豬圓環(huán)病毒2型懸浮培養(yǎng)工藝的研究進(jìn)展

郭玲花 王麗敏 肖 燕 孫進(jìn)忠

(普萊柯生物工程股份有限公司,河南洛陽 471003)

豬圓環(huán)病毒2型懸浮培養(yǎng)工藝的研究進(jìn)展

郭玲花 王麗敏 肖 燕 孫進(jìn)忠

(普萊柯生物工程股份有限公司,河南洛陽 471003)

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovi rus type2，PCV2）流行廣泛，能損害免疫系統(tǒng)，多繼發(fā)其他病原的混合感染，影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。疫苗能有效防治PCV2，減少病毒對豬群的損害。對目前國內(nèi)外市場上PCV2疫苗的制備工藝及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)利用懸浮培養(yǎng)工藝培養(yǎng)PK-15細(xì)胞來增殖PCV2，在PCV2疫苗的制備上具有廣闊的市場前景。

豬圓環(huán)病毒2型 懸浮培養(yǎng) PK-15細(xì)胞 疫苗制備

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）感染是近年來發(fā)現(xiàn)的一種比較難控制的傳染病，該病主要侵害哺乳仔豬和育肥豬，對懷孕母豬也有較大影響。其特征性臨床癥狀為患病豬體質(zhì)不良、皮膚蒼白。PCV有PCV1和PCV2兩種血清型，其中PCV1無臨床致病性，PCV2有臨床致病性（Allan G，2002）。PCV2感染后可導(dǎo)致豬體免疫抑制及抵抗力低下，影響豬體對部分疫病免疫抗體的產(chǎn)生和維持，繼發(fā)其他病原的混合感染。感染豬圓環(huán)病毒2型引起的相關(guān)疾病主要有：斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、急性肺水腫（APE）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）等（GRAU-ROMA L.CRISCI E，2008）。目前，豬圓環(huán)病毒2型在我國已普遍存在，表現(xiàn)為流行范圍廣、陽性率高、混合感染嚴(yán)重、種豬感染率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響豬群健康，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，養(yǎng)豬行業(yè)人士已將該病列為當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的頭號疫病。因此PCV2疫苗的有效使用，對于該病的防控具有重要意義。

目前國內(nèi)外商品化的PCV2疫苗有很多種，一般分為全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗。即使是桿狀病毒或者大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PCV2 Cap蛋白制備的亞單位疫苗，也是因?yàn)镃ap蛋白可以在一定的條件下形成病毒樣粒子（virus-like particles，VLPs），免疫豬只后才可以對PCV2產(chǎn)生較好的免疫力。由于亞單位疫苗生產(chǎn)成本較全病毒滅活疫苗高很多，價(jià)格相對昂貴，目前市場上使用范圍較廣的多為全病毒滅活疫苗，但由于全病毒滅活疫苗的生產(chǎn)主要都采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的方法，而現(xiàn)有培養(yǎng)PCV2的PK-15系細(xì)胞在體外增殖培養(yǎng)PCV2的能力不強(qiáng)，致使PCV2產(chǎn)量及效價(jià)較低，疫苗批間質(zhì)量差別較大（劉長明，2005）。隨著國內(nèi)疫苗生產(chǎn)企業(yè)的數(shù)量逐步增加，企業(yè)間的競爭導(dǎo)致利潤空間下降，要想在保證疫苗效果的前提下提升市場競爭力，就需要優(yōu)化疫苗生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，減少批間差異，保證產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，大量細(xì)胞已被馴化為懸浮培養(yǎng)方式，普遍應(yīng)用于病毒的大規(guī)模培養(yǎng)。本文將對細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，特別是PCV2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝的研究現(xiàn)狀進(jìn)行簡單介紹：

1 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

病毒的培養(yǎng)方法有組織細(xì)胞增殖、禽胚增殖、易感動(dòng)物體內(nèi)增殖，疫苗制備中一般選用細(xì)胞培養(yǎng)的方法來增殖病毒。根據(jù)細(xì)胞生長特性，一般有方瓶培養(yǎng)、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，其中轉(zhuǎn)瓶工藝勞動(dòng)強(qiáng)度大，許多人同時(shí)進(jìn)行長時(shí)間的消化傳代操作，污染風(fēng)險(xiǎn)較高，同時(shí)其生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)效率較低，成產(chǎn)成本較高。而懸浮培養(yǎng)工藝可控制一系列細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，具有培養(yǎng)病毒含量高，無須混合，批間差異小，培養(yǎng)方式自動(dòng)化，無須大量生產(chǎn)人員，培養(yǎng)需求面積小、污染小等優(yōu)點(diǎn)，是疫苗制備中首選的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，大量細(xì)胞已被馴化為懸浮培養(yǎng)方式，普遍應(yīng)用于病毒的大規(guī)模培養(yǎng)。國外早在1962年，Capstick PB等開始利用BHK21細(xì)胞，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)繁殖FMDV的實(shí)驗(yàn)（Capstick PB，1962）；1965年，Telling R.C.等使用不銹鋼發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞進(jìn)行FMDV的生產(chǎn)（Doel TR，2003）。

國內(nèi)關(guān)于采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝制備疫苗的研究也在不斷發(fā)展成熟，周燕等進(jìn)行了Vero細(xì)胞懸浮培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒生產(chǎn)工藝條件的優(yōu)化（周燕，2005）；馮磊等利用微載體，實(shí)現(xiàn)了Marc-145細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)來增殖豬繁殖與呼吸綜合征病毒（馮磊，2012）；龔迪等通過探索促進(jìn)MDCK細(xì)胞貼壁的關(guān)鍵組分，篩選

出用麥麩水解物代替血清的低血清培養(yǎng)基，放大培養(yǎng)，微載體細(xì)胞貼壁均勻、生長旺盛，為流感疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)（龔迪，2012）；張良艷等用直接法和間接法分別馴化MDCK細(xì)胞，獲得了較高的病毒滴度，為用細(xì)胞培養(yǎng)代替雞胚制備流感病毒疫苗奠定基礎(chǔ)（張良艷，2013）；林美玲等以Vero細(xì)胞為基質(zhì)，初步建立了微載體反應(yīng)器無血清懸浮培養(yǎng)HSV-Ⅱ病毒的生產(chǎn)工藝，新老微載體比3：1，至少4次級聯(lián)放大，為疫苗簡便、高效的規(guī)?；a(chǎn)提供參考（林美玲，2014）；熊煒等通過懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，增殖乙腦病毒，制備乙腦疫苗，該方法能工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，疫苗穩(wěn)定且免疫效力高（熊煒，2011）；李陽等通過雞胚成纖維細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)制備新城疫疫苗，工藝簡單穩(wěn)定易操作，疫苗安全性好，免疫效力高，對強(qiáng)毒攻擊有完全的免疫保護(hù)（李陽，2013）；李陽等通過懸浮培養(yǎng)制備PRRSV滅活疫苗，縮短了生產(chǎn)周期，降低了人員配置，污染概率小，占地面積小，批間差異小，產(chǎn)品穩(wěn)定高效，副反應(yīng)小，疫苗質(zhì)量得到顯著提高（李陽，2014）。

2 PK-15細(xì)胞懸浮培養(yǎng)PCV2工藝的研究

PCV2常用PK-15細(xì)胞進(jìn)行病毒的增殖，由于PK-15細(xì)胞貼壁生長，目前現(xiàn)有制備豬圓環(huán)病毒滅活疫苗的生產(chǎn)工藝大多以方瓶培養(yǎng)與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)為主，方瓶培養(yǎng)工藝病毒產(chǎn)量較低，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝車間需大面積溫室培養(yǎng)條件及相對多的實(shí)驗(yàn)人員，污染概率增加，產(chǎn)品效力不可控制，病毒含量較低，配制疫苗時(shí)需要濃縮，且轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)的差異易導(dǎo)致疫苗批間參差不齊等問題。市場急需要一類免疫原性良好、大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)批間穩(wěn)定、培養(yǎng)周期短、病毒含量高、銷售價(jià)格合理的PCV2疫苗，而懸浮培養(yǎng)工藝相比于方瓶培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，具有生產(chǎn)量大、生長周期短、批間穩(wěn)定、可全自動(dòng)化控制與監(jiān)視、降低勞動(dòng)力成本等優(yōu)點(diǎn)，因此用PK-15細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)來增殖PCV2，在制備PCV2滅活疫苗中具有明顯優(yōu)勢。

國內(nèi)關(guān)于PK-15細(xì)胞懸浮培養(yǎng)PCV2的研究越來越多。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)何錫忠等（何錫忠，2009）利用Celli Gen生物反應(yīng)器，進(jìn)行了懸浮培養(yǎng)PK-15細(xì)胞來繁殖PCV2的實(shí)驗(yàn)研究。5L的反應(yīng)器中，微載體為5g/L，0.2%LH的無血清LG-DMEM培養(yǎng)基將病毒液作10×稀釋，接種于傳代后24h的 PK-15細(xì)胞。設(shè)置參數(shù)為40%的空氣飽和度，50rpm的攪拌速度，37℃，PH為7.10，進(jìn)行PCV2的培養(yǎng)增殖，同時(shí)設(shè)立方瓶培養(yǎng)與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)對照。對接毒24h收獲的病毒液進(jìn)行TCID50測定，得出方瓶培養(yǎng)的病毒毒價(jià)為104.0TCID50/ m l，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的病毒毒價(jià)為105.5TCID50/ml，懸浮培養(yǎng)的病毒毒價(jià)為105.0TCID50/m l，懸浮培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的毒價(jià)比方瓶培養(yǎng)的高，但懸浮培養(yǎng)相比于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，具有生產(chǎn)量大、批間穩(wěn)定、可全自動(dòng)化控制與監(jiān)視等優(yōu)勢，可以作為PCV2增殖的首選，此實(shí)驗(yàn)證明了PK-15細(xì)胞懸浮培養(yǎng)PCV2的可行性，為制備更有效的PCV2疫苗奠定基礎(chǔ)。

張?jiān)S科等以BTONOCⅡ聚酯纖維微載體為基礎(chǔ)，優(yōu)化微載體密度為5.5g/500m l培養(yǎng)液，采用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)增殖病毒，單臺生物器規(guī)模達(dá)500～1000L，收獲病毒效價(jià)≥106.0TCID50/m l，提高了疫苗產(chǎn)量和毒價(jià)，減少了細(xì)胞切向壓力，而且無O2供應(yīng)限制和無泡沫煩惱（張?jiān)S科，2010）；徐宏軍等以Cytodex-1微載體為基礎(chǔ)，密度為3～5g/L，利用生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)帶毒PK-15細(xì)胞，容積能達(dá)3～3000L，病毒效價(jià)穩(wěn)定在106.5～6.7TCID50/m l，密封，減少其他病菌污染，提高了疫苗產(chǎn)品的安全性（徐宏軍，2013）；錢鐘等將片狀載體密度設(shè)置為250g/L細(xì)胞液，采用灌注懸浮培養(yǎng)技術(shù)增殖PCV2，病毒效價(jià)高達(dá)106.5TCID50/m l，培養(yǎng)基中血清含量低，降低了疫苗的生產(chǎn)成本（錢鐘，2014）；董彥鵬等以Cytodex-1微載體為基礎(chǔ)，密度為5～10g/L，生物反應(yīng)器達(dá)100L，病毒效價(jià)高達(dá)107.0TCID50/m l，用伴豆球蛋白A和水解酪蛋白的無血清低糖DMEM作細(xì)胞培養(yǎng)維持液，制備的抗原沒有血清殘留，PCV2疫苗的安全性更高（董彥鵬，2014）。綜合對比懸浮培養(yǎng)技術(shù)與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)或方瓶培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝在PCV2滅活疫苗的制備中顯示出明顯的優(yōu)勢，會(huì)越來越廣泛的應(yīng)用于PCV2滅活疫苗的制備。

3 小結(jié)

PCV2懸浮培養(yǎng)技術(shù)具有病毒產(chǎn)量高毒價(jià)高、生產(chǎn)周期短、污染小、批間穩(wěn)定、操作方便、可自動(dòng)化控制、培養(yǎng)需求面積小、降低勞動(dòng)力成本、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢，是增殖PCV2的首選。采用PK-15細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)增殖PCV2，對于PCV2滅活疫苗的制備具有重要意義，也是PCV2滅活疫苗制備的主流模式和必然趨勢，但是相對比較成熟的細(xì)胞懸浮馴化培養(yǎng)工藝，還需要最適無血清培養(yǎng)基和添加物的選擇及病毒培養(yǎng)過程中技術(shù)參數(shù)的進(jìn)一步研究。隨著細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝技術(shù)的優(yōu)化與成熟，使用更有效的PK-15細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝增殖PCV2，將有利于提高PCV2滅活疫苗的質(zhì)量和產(chǎn)量，進(jìn)而提高企業(yè)的生產(chǎn)效益和競爭力。

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郭玲花（1987-），女，?？粕?。

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201303046）資助。

孫進(jìn)忠，高級獸醫(yī)師，從事獸用生物制品工程技術(shù)的研究。