神經(jīng)軸突中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體運輸?shù)难芯糠椒?/h1>
2015-01-24 22:44:21鄒麗芳梁尚棟
中國藥理學(xué)通報 2015年3期
鄒麗芳, 黃 安, 梁尚棟
(1.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，江西 南昌 330006；2.江西財經(jīng)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330013)
神經(jīng)軸突中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體運輸?shù)难芯糠椒?/p>
鄒麗芳1, 黃 安2, 梁尚棟1
(1.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，江西 南昌 330006；2.江西財經(jīng)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330013)
神經(jīng)元之間的信息交流及其生長發(fā)育與軸突運輸密切相關(guān)。軸突運輸中信號分子通過激活相關(guān)受體形成配體受體復(fù)合物，在細(xì)胞內(nèi)吞作用下進(jìn)入內(nèi)體，形成神經(jīng)元軸突中的胞內(nèi)吞細(xì)胞器。胞內(nèi)吞細(xì)胞器從軸突運輸至胞體，這種細(xì)胞器稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體。內(nèi)體運輸受損影響神經(jīng)元的生存，了解軸突及內(nèi)體運輸這一過程的研究方法將有助于尋找相關(guān)疾病的病因和防治方法。該文就神經(jīng)元軸突及內(nèi)體運輸?shù)难芯糠椒ㄟM(jìn)行綜述。
軸突運輸；信號內(nèi)體；神經(jīng)元；神經(jīng)營養(yǎng)因子；配體-受體復(fù)合物；研究方法
維持神經(jīng)元長程的有效信息交流非常重要。神經(jīng)元的遠(yuǎn)距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體(signalling endosome)的眾多核內(nèi)體以微管依賴性方式轉(zhuǎn)運[1]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體是靶細(xì)胞分泌的信號分子可激活軸突末梢相應(yīng)受體形成配體-受體復(fù)合物，在細(xì)胞內(nèi)吞作用下進(jìn)入內(nèi)體形成的胞內(nèi)吞細(xì)胞器，可從軸突逆行轉(zhuǎn)運至胞體的這種細(xì)胞器具有信號轉(zhuǎn)運功能[1]。近年來，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體運輸已成為一個重要的研究熱點，內(nèi)體運輸受損影響神經(jīng)元的生存[2]，了解其研究方法有助于加深對這一熱點研究的認(rèn)識。
1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的概念及其在軸突運輸中的作用
神經(jīng)元之間信息交換是通過長程的軸突運輸完成。神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin, NT )作為信號分子是通過長程運輸從外周到胞體對神經(jīng)元的生存產(chǎn)生重要作用。NT家族包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子 4/5 (NT4/5) 和神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)[3]。核內(nèi)體(endosome，又稱內(nèi)體)是一種真核細(xì)胞中的膜結(jié)合細(xì)胞器，屬于一種囊泡結(jié)構(gòu)。軸突運輸中信號分子通過激活相關(guān)受體形成配體-受體復(fù)合物，在細(xì)胞內(nèi)吞作用下進(jìn)入內(nèi)體，形成神經(jīng)元軸突中的胞內(nèi)吞細(xì)胞器。胞內(nèi)吞細(xì)胞器從軸突運輸至胞體，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的這種胞內(nèi)吞細(xì)胞器稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體[4-5]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體對細(xì)胞信號進(jìn)行調(diào)節(jié)與分類，參與軸漿的逆行運輸。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體不僅為逆行傳輸信號的重要來源，同時使細(xì)胞內(nèi)信號高度編組和區(qū)隔化，從而確保信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(尤其是長距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo))的特異性和持久性[6]。神經(jīng)元軸突末端信號可由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體依賴微管轉(zhuǎn)運至胞體，并有多種受體-配體復(fù)合物參與，這種受體-配體復(fù)合物如作為“貨物”的配體-NT或受體-神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(NTR)及其復(fù)合物(NT-NTR)。阿爾茨海默病的發(fā)病原因之一為神經(jīng)元的微管馬達(dá)蛋白出現(xiàn)異常改變，導(dǎo)致軸突運輸障礙，使重要物質(zhì)無法運輸?shù)捷S突末梢，影響軸突末梢與胞體的信息交流，使突觸功能失調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，細(xì)胞間通訊中斷，最終引起認(rèn)知功能發(fā)生障礙[7]。因此，軸漿運輸?shù)闹袛嗷蛉笔c神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。
根據(jù)細(xì)胞內(nèi)吞作用的不同時間階段，內(nèi)體分為初級內(nèi)體、次級內(nèi)體以及再循環(huán)內(nèi)體，并可被如GTP結(jié)合蛋白Rabs等蛋白標(biāo)記物而區(qū)分。神經(jīng)營養(yǎng)因子信號是神經(jīng)元生長的關(guān)鍵因素。神經(jīng)營養(yǎng)因子的內(nèi)吞作用是神經(jīng)營養(yǎng)因子信號的基本特征[8]。神經(jīng)營養(yǎng)因子通過軸突逆向運輸至胞體，對突觸的生長和神經(jīng)元的存活起著重要作用。神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體通過信號內(nèi)體轉(zhuǎn)運逆行信號。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的形成過程中，靶組織釋放的NT結(jié)合到軸突末端Trk受體，配體受體復(fù)合物通過內(nèi)吞途徑進(jìn)行內(nèi)化。內(nèi)吞形成的隔室分開運輸神經(jīng)營養(yǎng)因子信號分子，由不同的內(nèi)吞途徑可能形成早期內(nèi)體、多泡體、晚期內(nèi)體及巨大內(nèi)體等形式，并通過微管將NT信號逆行轉(zhuǎn)運到胞體[1]。
2 標(biāo)記和追蹤研究方法
2.1 神經(jīng)營養(yǎng)因子標(biāo)記法NT標(biāo)記法廣泛應(yīng)用于研究神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的逆向軸突運輸。早期的研究中，有學(xué)者將放射性核素125I標(biāo)記的神經(jīng)生長因子注入嚙齒動物的虹膜和唾液腺里，用以追蹤被標(biāo)記的神經(jīng)生長因子在細(xì)胞體的累積[9]。也有研究通過向小雞胚胎的眼肌中注射其他的放射性同位素示蹤的神經(jīng)營養(yǎng)因子(125I-BDNF、125I-NT3 和125I-NT4/5)，觀察放射性同位素示蹤的NT在動眼神經(jīng)元的逆向軸突運輸。放射性同位素標(biāo)記法的優(yōu)點在于其較容易量化。然而，此方法需要相對較高的蛋白量(皮克)來實現(xiàn)可靠的檢測。此外，放射性同位素標(biāo)記神經(jīng)營養(yǎng)因子的研究方法時空分辨率差。如將同位素示蹤法與下述幾種方法相結(jié)合檢測可能會達(dá)到更好的效果。
2.2 熒光標(biāo)記神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體神經(jīng)營養(yǎng)因子嵌合熒光、熒光標(biāo)記抗NTR抗體、用熒光染料直接標(biāo)記神經(jīng)營養(yǎng)因子和/或其受體可以直觀地觀察它們的運輸狀況。例如，將綠色免疫熒光蛋白(GFP)融合到神經(jīng)營養(yǎng)因子受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的方法常廣泛用于研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的軸突運輸[10]。此外，綠色熒光蛋白標(biāo)記的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子也可用于研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體軸突運輸?shù)姆置诩拔铡１掣窠?jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRG)的研究顯示，用綠色免疫熒光蛋白標(biāo)記酪氨酸激酶的Trk B 受體(TrkB-GFP)可表達(dá)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體中，并參與軸突的逆向運輸[11]。神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體嵌合熒光法也是研究神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體成像的重要工具。Tani 等的研究表明，神經(jīng)營養(yǎng)因子與化學(xué)熒光的直接結(jié)合可用于小雞 DRG生長錐上神經(jīng)營養(yǎng)因子膜動力學(xué)的可視研究。然而，這種方法需要嵌合蛋白的過表達(dá)，而過表達(dá)可能改變生理信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
2.3 量子點量子點(quantum dots, QDs)又稱為半導(dǎo)體納米晶體 (semiconductor nanocrystal)，它是能克服有機(jī)染料和同位素的一些缺陷的新標(biāo)記物。QDs是由1種Ⅱ-Ⅵ族 (如 CdSe、CdTe、CdS 等)或 Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米顆粒，當(dāng)前研究較多的是 CdSe、CdTe 等。對量子點而言，其最大的優(yōu)點是耐光漂白。有機(jī)熒光團(tuán)在光激發(fā)下可發(fā)生不可逆的光致化學(xué)反應(yīng)，最終導(dǎo)致其失去熒光。由于其非有機(jī)的自然特性，QDs受光漂白的影響要小很多。耐光漂白對需要長時間觀察和成像的實驗來說非常重要，比如利用熒光標(biāo)記觀察細(xì)胞的傳輸過程或跟蹤單個膜結(jié)合分子的運動路徑等。QDs相對于其他化學(xué)或基于綠色免疫熒光蛋白的熒光素來說更具有光穩(wěn)定性。QDs因為其特性已經(jīng)被用于神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體運輸?shù)难芯浚?，酪氨酸激酶TrKA 的內(nèi)吞作用，往返運輸和重新分配[12-13]。然而，國內(nèi)外有報道，當(dāng)細(xì)胞吞噬量超過其容載濃度后，就會出現(xiàn)QDs的毒性，影響細(xì)胞生長。生物標(biāo)記中最常用的 CdSe/ZnS QDs的毒性主要來自從 CdSe 晶格中釋放出來的游離 Cd2+，當(dāng)其暴露于空氣中會使QDs表面氧化，最終導(dǎo)致 Cd2+的釋放[14]。有研究表明QDs通過胞內(nèi)吞作用而被細(xì)胞吸收，當(dāng)它接觸到內(nèi)體結(jié)構(gòu)中低pH的環(huán)境時，QDs部分降解并釋放鎘離子，從而降低它的熒光強(qiáng)度并增強(qiáng)顆粒毒性[15]。
2.4 病毒和毒素許多種病原體和位于神經(jīng)元質(zhì)膜上的受體相互作用，并且一旦內(nèi)化則可進(jìn)行長程的軸突運輸。早期的研究表明，病毒和細(xì)菌毒素是較好地理解神經(jīng)元運輸途徑的分子工具[16]。在細(xì)菌毒素中，熒光結(jié)合的肉毒素(BoNTs)和破傷風(fēng)毒素(TeNT)片段已被證實是研究軸突運輸?shù)墓ぞ?。在運動和感覺神經(jīng)元中，TeNT在外周被內(nèi)化并逆向運輸至神經(jīng)元的胞體；TeNT的一個無毒片段保持著整個毒素的內(nèi)化作用和長程運輸?shù)奶匦裕膳c神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體共同在軸突進(jìn)行逆向運輸[17]。
狂犬病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、皰疹病毒和犬腺病毒 2(CAV2)也可用于神經(jīng)元長距離運輸?shù)难芯縖18-20]。特別是CAV2曾被證實在運動神經(jīng)元中和NT及其受體在同一區(qū)室內(nèi)進(jìn)行逆向運輸[19]。
3 用于研究軸突運輸?shù)难b置與技術(shù)
3.1 Campenot 室體外大量培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞不能體現(xiàn)其生存在體內(nèi)微環(huán)境的情況?，F(xiàn)已發(fā)明若干種將胞體從神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)分隔的裝置，其中最成功地裝置是Campenot室(Campenot chambers)。在早期的結(jié)構(gòu)中，Campenot室包括三個隔室，是由高分子聚四乙烯在組織培養(yǎng)皿頂部構(gòu)建的分隔密封裝置。神經(jīng)元放置在中間隔室，同時在外隔室輔以不同的生長因子。聚四乙烯隔物與培養(yǎng)皿表面通過硅密封來達(dá)到區(qū)室的相互隔離，但是有足夠的空間使神經(jīng)突起穿過隔離處并延伸至外隔室。這些裝置起初用于說明神經(jīng)生長因子在神經(jīng)軸突延伸時的局部效應(yīng)。利用它們可對神經(jīng)營養(yǎng)因子的時空影響因素進(jìn)行嚴(yán)格控制的優(yōu)點，后來也成功地應(yīng)用于內(nèi)體信號的傳輸和研究中。然而，Campenot室雖然易于處理不同的操作者引起的變量改變和機(jī)械損傷所帶來的影響，但是其在活細(xì)胞成像中存在一定的問題[21]。
3.2 微流體系統(tǒng)微流體系統(tǒng)由一塊聚二甲硅氧烷構(gòu)建，上面有一些小隔間，隔間之間通過細(xì)微紋溝連接。整個裝置放在一個玻璃的蓋玻片上，蓋玻片提前要用多聚賴氨酸包被以便神經(jīng)細(xì)胞的貼壁。神經(jīng)細(xì)胞種植在一個間隔中，軸突通過微細(xì)紋溝延伸到另一隔室中。微流體系統(tǒng)與Campenot室類似，旨在實現(xiàn)軸突與細(xì)胞體的隔離。然而，和Campenot室不同的是,微流體系統(tǒng)的分隔不是機(jī)械化的，而是流體憑借細(xì)微紋溝置于兩個隔室之間。
微流體室具有透明和防水的特點。這些特征使得微流體系統(tǒng)成為活細(xì)胞成像的一種有效研究工具。細(xì)微紋溝的長度與厚度可以調(diào)整成適應(yīng)不同神經(jīng)元群的生長速率的形式。這些特征使得微流體室成為研究軸突運輸中神經(jīng)營養(yǎng)因子及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的非常有價值的研究工具[4]。雙室的微流體裝置用于皮層神經(jīng)元軸突再生的研究，指導(dǎo)軸突或胞體的治療[21]，并可同非神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)[22]。有研究將脊髓運動神經(jīng)元與神經(jīng)肌肉于微流體室中共同培養(yǎng)，研究脊髓下運動神經(jīng)元與神經(jīng)肌肉之間的通訊[23]。
目前,已發(fā)明一種應(yīng)用液態(tài)氟碳油欄隔離不同區(qū)室細(xì)胞的微流體細(xì)胞共培養(yǎng)裝置，用液態(tài)油欄隔離的微流體裝置研究海馬神經(jīng)元單獨轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白標(biāo)記和mCherry熒光蛋白標(biāo)記的cDNA。結(jié)果表明在GFP標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)室中，沒有出現(xiàn)神經(jīng)元轉(zhuǎn)染mCherry熒光蛋白的現(xiàn)象，說明液態(tài)油欄可以很好地隔離微流體裝置的不同區(qū)室[24]。利用微流體共培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可能有助于維持神經(jīng)元在類似整體的生理狀態(tài)，進(jìn)而提高神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效率[25]。相比Campenot培養(yǎng)系統(tǒng)，微流體系統(tǒng)具有更易操作、重復(fù)性好，可獲取介質(zhì)中不同梯度的信號分子，特別是可隔離神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的不同部分，如不同類型神經(jīng)元或靶細(xì)胞。因此，微流體系統(tǒng)具有同時維持不同細(xì)胞群體在物理和流體上隔離的特點。
3.3 坐骨神經(jīng)結(jié)扎因為坐骨神經(jīng)是最長并最容易獲得的軸突，從而使坐骨神經(jīng)結(jié)扎方法成功地運用于在體軸突運輸?shù)难芯恐?。嚙齒動物經(jīng)麻醉后，用醫(yī)用鑷子將絲線從坐骨神經(jīng)下方穿過并輕微結(jié)扎，這一過程可抑制軸突運輸，但沒有損傷神經(jīng)軸突和神經(jīng)近端之間的鄰近組織。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體和信號分子可積聚在坐骨神經(jīng)結(jié)扎的遠(yuǎn)側(cè)端。這項技術(shù)的另一個應(yīng)用是分離活體動物的坐骨神經(jīng)末端到特定的緩沖液集合器中，完整的囊泡運輸可在不被周圍細(xì)胞干擾的情況下收集。坐骨神經(jīng)結(jié)扎實驗與放射性同位素標(biāo)記的神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法相結(jié)合可用于研究囊泡運輸?shù)倪\輸速率和運輸囊泡的數(shù)量。除坐骨神經(jīng)結(jié)扎外，位于小鼠脊髓、坐骨神經(jīng)和肋間神經(jīng)的單個軸突的活體成像，都可用于檢測軸突中細(xì)胞器的動力學(xué)變化[26-27]。
4 結(jié)語與展望
放射性同位素標(biāo)記法容易量化，但檢測的可靠性需要較高的蛋白量來保證，但其時空分辨率較差，此時可將放射性同位素示蹤法與熒光標(biāo)記、量子點方法相結(jié)合才能達(dá)到更好的效果；熒光標(biāo)記神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的方法已廣泛用于軸突運輸中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的研究，但是這種方法需要嵌合蛋白的過表達(dá)，可能會改變生理信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；量子點是能克服有機(jī)染料和同位素一些缺陷的新標(biāo)記物，有特異的光學(xué)特性，可是當(dāng)細(xì)胞吞噬量超過其容載濃度后，會使量子點的毒性表現(xiàn)出來，從而影響細(xì)胞生長。
Campenot室易于處理不同的操作者引起的變量改變和機(jī)械損傷所帶來的影響，但是它們在活細(xì)胞成像中存在一定的問題，是需要在今后研究中加以克服。與Campenot培養(yǎng)系統(tǒng)相比，微流體系統(tǒng)更易操作、重復(fù)性好，可用于不同類型的神經(jīng)元或靶細(xì)胞之間的研究，具有同時維持不同細(xì)胞群體的物理和流體上隔離的特點。
軸突運輸中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的不同研究方法各有其優(yōu)點與缺點。在未來的研究中，將神經(jīng)營養(yǎng)因子的同位素標(biāo)記法與熒光標(biāo)記法、軸突運輸方法相結(jié)合進(jìn)行研究，相互之間取長補(bǔ)短，進(jìn)一步完善，為各種實驗需要提供有效的研究方法，從而促進(jìn)神經(jīng)元的遠(yuǎn)距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究。
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Study methods of signalling endosomal transport in neuronal axons
ZOU Li-fang1，HUANG An2, LIANG Shang-dong1
(1.DeptofPhysiology,BasicMedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2.VocationalTechnicalCollege,JiangxiUniversityofFinanceandEconomics,Nanchang330013,China)
The information communication between neurons and their growth and development are closely related to axonal transport. Signal molecules in the axonal transport activate the relevant receptors to form ligand-receptor complexes. The ligand-receptor complexes being transported into endosomes by endocytosis form the cellular endocytic organelles in neuronal axons. Those cellular endocytic organelles transported from axon to cell body are called signalling endosome. When endosome transport is impaired, it will affect neuronal survival. Understanding the study methods in this process of axonal and endosomal transport will be helpful to find out the etiopathogenesis and the therapeutic methods of relevant diseases. This article mainly reviews the study methods of signalling endosome transport in neuronal axons.
axonal transport; signalling endosome; neuron; neurotrophin; ligand-receptor complexes; study method
時間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.003.html
2014-10-11,
2014-12-13
國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81171184, 31060139, 30860086)；第二批江西省“贛鄱英才555工程”領(lǐng)軍人才項目；江西省教育廳科技項目(No GJJ14319)
鄒麗芳(1991-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)生理學(xué)與病理生理學(xué)， E-mail: 1060294960@qq.com; 梁尚棟(1957-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:神經(jīng)生理學(xué)與神經(jīng)藥理學(xué)， 通訊作者,Tel:0791-86360552,E-mail: liangsd88@163.com
10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.003
A
1001-1978(2015)03-0308-04
R-05；R322.8；R329.25；R338.1
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鄒麗芳, 黃 安, 梁尚棟
(1.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，江西 南昌 330006；2.江西財經(jīng)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330013)
神經(jīng)軸突中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體運輸?shù)难芯糠椒?/p>
鄒麗芳1, 黃 安2, 梁尚棟1
(1.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，江西 南昌 330006；2.江西財經(jīng)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330013)
神經(jīng)元之間的信息交流及其生長發(fā)育與軸突運輸密切相關(guān)。軸突運輸中信號分子通過激活相關(guān)受體形成配體受體復(fù)合物，在細(xì)胞內(nèi)吞作用下進(jìn)入內(nèi)體，形成神經(jīng)元軸突中的胞內(nèi)吞細(xì)胞器。胞內(nèi)吞細(xì)胞器從軸突運輸至胞體，這種細(xì)胞器稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體。內(nèi)體運輸受損影響神經(jīng)元的生存，了解軸突及內(nèi)體運輸這一過程的研究方法將有助于尋找相關(guān)疾病的病因和防治方法。該文就神經(jīng)元軸突及內(nèi)體運輸?shù)难芯糠椒ㄟM(jìn)行綜述。
軸突運輸；信號內(nèi)體；神經(jīng)元；神經(jīng)營養(yǎng)因子；配體-受體復(fù)合物；研究方法
維持神經(jīng)元長程的有效信息交流非常重要。神經(jīng)元的遠(yuǎn)距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體(signalling endosome)的眾多核內(nèi)體以微管依賴性方式轉(zhuǎn)運[1]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體是靶細(xì)胞分泌的信號分子可激活軸突末梢相應(yīng)受體形成配體-受體復(fù)合物，在細(xì)胞內(nèi)吞作用下進(jìn)入內(nèi)體形成的胞內(nèi)吞細(xì)胞器，可從軸突逆行轉(zhuǎn)運至胞體的這種細(xì)胞器具有信號轉(zhuǎn)運功能[1]。近年來，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體運輸已成為一個重要的研究熱點，內(nèi)體運輸受損影響神經(jīng)元的生存[2]，了解其研究方法有助于加深對這一熱點研究的認(rèn)識。
1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的概念及其在軸突運輸中的作用
神經(jīng)元之間信息交換是通過長程的軸突運輸完成。神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin, NT )作為信號分子是通過長程運輸從外周到胞體對神經(jīng)元的生存產(chǎn)生重要作用。NT家族包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子 4/5 (NT4/5) 和神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)[3]。核內(nèi)體(endosome，又稱內(nèi)體)是一種真核細(xì)胞中的膜結(jié)合細(xì)胞器，屬于一種囊泡結(jié)構(gòu)。軸突運輸中信號分子通過激活相關(guān)受體形成配體-受體復(fù)合物，在細(xì)胞內(nèi)吞作用下進(jìn)入內(nèi)體，形成神經(jīng)元軸突中的胞內(nèi)吞細(xì)胞器。胞內(nèi)吞細(xì)胞器從軸突運輸至胞體，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的這種胞內(nèi)吞細(xì)胞器稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體[4-5]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體對細(xì)胞信號進(jìn)行調(diào)節(jié)與分類，參與軸漿的逆行運輸。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體不僅為逆行傳輸信號的重要來源，同時使細(xì)胞內(nèi)信號高度編組和區(qū)隔化，從而確保信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(尤其是長距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo))的特異性和持久性[6]。神經(jīng)元軸突末端信號可由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體依賴微管轉(zhuǎn)運至胞體，并有多種受體-配體復(fù)合物參與，這種受體-配體復(fù)合物如作為“貨物”的配體-NT或受體-神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(NTR)及其復(fù)合物(NT-NTR)。阿爾茨海默病的發(fā)病原因之一為神經(jīng)元的微管馬達(dá)蛋白出現(xiàn)異常改變，導(dǎo)致軸突運輸障礙，使重要物質(zhì)無法運輸?shù)捷S突末梢，影響軸突末梢與胞體的信息交流，使突觸功能失調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，細(xì)胞間通訊中斷，最終引起認(rèn)知功能發(fā)生障礙[7]。因此，軸漿運輸?shù)闹袛嗷蛉笔c神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。
根據(jù)細(xì)胞內(nèi)吞作用的不同時間階段，內(nèi)體分為初級內(nèi)體、次級內(nèi)體以及再循環(huán)內(nèi)體，并可被如GTP結(jié)合蛋白Rabs等蛋白標(biāo)記物而區(qū)分。神經(jīng)營養(yǎng)因子信號是神經(jīng)元生長的關(guān)鍵因素。神經(jīng)營養(yǎng)因子的內(nèi)吞作用是神經(jīng)營養(yǎng)因子信號的基本特征[8]。神經(jīng)營養(yǎng)因子通過軸突逆向運輸至胞體，對突觸的生長和神經(jīng)元的存活起著重要作用。神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體通過信號內(nèi)體轉(zhuǎn)運逆行信號。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的形成過程中，靶組織釋放的NT結(jié)合到軸突末端Trk受體，配體受體復(fù)合物通過內(nèi)吞途徑進(jìn)行內(nèi)化。內(nèi)吞形成的隔室分開運輸神經(jīng)營養(yǎng)因子信號分子，由不同的內(nèi)吞途徑可能形成早期內(nèi)體、多泡體、晚期內(nèi)體及巨大內(nèi)體等形式，并通過微管將NT信號逆行轉(zhuǎn)運到胞體[1]。
2 標(biāo)記和追蹤研究方法
2.1 神經(jīng)營養(yǎng)因子標(biāo)記法NT標(biāo)記法廣泛應(yīng)用于研究神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的逆向軸突運輸。早期的研究中，有學(xué)者將放射性核素125I標(biāo)記的神經(jīng)生長因子注入嚙齒動物的虹膜和唾液腺里，用以追蹤被標(biāo)記的神經(jīng)生長因子在細(xì)胞體的累積[9]。也有研究通過向小雞胚胎的眼肌中注射其他的放射性同位素示蹤的神經(jīng)營養(yǎng)因子(125I-BDNF、125I-NT3 和125I-NT4/5)，觀察放射性同位素示蹤的NT在動眼神經(jīng)元的逆向軸突運輸。放射性同位素標(biāo)記法的優(yōu)點在于其較容易量化。然而，此方法需要相對較高的蛋白量(皮克)來實現(xiàn)可靠的檢測。此外，放射性同位素標(biāo)記神經(jīng)營養(yǎng)因子的研究方法時空分辨率差。如將同位素示蹤法與下述幾種方法相結(jié)合檢測可能會達(dá)到更好的效果。
2.2 熒光標(biāo)記神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體神經(jīng)營養(yǎng)因子嵌合熒光、熒光標(biāo)記抗NTR抗體、用熒光染料直接標(biāo)記神經(jīng)營養(yǎng)因子和/或其受體可以直觀地觀察它們的運輸狀況。例如，將綠色免疫熒光蛋白(GFP)融合到神經(jīng)營養(yǎng)因子受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的方法常廣泛用于研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的軸突運輸[10]。此外，綠色熒光蛋白標(biāo)記的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子也可用于研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體軸突運輸?shù)姆置诩拔铡１掣窠?jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRG)的研究顯示，用綠色免疫熒光蛋白標(biāo)記酪氨酸激酶的Trk B 受體(TrkB-GFP)可表達(dá)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體中，并參與軸突的逆向運輸[11]。神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體嵌合熒光法也是研究神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體成像的重要工具。Tani 等的研究表明，神經(jīng)營養(yǎng)因子與化學(xué)熒光的直接結(jié)合可用于小雞 DRG生長錐上神經(jīng)營養(yǎng)因子膜動力學(xué)的可視研究。然而，這種方法需要嵌合蛋白的過表達(dá)，而過表達(dá)可能改變生理信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
2.3 量子點量子點(quantum dots, QDs)又稱為半導(dǎo)體納米晶體 (semiconductor nanocrystal)，它是能克服有機(jī)染料和同位素的一些缺陷的新標(biāo)記物。QDs是由1種Ⅱ-Ⅵ族 (如 CdSe、CdTe、CdS 等)或 Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米顆粒，當(dāng)前研究較多的是 CdSe、CdTe 等。對量子點而言，其最大的優(yōu)點是耐光漂白。有機(jī)熒光團(tuán)在光激發(fā)下可發(fā)生不可逆的光致化學(xué)反應(yīng)，最終導(dǎo)致其失去熒光。由于其非有機(jī)的自然特性，QDs受光漂白的影響要小很多。耐光漂白對需要長時間觀察和成像的實驗來說非常重要，比如利用熒光標(biāo)記觀察細(xì)胞的傳輸過程或跟蹤單個膜結(jié)合分子的運動路徑等。QDs相對于其他化學(xué)或基于綠色免疫熒光蛋白的熒光素來說更具有光穩(wěn)定性。QDs因為其特性已經(jīng)被用于神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體運輸?shù)难芯浚?，酪氨酸激酶TrKA 的內(nèi)吞作用，往返運輸和重新分配[12-13]。然而，國內(nèi)外有報道，當(dāng)細(xì)胞吞噬量超過其容載濃度后，就會出現(xiàn)QDs的毒性，影響細(xì)胞生長。生物標(biāo)記中最常用的 CdSe/ZnS QDs的毒性主要來自從 CdSe 晶格中釋放出來的游離 Cd2+，當(dāng)其暴露于空氣中會使QDs表面氧化，最終導(dǎo)致 Cd2+的釋放[14]。有研究表明QDs通過胞內(nèi)吞作用而被細(xì)胞吸收，當(dāng)它接觸到內(nèi)體結(jié)構(gòu)中低pH的環(huán)境時，QDs部分降解并釋放鎘離子，從而降低它的熒光強(qiáng)度并增強(qiáng)顆粒毒性[15]。
2.4 病毒和毒素許多種病原體和位于神經(jīng)元質(zhì)膜上的受體相互作用，并且一旦內(nèi)化則可進(jìn)行長程的軸突運輸。早期的研究表明，病毒和細(xì)菌毒素是較好地理解神經(jīng)元運輸途徑的分子工具[16]。在細(xì)菌毒素中，熒光結(jié)合的肉毒素(BoNTs)和破傷風(fēng)毒素(TeNT)片段已被證實是研究軸突運輸?shù)墓ぞ?。在運動和感覺神經(jīng)元中，TeNT在外周被內(nèi)化并逆向運輸至神經(jīng)元的胞體；TeNT的一個無毒片段保持著整個毒素的內(nèi)化作用和長程運輸?shù)奶匦裕膳c神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體共同在軸突進(jìn)行逆向運輸[17]。
狂犬病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、皰疹病毒和犬腺病毒 2(CAV2)也可用于神經(jīng)元長距離運輸?shù)难芯縖18-20]。特別是CAV2曾被證實在運動神經(jīng)元中和NT及其受體在同一區(qū)室內(nèi)進(jìn)行逆向運輸[19]。
3 用于研究軸突運輸?shù)难b置與技術(shù)
3.1 Campenot 室體外大量培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞不能體現(xiàn)其生存在體內(nèi)微環(huán)境的情況?，F(xiàn)已發(fā)明若干種將胞體從神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)分隔的裝置，其中最成功地裝置是Campenot室(Campenot chambers)。在早期的結(jié)構(gòu)中，Campenot室包括三個隔室，是由高分子聚四乙烯在組織培養(yǎng)皿頂部構(gòu)建的分隔密封裝置。神經(jīng)元放置在中間隔室，同時在外隔室輔以不同的生長因子。聚四乙烯隔物與培養(yǎng)皿表面通過硅密封來達(dá)到區(qū)室的相互隔離，但是有足夠的空間使神經(jīng)突起穿過隔離處并延伸至外隔室。這些裝置起初用于說明神經(jīng)生長因子在神經(jīng)軸突延伸時的局部效應(yīng)。利用它們可對神經(jīng)營養(yǎng)因子的時空影響因素進(jìn)行嚴(yán)格控制的優(yōu)點，后來也成功地應(yīng)用于內(nèi)體信號的傳輸和研究中。然而，Campenot室雖然易于處理不同的操作者引起的變量改變和機(jī)械損傷所帶來的影響，但是其在活細(xì)胞成像中存在一定的問題[21]。
3.2 微流體系統(tǒng)微流體系統(tǒng)由一塊聚二甲硅氧烷構(gòu)建，上面有一些小隔間，隔間之間通過細(xì)微紋溝連接。整個裝置放在一個玻璃的蓋玻片上，蓋玻片提前要用多聚賴氨酸包被以便神經(jīng)細(xì)胞的貼壁。神經(jīng)細(xì)胞種植在一個間隔中，軸突通過微細(xì)紋溝延伸到另一隔室中。微流體系統(tǒng)與Campenot室類似，旨在實現(xiàn)軸突與細(xì)胞體的隔離。然而，和Campenot室不同的是,微流體系統(tǒng)的分隔不是機(jī)械化的，而是流體憑借細(xì)微紋溝置于兩個隔室之間。
微流體室具有透明和防水的特點。這些特征使得微流體系統(tǒng)成為活細(xì)胞成像的一種有效研究工具。細(xì)微紋溝的長度與厚度可以調(diào)整成適應(yīng)不同神經(jīng)元群的生長速率的形式。這些特征使得微流體室成為研究軸突運輸中神經(jīng)營養(yǎng)因子及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的非常有價值的研究工具[4]。雙室的微流體裝置用于皮層神經(jīng)元軸突再生的研究，指導(dǎo)軸突或胞體的治療[21]，并可同非神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)[22]。有研究將脊髓運動神經(jīng)元與神經(jīng)肌肉于微流體室中共同培養(yǎng)，研究脊髓下運動神經(jīng)元與神經(jīng)肌肉之間的通訊[23]。
目前,已發(fā)明一種應(yīng)用液態(tài)氟碳油欄隔離不同區(qū)室細(xì)胞的微流體細(xì)胞共培養(yǎng)裝置，用液態(tài)油欄隔離的微流體裝置研究海馬神經(jīng)元單獨轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白標(biāo)記和mCherry熒光蛋白標(biāo)記的cDNA。結(jié)果表明在GFP標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)室中，沒有出現(xiàn)神經(jīng)元轉(zhuǎn)染mCherry熒光蛋白的現(xiàn)象，說明液態(tài)油欄可以很好地隔離微流體裝置的不同區(qū)室[24]。利用微流體共培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可能有助于維持神經(jīng)元在類似整體的生理狀態(tài)，進(jìn)而提高神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效率[25]。相比Campenot培養(yǎng)系統(tǒng)，微流體系統(tǒng)具有更易操作、重復(fù)性好，可獲取介質(zhì)中不同梯度的信號分子，特別是可隔離神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的不同部分，如不同類型神經(jīng)元或靶細(xì)胞。因此，微流體系統(tǒng)具有同時維持不同細(xì)胞群體在物理和流體上隔離的特點。
3.3 坐骨神經(jīng)結(jié)扎因為坐骨神經(jīng)是最長并最容易獲得的軸突，從而使坐骨神經(jīng)結(jié)扎方法成功地運用于在體軸突運輸?shù)难芯恐?。嚙齒動物經(jīng)麻醉后，用醫(yī)用鑷子將絲線從坐骨神經(jīng)下方穿過并輕微結(jié)扎，這一過程可抑制軸突運輸，但沒有損傷神經(jīng)軸突和神經(jīng)近端之間的鄰近組織。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體和信號分子可積聚在坐骨神經(jīng)結(jié)扎的遠(yuǎn)側(cè)端。這項技術(shù)的另一個應(yīng)用是分離活體動物的坐骨神經(jīng)末端到特定的緩沖液集合器中，完整的囊泡運輸可在不被周圍細(xì)胞干擾的情況下收集。坐骨神經(jīng)結(jié)扎實驗與放射性同位素標(biāo)記的神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法相結(jié)合可用于研究囊泡運輸?shù)倪\輸速率和運輸囊泡的數(shù)量。除坐骨神經(jīng)結(jié)扎外，位于小鼠脊髓、坐骨神經(jīng)和肋間神經(jīng)的單個軸突的活體成像，都可用于檢測軸突中細(xì)胞器的動力學(xué)變化[26-27]。
4 結(jié)語與展望
放射性同位素標(biāo)記法容易量化，但檢測的可靠性需要較高的蛋白量來保證，但其時空分辨率較差，此時可將放射性同位素示蹤法與熒光標(biāo)記、量子點方法相結(jié)合才能達(dá)到更好的效果；熒光標(biāo)記神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的方法已廣泛用于軸突運輸中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的研究，但是這種方法需要嵌合蛋白的過表達(dá)，可能會改變生理信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；量子點是能克服有機(jī)染料和同位素一些缺陷的新標(biāo)記物，有特異的光學(xué)特性，可是當(dāng)細(xì)胞吞噬量超過其容載濃度后，會使量子點的毒性表現(xiàn)出來，從而影響細(xì)胞生長。
Campenot室易于處理不同的操作者引起的變量改變和機(jī)械損傷所帶來的影響，但是它們在活細(xì)胞成像中存在一定的問題，是需要在今后研究中加以克服。與Campenot培養(yǎng)系統(tǒng)相比，微流體系統(tǒng)更易操作、重復(fù)性好，可用于不同類型的神經(jīng)元或靶細(xì)胞之間的研究，具有同時維持不同細(xì)胞群體的物理和流體上隔離的特點。
軸突運輸中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)體的不同研究方法各有其優(yōu)點與缺點。在未來的研究中，將神經(jīng)營養(yǎng)因子的同位素標(biāo)記法與熒光標(biāo)記法、軸突運輸方法相結(jié)合進(jìn)行研究，相互之間取長補(bǔ)短，進(jìn)一步完善，為各種實驗需要提供有效的研究方法，從而促進(jìn)神經(jīng)元的遠(yuǎn)距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究。
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Study methods of signalling endosomal transport in neuronal axons
ZOU Li-fang1，HUANG An2, LIANG Shang-dong1
(1.DeptofPhysiology,BasicMedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2.VocationalTechnicalCollege,JiangxiUniversityofFinanceandEconomics,Nanchang330013,China)
The information communication between neurons and their growth and development are closely related to axonal transport. Signal molecules in the axonal transport activate the relevant receptors to form ligand-receptor complexes. The ligand-receptor complexes being transported into endosomes by endocytosis form the cellular endocytic organelles in neuronal axons. Those cellular endocytic organelles transported from axon to cell body are called signalling endosome. When endosome transport is impaired, it will affect neuronal survival. Understanding the study methods in this process of axonal and endosomal transport will be helpful to find out the etiopathogenesis and the therapeutic methods of relevant diseases. This article mainly reviews the study methods of signalling endosome transport in neuronal axons.
axonal transport; signalling endosome; neuron; neurotrophin; ligand-receptor complexes; study method
時間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.003.html
2014-10-11,
2014-12-13
國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81171184, 31060139, 30860086)；第二批江西省“贛鄱英才555工程”領(lǐng)軍人才項目；江西省教育廳科技項目(No GJJ14319)
鄒麗芳(1991-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)生理學(xué)與病理生理學(xué)， E-mail: 1060294960@qq.com; 梁尚棟(1957-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:神經(jīng)生理學(xué)與神經(jīng)藥理學(xué)， 通訊作者,Tel:0791-86360552,E-mail: liangsd88@163.com
10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.003
A
1001-1978(2015)03-0308-04
R-05；R322.8；R329.25；R338.1
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