蜂膠抗病原微生物的活性物質(zhì)及其作用機(jī)制

曹雪萍　申小閣　胡福良

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

蜂膠抗病原微生物的活性物質(zhì)及其作用機(jī)制

曹雪萍申小閣胡福良

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

抗病原微生物作用是蜂膠最重要的生物學(xué)活性之一。蜂膠抗病原微生物的活性物質(zhì)及其作用機(jī)制是蜂膠抗病原微生物活性研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)近十多年來(lái)蜂膠抗病原微生物的活性物質(zhì)，以及蜂膠在破壞菌體細(xì)胞膜及細(xì)胞壁的完整性、抑制細(xì)菌生物膜形成、抑制細(xì)菌毒力因子活性和其相關(guān)基因表達(dá)等作用機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為蜂膠抗病原微生物活性的進(jìn)一步研究及開(kāi)發(fā)利用提供參考。

蜂膠；抗病原微生物；活性物質(zhì)；作用機(jī)制

蜂膠的化學(xué)成分極為復(fù)雜，生物學(xué)活性十分廣泛，其中抗病原微生物作用是蜂膠最重要的生物學(xué)活性之一。蜂膠抗病原微生物活性的研究與應(yīng)用的歷史十分悠久。近十多年來(lái)，隨著人們對(duì)蜂膠關(guān)注度的逐漸升高，大量圍繞蜂膠抗病原微生物活性的相關(guān)研究也隨之展開(kāi)，其中蜂膠抗病原微生物的活性物質(zhì)及其作用機(jī)制是研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)近十多年來(lái)蜂膠抗病原微生物的活性物質(zhì)及其作用機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為蜂膠抗病原微生物活性的進(jìn)一步研究及開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1　蜂膠抗病原微生物的活性物質(zhì)

蜂膠成分極為復(fù)雜，并且針對(duì)不同種類的微生物，其發(fā)揮活性的主要成分也有所差異。關(guān)于蜂膠中具有抗微生物作用的活性物質(zhì)研究有很多，主要以抗菌活性成分的研究為主。這些活性成分種類眾多，包括黃酮類、萜烯類和酚酸類等。

喬智勝和陳瑞華［1］對(duì)河南蜂膠抗菌活性成分進(jìn)行了研究，從蜂膠乙醇浸提液中分離到3個(gè)具有抗菌活性的結(jié)晶，經(jīng)鑒定分別為芥子酸、異阿魏酸和咖啡酸，從醇提液中還分離得到白楊素。蜂膠中含有多種抑制金葡菌生長(zhǎng)的成分，然而單體成分的最小抑菌濃度（MIC）與蜂膠本身相近或略高，說(shuō)明蜂膠對(duì)金葡菌的抗菌作用是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。

Amoros等［2］通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了蜂膠中抗1型單純皰疹病毒的主要黃酮性成分，并發(fā)現(xiàn)黃酮醇的活性要強(qiáng)于黃酮的活性，活性順序?yàn)楦吡冀兀旧侥畏樱鹃纹に?，表明這些抗病毒成分之間還存在協(xié)同作用，后來(lái)Lyu等［3］的實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了Amoros等的結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)受試的黃酮類成分對(duì)1型單純皰疹病毒的作用強(qiáng)于對(duì)2型單純皰疹病毒的作用

Velikova等［4］從巴西本地的一種無(wú)刺蜂（Melipona quadrifasciata）采集的蜂膠中分離出3種貝殼杉烯，而其中異貝殼杉烯酸與蜂膠總提取液具有相近的抗金葡菌的能力，說(shuō)明這種物質(zhì)在巴西無(wú)刺蜂蜂膠的抗菌活性中起到非常重要的作用。

Bosio等［5］從意大利西北部的不同地區(qū)采集到兩種蜂膠樣，用46種化膿性鏈球菌菌株檢測(cè)其抗微生物活性。通過(guò)瓊脂稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法，得到MIC和最小殺菌濃度（MBC）不超過(guò)234 μg/ml，其中的一種蜂膠抗菌作用更好，HPLC分析發(fā)現(xiàn)這個(gè)樣品提取物中含有更多的黃酮類成分松屬素和高良姜素。Koo等［6］研究了蜂膠組分對(duì)變形鏈球菌生長(zhǎng)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTFs）活性的影響，通過(guò)評(píng)估蜂膠中已發(fā)現(xiàn)的幾種不同化學(xué)組分對(duì)溶液中和唾液包被的羥基磷灰石珠子表面的葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的影響。結(jié)果表明，黃酮和黃酮醇是溶液中葡糖基轉(zhuǎn)移酶強(qiáng)有力的抑制物，而對(duì)不可溶性酶則效果較差。芹黃素（4，5，7-三羥基黃酮的一種）是最有效的GTFs抑制物，無(wú)論是在溶液中（濃度為135 μg/ml時(shí)達(dá)到90.5～95%抑制）還是在sHA珠子表面（135 μg/ml時(shí)達(dá)到30～60%）；通過(guò)MIC、MBC和Time-kill研究抗菌活性，結(jié)果表明，黃烷酮類和一些二氫黃酮醇以及倍半萜烯tt-法尼醇能抑制變形鏈球菌和血鏈球菌的生長(zhǎng)，tt-法尼醇是最有效的抗菌成分，其MIC和MBC分別為14～28 μg/ml和56～112 μg/ml。

Kartal等［7］對(duì)土耳其安納托利亞喀山和馬爾馬里斯地區(qū)蜂膠樣品的抗菌活性進(jìn)行了評(píng)估，研究表明其抗菌活性主要與蜂膠中的咖啡酸及其脂類有關(guān)，并從喀山蜂膠樣中分離出了包含3，3-二甲基咖啡酸烯丙酯和3-異戊烯咖啡酸酯兩個(gè)同分異構(gòu)體混合物，這個(gè)混合物具有良好的抗菌活性。Popova等［8］的實(shí)驗(yàn)表明酚類黃酮類物質(zhì)對(duì)蜂膠發(fā)揮抗菌作用的重要性，因?yàn)榭傸S酮和總酚含量低的樣品，其所需抗菌濃度會(huì)偏大，只有其中一種樣品比較特殊，可能是其內(nèi)含有的二萜酸幫助其發(fā)揮了抗菌活性。

de Paula等［9］研究了產(chǎn)自巴西的蜂膠乙醇提取物（EEP）和單體成分對(duì)16種口腔致病微生物的抗微生物活性，發(fā)現(xiàn)所有受試微生物都會(huì)受到EEP的影響，但沒(méi)有哪一種單體成分的活性強(qiáng)于提取物，表明蜂膠抗微生物的作用是各種物質(zhì)的協(xié)同作用。Gonsales等［10］研究表明，EEP能有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，而且抗菌能力與黃酮含量呈正相關(guān)。Melliou等［11］（2007）研究表明蜂膠揮發(fā)油中含有的萜類物質(zhì)具有很好的抗菌和抗真菌活性。Campana等［12］分析了兩種EEP和幾種黃酮成分對(duì)臨床分離的16種人空腸彎曲桿菌和幾種革蘭氏陽(yáng)性及陰性病原菌的抗菌活性。結(jié)果表明，EEP能抑制空腸彎曲桿菌、糞腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，活性最強(qiáng)的黃酮類成分是高良姜素；空腸彎曲桿菌對(duì)其敏感度達(dá)到68.8%，槲皮素的活性稍差（50%）；EEP對(duì)人空腸彎曲桿菌的MIC為0.3125～0.156 mg/ml，高良姜素和槲皮素的MIC為0.250～0.125 mg/ml。

Trusheva等［13］從伊朗蜂膠中分離出5種單體成分，其中4種為萜脂：bornylp-hydroxybenzoate、bornylvanillate、ferutinolp-hydroxybenzoate和ferutinol vanillate，均具有抗金黃色葡萄球菌的活性。這些抗菌成分屬于苯甲酸類單萜和倍半萜烯脂類物質(zhì)。

Ordónez等［14］研究了從阿根廷北部采集的蜂膠對(duì)一些植物病原菌的抗菌活性。結(jié)果表明，活性最強(qiáng)的蜂膠來(lái)自圖庫(kù)曼省，并從中分離出抗菌活性成分2.4-二羥基查耳酮，其抗菌作用比EEP還有效（MIC分別為0.5～1.0 μg/ml和9.5～15.0 μg/ml）。植物毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，蜂膠提取物不會(huì)延遲萵苣種子的發(fā)芽和洋蔥根的生長(zhǎng)；蜂膠溶液噴灑在感染了丁香假單胞菌的西紅柿上能降低病壞程度，表明蜂膠在防治水果病害上可能很有前景。

de Aguiar等［15］評(píng)估了3種巴西蜂膠提取物對(duì)瘤胃內(nèi)一些細(xì)菌的作用，發(fā)現(xiàn)蜂膠提取物能抑制一些細(xì)菌的生長(zhǎng)，但也有一些微生物對(duì)蜂膠提取物表現(xiàn)為耐受，被抑制的細(xì)菌對(duì)蜂膠提取物的敏感性不同，酚含量最低的提取物抗菌活性也最差。通過(guò)對(duì)蜂膠提取物中主要酚類化合物柚皮素、柯因、咖啡酸、p-香豆酸和阿替匹林C對(duì)4個(gè)敏感菌株抗菌活性的評(píng)估，發(fā)現(xiàn)只有柚皮素對(duì)所有菌株表現(xiàn)出抑制活性，表明柚皮素是參與蜂膠抗菌作用的重要成分之一。Navarro-Navarro等［16］通過(guò)肉湯宏稀釋法對(duì)墨西哥西北部索諾蘭沙漠3個(gè)不同地區(qū)的蜂膠抗弧菌屬抗菌活性的研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自烏雷斯地區(qū)蜂膠的抗菌活性最強(qiáng)，對(duì)大多數(shù)受試菌的半數(shù)最低抑菌濃度（MIC50）小于50 μg/ml，而且呈濃度依賴性。該蜂膠成分中的高良姜素和咖啡酸苯乙酯具有強(qiáng)烈抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的活性，MIC50為0.05～0.10 mmol/L。

由此可見(jiàn)，蜂膠中含有多種已經(jīng)證實(shí)的抗病原微生物成分，如松屬素、高良姜素、山奈酚、槲皮素、芹黃素、咖啡酸苯乙酯、柚皮素、異阿魏酸、咖啡酸、芥子酸、苯甲酸類單萜和倍半萜烯脂類物質(zhì)等。此外，還有文獻(xiàn)報(bào)道了蜂膠中其他具有抗病原微生物作用的成分：球松素、楊芽黃素、對(duì)香豆苯酸酯、短葉松素、白楊素、靛紅山姜素短葉松黃烷酮、喬松酮、柯因以及某些蜂膠中特有的活性成分，如巴西綠蜂膠中的3-異戊二烯基-4-羥基肉桂酸、2，2-二甲基-6-羧乙基香豆素、3，5-二異戊二烯基-4-羥基肉桂酸（阿替匹林C）、2，2-二甲基-6-羧乙基-8-異戊二烯基香豆素等［17，18］。

2　蜂膠抗病原微生物的機(jī)制

蜂膠的抗菌活性雖然很早便被人們發(fā)現(xiàn)，但在早期，其抗菌作用的確切機(jī)制一直不清楚，只是簡(jiǎn)單地將其歸結(jié)為各種物質(zhì)的協(xié)同作用。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，對(duì)蜂膠抗菌機(jī)制的探索有了初步的進(jìn)展。蜂膠抗病原微生物的機(jī)制有以下幾方面：

2.1抑制細(xì)菌生物膜形成，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和黏附

朱明等［19］研究了不同濃度新疆黑蜂膠對(duì)大腸桿菌體外培養(yǎng)生物膜形成及清除的影響，結(jié)果表明，新疆黑蜂膠醇提物對(duì)大腸桿菌的MIC為12.50 g/L，當(dāng)濃度為6.25 g/L時(shí)新疆黑蜂膠就可在早期呈劑量依賴性干擾細(xì)菌生物膜的形成，當(dāng)濃度達(dá)到50.00 g/L時(shí)，其抑制生物膜的作用與慶大霉素?zé)o顯著差異；當(dāng)蜂膠濃度達(dá)12.50 g/L時(shí)，能有效清除成熟生物膜，而當(dāng)濃度達(dá)到50.00 g/L時(shí)，其清除成熟BF的作用與慶大霉素?zé)o顯著差異。

Wojtyczka等［20］利用表皮葡萄球菌研究波蘭蜂膠的抗菌活性，結(jié)果表明，波蘭蜂膠乙醇提取物在濃度為0.39～1.56 mg/ml時(shí)能抑制此菌的所有受試菌株的生物膜形成；EEPP的MIC范圍為0.78～1.56 mg/ml，平均MIC為1.13±0.39 mg/ml。然而，EEPP濃度為0.025～0.39 mg/ml時(shí)，經(jīng)過(guò)12 h和24 h的孵育，反而能促進(jìn)此菌的增殖?？偟慕Y(jié)果分析表明，EEPP的抗菌活性表現(xiàn)為細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制，生物膜形成能力的抑制，以及增殖的強(qiáng)度明顯受到孵育時(shí)間、EEPP濃度以及這些因素之間相互作用的影響。

Koo等［21］研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠中的黃酮和黃酮醇能有效抑制變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，其中芹黃素最為有效。蔡爽等［22］采用紙片瓊脂擴(kuò)散法觀察了10、25、50和100 g/L蜂膠防齲涂膜對(duì)變形鏈球菌c型和d型的抑菌作用，結(jié)果表明各濃度蜂膠涂膜及基質(zhì)都能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和黏附，且抑菌作用呈明顯的濃度依賴性，100 g/L涂膜組的抑菌效果與1.6 g/L洗必泰溶液無(wú)顯著性差異。

Scazzocchio等［23］研究了EEP亞抑菌濃度的抗菌活性及其對(duì)一些抗生素抗菌作用的影響，還研究了EEP亞抑菌濃度對(duì)金黃色葡萄球菌一些重要的毒力因子，如脂肪酶、凝固酶的作用，以及對(duì)其生物膜形成的影響。結(jié)果表明，EEP對(duì)所有受試的臨床菌株都有很好的抗微生物活性。而且，EEP能大大增強(qiáng)一些抗菌藥物如氨芐西林、萬(wàn)古霉素、頭孢曲松等的作用，但不能增強(qiáng)紅霉素的作用，而同樣的EEP濃度能抑制一些葡萄球菌的脂肪酶活性和凝固酶活性和生物膜的形成。

張秀喜［24］的研究表明，蜂膠可使金黃色葡萄球菌和大腸桿菌堿性磷酸酶和β-半乳糖酸酶在胞外溶出，且對(duì)金黃色葡萄球菌的作用比大腸桿菌的要強(qiáng)，其抑菌機(jī)理表現(xiàn)為使細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性增大。

2.2破壞菌體細(xì)胞膜及細(xì)胞壁的完整性，使細(xì)菌內(nèi)容物外流

Tim和Lamb［25］通過(guò)比較金黃色葡萄球菌細(xì)菌懸濁液中鉀流失狀況，以研究高良姜素對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響。結(jié)果表明，高良姜素、抑菌抗生素新生霉素和青霉素G對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus NCTC 6571）的MIC分別為50 μg/ml、62.5 ng/ml和31.3 ng/ml，當(dāng)5×107cfu/ml的金黃色葡萄球菌在包含50 μg/ml的高良姜素的無(wú)鉀培養(yǎng)介質(zhì)中12 h后，細(xì)菌活力下降了60倍。1×109cfu/ml的金黃色葡萄球菌在含有50 μg/ml的高良姜素條件下孵育12 h后，比空白組多流失了21%的鉀；新生霉素并不會(huì)造成鉀流失，而細(xì)菌孵育在含有31.3 ng/ml的青霉素G培養(yǎng)介質(zhì)中會(huì)有6%的鉀流失。這些數(shù)據(jù)表明，高良姜素造成的鉀流失可能是由于它對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜造成直接損傷或通過(guò)自溶作用造成間接損傷，即損傷細(xì)胞壁以及接下來(lái)的滲透性溶解。

2.3抑制細(xì)菌毒力因子活性和其相關(guān)基因的表達(dá)，使其侵襲力和毒力下降

姜游帥［26］研究了蜂膠對(duì)金黃色葡萄球菌毒力因子抑制作用，結(jié)果表明蜂膠能抑制金黃色葡萄球菌ATCC29213生長(zhǎng)，MIC為512 μg/ml，并且亞抑菌濃度蜂膠能降低金葡菌溶血活力和凝固酶效價(jià)，降低金葡菌腸毒素A、腸毒素B及α-溶血素表達(dá)量；在基因水平上，亞抑菌濃度蜂膠能減少α-溶血素基因hla和Agr二元調(diào)控系統(tǒng)的agrA mRNA表達(dá)量，而Agr二元調(diào)控系統(tǒng)對(duì)金葡菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期分泌的許多毒力蛋白有調(diào)控作用，對(duì)α-溶血素起到正向調(diào)控的作用。因此，預(yù)測(cè)蜂膠降低α-溶血素的表達(dá)部分依賴于抑制Agr二元調(diào)控系統(tǒng)。

3　研究展望

盡管蜂膠抗病原微生物機(jī)理上的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但研究還是偏少且不夠深入。蜂膠化學(xué)成分復(fù)雜，其抗菌機(jī)理也必然多樣，所以很值得進(jìn)行更深入的研究。

蜂膠中豐富的黃酮及萜烯類物質(zhì)對(duì)抗菌活性的發(fā)揮起到很大的作用，而黃酮及萜烯類物質(zhì)的抗菌機(jī)制主要存在以下幾種［27］：（1）損傷細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜；（2）抑制細(xì)菌核酸合成；（3）干擾細(xì)菌的能量代謝；（4）抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成；（5）抑制細(xì)菌細(xì)胞膜的形成。這些研究對(duì)蜂膠抗菌機(jī)制的深入研究有一定的參考意義。然而需要注意的是，由于一些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不合理，或?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象理解的不當(dāng)，一些實(shí)驗(yàn)結(jié)論可能需要進(jìn)一步驗(yàn)證。例如，黃酮的抗菌機(jī)制到底是一種還是多種存在爭(zhēng)議，因?yàn)闄C(jī)制研究實(shí)驗(yàn)中，存在將原因與結(jié)果混淆的可能。例如，抗菌成分損傷了菌體細(xì)胞膜，會(huì)擾亂質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)，而這會(huì)進(jìn)一步影響ATP產(chǎn)生和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。如果菌體細(xì)胞產(chǎn)生能力和攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力受到影響，緊接著便會(huì)影響其核酸、肽聚糖等合成的能力，這種情況下，單一的作用機(jī)制有可能被誤解為多種作用機(jī)制。蜂膠作為一種成分極為復(fù)雜的混合物，不同的成分其抗菌機(jī)制可能不同，有些成分由于結(jié)構(gòu)的相似性，也可能具有相同的抗菌機(jī)制，所以對(duì)其抗菌機(jī)制的研究最好能建立在對(duì)其單體抗菌成分的研究之上，進(jìn)一步研究蜂膠及其成分究竟是通過(guò)以上所提到的一種還是多種機(jī)制發(fā)揮抗菌作用的。

此外，值得注意的是，關(guān)于蜂膠的抗菌研究，大多研究結(jié)果表明其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性菌的作用，具體機(jī)制尚不是特別清楚。可能是革蘭氏陰性菌復(fù)雜的外膜結(jié)構(gòu)不利于蜂膠進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)揮作用，也有可能是于一些革蘭氏陰性菌特殊的耐藥機(jī)制，如主動(dòng)外排系統(tǒng)［28］。有文獻(xiàn)表明存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的外排泵系統(tǒng)AcrAB-TolC（存在于腸科桿菌）及MexAB-OprM（存在于綠膿桿菌）與革蘭氏陰性菌對(duì)大多數(shù)植物成分耐受有一定關(guān)系［29］。而大腸桿菌及綠膿桿菌等陰性菌對(duì)蜂膠比較耐受的機(jī)理可能與此有很大的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

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國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-45），上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目［（2014）第6-1-1號(hào)］

胡福良，E-mail：flhu@zju.edu.cn