鉤藤藥材中異鉤藤堿含量的超高效液相色譜和高效液相色譜法的測(cè)定

何紅暉

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021）

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[1]，在鉤藤的莖枝中含有豐富的吲哚類(lèi)生物堿，有效成分以鉤藤堿和異鉤藤堿為主，今次，對(duì)鉤藤中鉤藤堿以及異鉤藤堿進(jìn)行含量測(cè)定具有很大的必要性。本次研究中出于建立異鉤藤堿高效液相色譜法的目的，分別采取超高液相色譜法和高效液相色譜法對(duì)鉤藤中異鉤藤堿含量展開(kāi)了測(cè)定，現(xiàn)匯報(bào)結(jié)果如下。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器：試驗(yàn)中需要用到的儀器包括：超聲波清洗儀（型號(hào)：KQ-250DB，廠家：昆山市超聲儀器有限公司），電子天平（型號(hào)：Sartorius-BT124S/BT 25S電子天平，常見(jiàn)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），高效液相色譜儀（Agilent 1100）等。

1.2 試劑與試藥：試驗(yàn)所需試劑中乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。試驗(yàn)中所需中藥材鉤藤樣品經(jīng)鑒定為茜草科植物鉤藤的干燥鉤藤莖枝。異鉤藤堿購(gòu)自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，純度不低于98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：高效液相色譜法所需色譜柱為Alltech C18柱，規(guī)格為4.6 mm×250 mm，5 μm，流動(dòng)相為乙腈-水，乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，并以1 mL/L三乙胺，冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至7.5，梯度洗脫，0～20 min時(shí)A在50%～55%，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL；超高液相色譜法色譜柱為Waters ACQIITY UPLCTMT3 C18柱，規(guī)格為2.1 mm×50 mm，1.7 μL，流動(dòng)相為乙腈-水，乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，并以1 mL/L三乙胺，冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至8，梯度洗脫，流速為0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm，柱溫為50 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 供試品溶液的制備：取鉤藤粉末樣品2 g，稱(chēng)定后放置在圓底燒瓶中，精密加入2 mL氨水，悶潤(rùn)30 min后，精密加入50 mL的乙腈，稱(chēng)定重量后，加熱回流2 h，冷卻后再次稱(chēng)重，經(jīng)乙腈將損失重量補(bǔ)足，搖勻后過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。同法制成超過(guò)液相色譜法供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取異鉤藤堿對(duì)照品適量，經(jīng)乙腈溶解后制成每毫升中含有異鉤藤堿50 g的對(duì)照品溶液，同法制成超高液相色譜法的對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察：超高液相色譜法：分別取食量的異鉤藤堿儲(chǔ)備液配制成濃度為0.4602、0.36816、0.27612、0.18408、0.09204、0.04602、0.02301、0.011505、0.002301和0.0004602 mg/mL的對(duì)照品溶液，在2.1所示色譜條件下1 μL進(jìn)樣檢測(cè)，以對(duì)照品的濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)去洗，結(jié)果得到異鉤藤堿的線性回歸方程為Y=4×106X-4364.9，r2=0.9999，證實(shí)異鉤藤堿濃度在0.4602～460.2 g/mL時(shí)存在良好的線性關(guān)系。

高效液相色譜法：精密稱(chēng)取異鉤藤堿5.05mg，經(jīng)乙腈溶解后配制成濃度為0.505 mg/mL的對(duì)照品溶液，精密吸取該溶液配制成不同濃度的對(duì)照品溶液，分別為：0.505、0.404、0.303、0.202、0.101、0.0505、0.02525、0.012625、0.002525、0.000505 mg/mL。在2.1所示色譜條件下20μL進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，以異鉤藤堿濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果得到異鉤藤堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=41.101X-0.233，r2=0.9999，證實(shí)異鉤藤堿濃度在0.505～505 g/mL之間時(shí)存在良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)：超高液相色譜法：選取濃度為0.036816 mg/mL的對(duì)照品溶液，一日日重復(fù)進(jìn)樣3次，連續(xù)進(jìn)樣3 d，按照2.1所示色譜條件1 μL進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果得到RSD值為0.16%，證實(shí)該儀器的精密度良好。高效液相色譜法：選取濃度為0.02525 mg/mL的對(duì)照品溶液，日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣3次，連續(xù)3 d，在，2.1所示條件下20 μL進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果得到RSD值為0.16%，證實(shí)該儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：超高液相色譜法：精密稱(chēng)定供試品2 g，在2.2.1條件下制成供試品溶液，在2.1所示色譜條件下分別在0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h時(shí)1 μL進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果得到RSD職位0.14%，證實(shí)溶液在72 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

高效液相色譜法：精密稱(chēng)定供試品2 g，在2.2.1條件下制成供試品溶液，在2.1所示色譜條件下分別在0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h時(shí)1 μL進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果得到RSD職位0.34%，證實(shí)溶液在72 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：超高液相色譜法：取6份鉤藤藥材粉末，在2.2.1條件下制成供試品溶液，在2.1色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果得到RSD值為0.6%，證實(shí)該方法的重現(xiàn)性良好。高效液相色譜法：取6份鉤藤藥材粉末，在2.2.1條件下制成供試品溶液，在2.1色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果得到RSD值為1.5%，證實(shí)該方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.5 回收率實(shí)驗(yàn)：超高液相色譜法：取5份同一批次一直含量的鉤藤藥材樣品，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，在2.1所示條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平均回收率為96.41%，RSD值為3.1%；高效液相色譜法：取5份同一批次一直含量的鉤藤藥材樣品，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，在2.1所示條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平均回收率為98.01%，RSD值為4.1%。

2.4 樣品含量測(cè)定：取不同批次鉤藤藥材粉末樣品，在2.2.1條件下配制成供試品溶液，在2.1條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超高液相色譜法測(cè)定鉤藤中異鉤藤堿的含量平均為0.09653%，高效液相色譜法測(cè)定鉤藤中異鉤藤堿的含量平均為0.09159%，二者無(wú)明顯差異。

3 討 論

中藥材鉤藤為茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤的干燥帶鉤莖枝。鉤藤的主要功效為熄風(fēng)定驚、清熱平肝，在肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、感冒夾驚、驚癇抽搐、小兒驚啼、妊娠子癇以及頭痛眩暈等癥的治療中具有很好的效果[2]。經(jīng)超高液相色譜法和高效液相色譜法對(duì)鉤藤中有效成分異鉤藤堿含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)具有方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，值得關(guān)注。

[1] 張榮,劉睿,劉啟德,等.鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿的提取與含量測(cè)定[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,11(4):1001-1003.

[2] 王曉穎,劉永靜,陳丹,等.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地鉤藤中鉤藤堿的含量分析[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2011,23(3):276-278.