膜腹腔內(nèi)的腫瘤免疫抑制微環(huán)境，增強(qiáng)了免疫狀態(tài)。并且聯(lián)合化療藥物(順鉑或紫杉醇)治療后增強(qiáng)了小鼠抗癌抗菌素的產(chǎn)生，使80%的ID8卵巢癌小鼠腫瘤消失，延長了小鼠的存活期。此外，Zeng等［39］用轉(zhuǎn)染有熒光素的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞建立的小鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型，分別對單獨(dú)輻射、單抗PD-1抗體、聯(lián)合輻射和抗PD-1抗體三種治療方式進(jìn)行研究比較，發(fā)現(xiàn)未接受治療組小鼠中位生存期為25 d，單獨(dú)PD-1抗體治療組中位生存期為27 d，輻射治療組為28 d，而聯(lián)合輻射和抗PD-1抗體治療組具有53 d中位生存期，研究說明聯(lián)合治療對腫瘤治療具有更好的療效。

此外一些非臨床數(shù)據(jù)［40-42］表明，PD-1與CTLA-4，PD-1與Tim3，PD-1與CD28等抗體聯(lián)合治療，對小鼠真菌敗血癥，慢性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染，均可協(xié)同促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖表達(dá)和病毒的控制，與單獨(dú)抗體治療相比，具有更好的療效。

4　展望

PD-1在調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫中發(fā)揮了重要的作用，是開啟免疫治療的有效靶點(diǎn)。由于許多腫瘤細(xì)胞表面會高表達(dá)PD-L1，因此PD-L1可能成為腫瘤發(fā)展中預(yù)測性的有效生物標(biāo)志物。雖然PD-1/PD-L1通路及其調(diào)節(jié)機(jī)制仍未完全闡明，但是在臨床試驗(yàn)階段，抗PD-1和PD-L1抗體治療已取得了一定的療效，相信隨著對免疫學(xué)的不斷深入研究，PD-L1/PD-1通路的調(diào)節(jié)機(jī)制會更加明確。此外，隨著對免疫抑制靶點(diǎn)的研究，在聯(lián)合治療藥物上，抗PD-1抗體藥物與放療、化療、電力輻射、造血干細(xì)胞移植等聯(lián)合治療將有巨大的臨床應(yīng)用前景，從而有望對癌癥、慢性炎癥等患者產(chǎn)生持久的抗腫瘤效應(yīng)。同時，抗體治療給患者帶來的一些臨床反應(yīng)還需要在進(jìn)一步臨床試驗(yàn)中做嚴(yán)格的安全性評估。

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［收稿2014-06-05修回2015-04-01］

(編輯倪鵬)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．027

通訊作者及指導(dǎo)教師:宋海峰(1972年－)，男，博士，研究員，主要從事生物技術(shù)藥物藥理學(xué)等方面的研究，E-mail: bapklab@ yahoo．com。

作者簡介:王芳(1987年－)，女，主要從事抗體藥物藥效學(xué)評價的基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)研究，E-mail: fangfangfighting87 @ 163．com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1413-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類號R392.11