分子生物學(xué)技術(shù)在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷方法中的研究進展

于新友，李天芝，苗立中，唐 娜，沈志強，

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

分子生物學(xué)技術(shù)在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷方法中的研究進展

于新友1，李天芝1，苗立中2，唐 娜2，沈志強1，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

綜述了分子生物學(xué)技術(shù)在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷的4種方法（RT-PCR方法、熒光定量RT-PCR方法、RT-PCR與RFLP相結(jié)合方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法）的研究進展，對豬瘟的凈化和防控有一定的參考價值。

分子生物學(xué)技術(shù)；豬瘟野毒；兔化弱毒；鑒別診斷

豬瘟(CSF)是黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬急性、熱性、高度接觸性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，其發(fā)病率和死亡率均高，對養(yǎng)豬業(yè)危害十分嚴(yán)重。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)在《國際動物衛(wèi)生法典》中將其列為法定傳染病之一。疫苗接種是防控豬瘟的重要手段，我國研制的豬瘟兔化弱毒在世界上廣泛應(yīng)用，對豬瘟的防控起到了重要的作用，但豬瘟弱毒疫苗株（HCLV）能在已接種的豬體內(nèi)持續(xù)存在一段時間，這給CSFV野毒感染豬和HCLV接種豬的鑒別診斷帶來較大困難，再加上近年來，我國豬瘟的流行和發(fā)病特點發(fā)生了很大變化，出現(xiàn)了所謂 “非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”，在病理剖檢上也常常不同于典型豬瘟的病理變化，也給臨床診斷帶來了很大困難[1]。因此，準(zhǔn)確區(qū)分豬瘟野毒株與兔化弱毒疫苗株的敏感、特異的鑒別診斷方法非常重要。筆者就鑒別豬瘟野毒株與兔化弱毒疫苗株的方法進行了綜述，以期對豬瘟病毒感染早期進行準(zhǔn)確診斷，淘汰強毒感染豬，減少未感染的免疫豬被誤殺，為豬瘟的凈化和防控提供參考。

1??RT-PCR?方法

RT-PCR是以病毒的RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進行核酸擴增來檢測病毒的方法，以其簡便、迅速、靈敏等優(yōu)點在動物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。Li Y等[2]建立了能區(qū)分豬瘟強、弱毒的復(fù)合套式RTPCR診斷方法，該方法從HCLV和石門株強毒株基因組分別擴增出447和343 bp的特異性片段，從2種病毒基因組混合物中同時擴增出447和343 bp的特異性片段，該方法對BVDV、JEV、TGEV、PEDV、PRV、PCV2、PRRSV、PPV以及正常細胞基因組進行檢測時均為陰性，可以檢測出0.04 pg的CSFV RNA，用該方法檢測133份臨床樣品，結(jié)果有42份為強毒感染，18份為弱毒疫苗。胡建和等[3]根據(jù)GenBank中豬瘟病毒及近源病毒的基因組全序列，選擇特異保守區(qū)域設(shè)計了2對豬瘟病毒引物，建立了一種敏感性、特異性強、重復(fù)性好的鑒別豬瘟強毒和HCLV的多重RT-PCR鑒別診斷方法。該法從HCLV和石門強毒株的基因組中分別擴增出1條大小為492和178 bp的特異性片段，從強弱毒株混合物中1次擴增出2條大小為492和178 bp的特異性片段，對偽狂犬病病毒的擴增結(jié)果為陰性，能檢測出0.8 pg的豬瘟病毒RNA，應(yīng)用試驗表明，8份疑似豬瘟病料中5份為強毒感染，2份為弱毒感染，1份為弱毒和強毒的混合感染。郭抗抗等根據(jù)GenBank中36株豬瘟病毒強毒株和HCLV株的基因序列，分別設(shè)計了針對CSFV強毒和HCLV株的特異性引物，建立了一種能區(qū)分CSFV強毒和HCLV的RTPCR檢測方法。該法可從CSFV強毒株和HCLV株中分別擴增出大小為187和492 bp的特異性片段，對PRRSV、PCV2和TGEV等檢測結(jié)果均為陰性，對10份疑似豬瘟臨床樣品進行檢測后發(fā)現(xiàn)，有2份疑似CSFV強毒、7份疑似疫苗弱毒。李安等對GenBank中登錄的25株CSFV強毒株和HCLV株基因組全序列進行比較分析，設(shè)計1對豬瘟病毒強毒株和HCLV檢測通用引物，擴增片段為609 bp，并在該對引物擴增區(qū)域內(nèi)設(shè)計針對疫苗弱毒的特異引物，擴增片段為237 bp，該法對牛病毒性腹瀉病毒和其他豬源病毒均不發(fā)生非特異反應(yīng)，成功建立了一種能夠區(qū)分豬瘟病毒強毒和HCLV的敏感、特異、重復(fù)性好的RT-nPCR鑒別診斷方法。陳本龍等[4]根據(jù)Genbank上發(fā)表的豬瘟病毒全基因組序列，選擇豬瘟強毒株和兔化弱毒株疫苗株序列存在的差異區(qū)域，分別設(shè)計合成2條強毒株和HCLV株的特異性上游引物，同時選擇高保守區(qū)域序列，設(shè)計合成了一條強毒和兔化弱毒共用的下游引物，成功建立了一種能夠區(qū)分豬瘟病毒強毒株和HCLV的RT-PCR檢測方法。該法從豬瘟強毒株和兔化弱毒株中擴增出了大小分別為680 bp和785 bp的特異性片段，對PRRSV、BVDV、PRV、PCV2等病毒基因組擴增均為陰性，可檢測出最低為0.5 pg的豬瘟病毒RNA，具有高度的特異性和敏感性。

2??熒光定量RT-PCR方法

實時熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，為豬瘟病毒的定量檢測提供了新的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。H.S.Cho等應(yīng)用不同熒光基團標(biāo)記的2條TaqMan MGB探針建立了能鑒別韓國CSFV野毒株和弱毒疫苗株的熒光RT-PCR方法，但此方法沒有做到定量檢測，而且也無法對我國的豬瘟病毒野毒株和HCLV株進行鑒別檢測。J.J.Zhao等根據(jù)GenBank中的豬瘟病毒強毒和弱毒株基因組序列，設(shè)計了1對針對豬瘟病毒的通用引物和2條分別針對豬瘟病毒強毒和HCLV的特異性TaqMan探針，建立了能區(qū)分豬瘟病毒強毒和HCLV株的復(fù)合實時熒光定量RT-PCR檢測方法。該方法能將我國大陸流行的不同基因亞群的豬瘟病毒強毒株與HCLV完全區(qū)分開來，而不與其他豬源病毒發(fā)生非特異反應(yīng)。Lihong Liu等建立了疫苗株特異性和野毒株特異性的實時熒光RTPCR方法，其特異性強、敏感性高和重復(fù)性好。Leifer等建立了CSFV野毒株和HCLV的熒光定量RT-PCR鑒別診斷方法，該法對豬瘟弱毒疫苗株具有良好的擴增效果，而對豬瘟野毒和其他瘟病毒均無擴增產(chǎn)物，具有良好的特異性與敏感性。劉俊等[5]針對CSFV野毒株和HCLV株的基因組特點設(shè)計了一條特異性探針，建立了豬瘟野毒株一步TaqMan-MGB RT-PCR診斷方法，該法能檢測5.3×102pgCSFV病毒核酸；能檢測除HCLV以外的豬瘟流行野毒株，對牛病毒性腹瀉病毒、細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、口蹄疫病毒等項檢測均為陰性；對122份疑似豬瘟樣本檢測的結(jié)果與RT-nPCR方法的符合率為94.3%（115/122），陽性和陰性符合率分別為86.4%（38/44）和98.7%（77/78）。謝金文等通過對GenBank中登錄的25株CSFV強毒株和HCLV株全基因組序列進行比較分析，設(shè)計一對共用下游引物以及分別針對CSFV強毒株與弱毒疫苗的特異性上游引物，建立的能鑒別CSFV強毒感染與弱毒疫苗的熒光定量RT-PCR方法，其Tm值分別為（84.5±0.5）℃和（88.5±0.5）℃，該法特異性強，對其他相關(guān)病毒無特異性擴增；敏感性高，最低檢出量為5×RID50的細胞疫苗基因組拷貝；重復(fù)性好；并且擴增效率高、線性范圍廣、檢測時間短，可對免疫豬群中CSFV強毒感染做出快速準(zhǔn)確的鑒別檢測，為有效防制豬瘟提供依據(jù)。余以剛等設(shè)計了1對通用引物和2條特異性MGB探針，建立了豬瘟病毒野生株和疫苗株熒光RT-PCR鑒別方法，該法在選定的豬病相關(guān)病毒組內(nèi)特異性符合率達100%；對野毒株和HCLV的檢測靈敏度分別達到1TCID50/mL和0.1TCID50/mL；組內(nèi)和組間變異系數(shù)均在0.7%～2.2%之間。用該法對豬肉、脾臟和血液病料進行豬瘟野毒檢測的陽性率分別為66.7%、60.0%、77.8%，而傳統(tǒng)方法的陽性率分別為52.4%、40.0%、50.0%；檢出率比傳統(tǒng)方法要高。

3??RT-PCR與RFLP方法結(jié)合

限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)是先將靶基因相關(guān)片段用PCR擴增，然后利用限制性內(nèi)切酶能夠特異性地識別特定的堿基序列對擴增產(chǎn)物進行酶切，通過電泳可將酶切片段分離檢測，具有分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點，但操作比較復(fù)雜，對實驗條件要求高。趙耘等[6]建立了套式RT-PCR與RFLP相結(jié)合區(qū)分豬瘟強毒、疫苗弱毒的鑒別診斷RT-PCR/RFLP方法。該法對豬瘟病毒石門株與HCVL均能擴增出約為250 bp的特異性片段，而BVDV、BDV均未擴增出。RT-PCR純化產(chǎn)物被HgaI酶切后，弱毒能夠被酶切成大小分別約為150 bp、120 bp的2條片段，而強毒則不能被切開，可應(yīng)用于CSFV野毒株和疫苗株的鑒別檢測。S.Vilcek等將CSFV基因組5′端非編碼區(qū)的選擇部分進行擴增，然后用選擇性限制內(nèi)切酶Bbr PI對擴增的DNA片段進行切割，結(jié)果供試的13株CSFV疫苗株中的11株可被Bbr PI切割，切割位點在5′端非編碼區(qū)引物324/326旁的區(qū)域(CACGTG)，這11株疫苗株被切割電泳后均一致地出現(xiàn)2條特征性帶，分別長195 bp和89 bp，而23個歐洲田間野毒在5′端非編碼區(qū)無Bbr PI酶切位點，不能被此內(nèi)切酶切割。董浩等[7]根據(jù)GenBank上已發(fā)表的HCV E2基因高度保守區(qū)設(shè)計一對特異性引物，從Shimen株和疫苗株中均能擴增出一條大小為750 bp的特異性片段，Shimen株的RT-PCR產(chǎn)物則被BglⅡ酶切為大小分別為520和230 bp的2條帶，疫苗株的RT-PCR產(chǎn)物不能被BglⅡ酶切，對病毒RNA的最小檢出量為3.96×10-4μg/m L，用該法可對豬瘟強毒株與HCLV株進行鑒別。胡繼明等建立了豬瘟病毒野毒株和HCLV的RT-PCR-RFLP鑒別檢測方法，對野毒株和HCLV進行RT-PCR擴增片段均能為825 bp片段，野毒株的PCR產(chǎn)物能被ApaⅠ酶切為322 bp和503 bp的2個片段，HCLV株則不能被酶切，檢測出RNA的最低濃度為2.86×10-2μg/m L。

4??環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi等在2000年發(fā)明的一項恒溫核酸擴增新技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟等特點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。X.J.Zhang等建立了可視化檢測豬瘟病毒野毒株的LAMP方法，該法可檢測出2.5TCID50的CSFV石門株基因組RNA。對HCVL株、BVDV、PRRSV、TGEV、PEDV、PRV、PPV、PCV2檢測結(jié)果均為陰性。通過對126份不同樣品進行檢測比較，該方法與實時熒光定量RT-PCR檢測方法的符合率達100%。隨后，又建立了檢測HCLV的LAMP方法，對CSFV 強毒株、BVDV、TGEV、PEDV、PRRSV、PPV、PRV、PCV2檢測結(jié)果均為陰性。張改平等[8]比較分析了CSFV標(biāo)準(zhǔn)強毒株、疫苗株、不同基因亞型的野毒株的全基因組序列差異，設(shè)計一套分別針對豬瘟強毒與弱毒NS5B基因的LAMP引物，建立特異性的豬瘟強毒株與疫苗株的LAMP檢測方法。該方法特異性好，比RT-PCR靈敏度高出1 000倍，且重復(fù)性穩(wěn)定性良好，為快速準(zhǔn)確地鑒別CSFV野毒感染和疫苗接種提供了有效的方法。

5??小結(jié)與展望

近年來，豬瘟流行情況復(fù)雜，無規(guī)律可尋，豬瘟防控任務(wù)仍十分艱巨，由于豬瘟弱毒疫苗在我國的大規(guī)模應(yīng)用，豬瘟的強毒、疫苗弱毒鑒別診斷成為豬瘟預(yù)防與控制中非常困難和棘手的問題。雖然豬瘟野毒與兔化弱毒分子生物學(xué)鑒別診斷方法有很多，但各有利弊，常規(guī)RT-PCR方法具有特異性強、敏感性高、檢出率高等特點，但不能準(zhǔn)確地定量，容易污染，且敏感性有限，很難對處于亞臨床感染狀態(tài)的病豬進行早期診斷。熒光定量 RT-PCR技術(shù)彌補了常規(guī)RT-PCR方法的缺點，但由于需要價格昂貴的儀器與試劑，限制了其在基層獸醫(yī)部門的廣泛應(yīng)用。LAMP方法檢測快速、簡便，適合在基層獸醫(yī)和養(yǎng)殖場進行推廣使用，對指導(dǎo)豬瘟的防控具有重要的意義，但LAMP方法靈敏度高易導(dǎo)致假陽性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相信一些新型診斷方法終將問世并得以推廣應(yīng)用，使人們能夠快速、準(zhǔn)確地鑒別診斷豬瘟野毒與兔化弱毒，從而盡早對豬瘟暴發(fā)做出準(zhǔn)確快速的診斷，防止疫情蔓延；可以將CSFV野毒感染豬迅速從免疫豬群中篩查出來并予以清除，降低了在疫病暴發(fā)時弱毒疫苗免疫豬被淘汰的概率，為豬瘟的凈化和防控提供有效的方法。

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2014-11-12）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-06-011-14)

于新友(1983-)，男，漢族，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術(shù)研究。