免疫芯片技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

曲信芹，凌紅麗，蔣貽海，趙 明

（青島蔚藍(lán)生物制品有限公司，山東青島 266114）

免疫芯片技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

曲信芹，凌紅麗，蔣貽海，趙 明

（青島蔚藍(lán)生物制品有限公司，山東青島 266114）

免疫芯片是一種高通量、高靈敏度、高特異性的多元檢測(cè)分析技術(shù)，近幾年來呈現(xiàn)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，引起各個(gè)領(lǐng)域廣泛的關(guān)注及重視。本文就免疫芯片技術(shù)的原理、特點(diǎn)，以及在抗生素殘留、 激素類藥物殘留、磺胺類藥物殘留等獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行闡述，以期將免疫芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)研究及實(shí)踐領(lǐng)域。

免疫芯片；獸藥殘留；檢測(cè)

獸藥殘留是指在動(dòng)物用藥后，藥物在動(dòng)物體內(nèi)的化合物、代謝物及雜質(zhì)成分的殘留。目前，國(guó)內(nèi)外已制定了獸藥管理規(guī)范，但獸藥殘留超標(biāo)情況仍十分嚴(yán)重。日常生活中，人們由于科學(xué)知識(shí)的匱乏和經(jīng)濟(jì)利益的誘惑，濫用獸藥及飼料添加劑的情況普遍存在，造成動(dòng)物源性食品中藥物殘留的情況日趨嚴(yán)重，給人類身體健康帶來了嚴(yán)重危害。

隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，人們對(duì)食品安全的重視和關(guān)注程度也不斷增強(qiáng)，畜禽產(chǎn)品藥物殘留嚴(yán)重超標(biāo)成為食品安全潛在的威脅。為了保障食品安全及人類健康，必須對(duì)獸藥殘留進(jìn)行監(jiān)管[1]。實(shí)現(xiàn)監(jiān)管和控制的目標(biāo)，高效靈敏的檢測(cè)方法必不可少。獸藥殘留檢測(cè)方法主要有色譜分析法（氣相、液相）、微生物檢測(cè)法和免疫分析法（酶聯(lián)免疫吸附分析ELISA、膠體金、免疫芯片檢測(cè)）等。這幾種方法存在檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜、靈敏度低、不適應(yīng)大量樣品檢測(cè)分析的缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到限制。近幾年來，免疫芯片技術(shù)的飛速發(fā)展，其特異性強(qiáng)、高通量、快速、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，可有效降低檢測(cè)成本、提高效率，已被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)方面[2]。郭志紅等首次使用蛋白免疫芯片技術(shù)對(duì)豬、雞樣品中克倫特羅、鏈霉素進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其與ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果有很好的一致性，且能同時(shí)檢測(cè)多種藥物?！矮F藥殘留蛋白質(zhì)免疫芯片檢測(cè)系統(tǒng)”的研制成功，是第一個(gè)能夠檢測(cè)肉類樣品中獸藥殘留的生物芯片系統(tǒng)[3]，成為目前動(dòng)物源性食品藥物殘留檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。

1 免疫芯片

生物芯片技術(shù)是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來的高新技術(shù)，并在國(guó)內(nèi)外迅猛發(fā)展。隨著多種不同功能的生物芯片問世，在分子生物學(xué)、疾病的預(yù)防、診斷、新藥開發(fā)、環(huán)境污染監(jiān)測(cè)、農(nóng)獸藥殘留及生物武器等方面廣泛應(yīng)用。生物芯片根據(jù)形態(tài)可分為平面固態(tài)生物芯片和懸浮液態(tài)生物芯片；根據(jù)成分可分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等。縱觀生物芯片的發(fā)展，以蛋白微陣列檢測(cè)用芯片發(fā)展最為迅速[4]，蛋白質(zhì)芯片是將生命科學(xué)與微電子學(xué)相互滲透的新技術(shù)，與基因芯片一樣具有高靈敏度、快速的優(yōu)點(diǎn)，在后基因組計(jì)劃和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及藥物殘留檢測(cè)等方面有著重要的作用。

免疫芯片又稱抗體芯片，是一種最重要的蛋白質(zhì)芯片[5-7]，是指將抗原或抗體包被在固相載體上，通過特異性免疫反應(yīng)捕獲樣品中的目的蛋白，然后經(jīng)過檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)標(biāo)記物質(zhì)信號(hào)強(qiáng)弱進(jìn)行檢測(cè)，從而判定樣品中靶分子的含量。它是在基因芯片之后提出的一種新型生物芯片，可一次性同時(shí)完成幾萬或更多數(shù)量的生物樣品的檢測(cè)分析，成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域中強(qiáng)有力的工具。

1.1 免疫芯片技術(shù)原理

上世紀(jì)80年代，Roger Ekin最早提出蛋白免疫芯片檢測(cè)技術(shù)的原理，免疫芯片上的探針蛋白可根據(jù)研究目的選用抗原、抗體、受體等具有生物活性的蛋白質(zhì)[8]，通過物理或化學(xué)方法將探針高密度固定于芯片上，利用抗原、抗體之間的親和作用與電子芯片高密度集成原理相結(jié)合而產(chǎn)生的一種全新概念的生物芯片檢測(cè)技術(shù)，對(duì)樣品中存在的特定分子進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 免疫芯片技術(shù)特點(diǎn)

免疫芯片的制作過程包括芯片載體表面的化學(xué)處理、抗原或抗體的預(yù)處理、芯片的點(diǎn)印、固定和封阻等。由于該技術(shù)具有探針特異性高、親和力強(qiáng)、敏感性高且受雜質(zhì)影響小，對(duì)生物樣品要求低（尿液、血液、組織和細(xì)胞），可簡(jiǎn)化樣品的前處理過程（離心）的優(yōu)勢(shì)，使其成為臨床生物樣品和蛋白質(zhì)表達(dá)樣品檢測(cè)中的重要力量。因此，免疫芯片技術(shù)具有強(qiáng)大的高通量平臺(tái)優(yōu)勢(shì)[9]，已被科研人員及醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)用到生命研究的各個(gè)領(lǐng)域。

2 免疫芯片在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 抗生素殘留檢測(cè)

抗生素是指微生物在生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的一類具有殺滅或抑制微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)，也可通過人工合成。自青霉素問世以來，各類抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用，不可避免地造成抗生素殘留，對(duì)人們的健康造成潛在的威脅[10]。食品中殘留過量的抗生素使某些致病菌產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響抗生素的療效，人體長(zhǎng)期食入抗生素殘留超標(biāo)的食品會(huì)產(chǎn)生急慢性中毒作用，如氯霉素可引起人體骨髓造血功能障礙、氨基糖苷類對(duì)腎臟造成毒性，甚至引起致癌反應(yīng)。因此，動(dòng)物源性食品中抗生素殘留量要嚴(yán)格控制。

Kloth等建立了一種可再生、定量快速檢測(cè)原料奶中的13種抗生素的免疫芯片方法，檢測(cè)結(jié)果均符合EU組織所制定的官方標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了一份樣品可檢測(cè)多指標(biāo)的目的。Su等[11]根據(jù)間接免疫競(jìng)爭(zhēng)法的原理實(shí)現(xiàn)同時(shí)定量檢測(cè)出牛奶中5種抗生素包括泰樂菌素、四環(huán)素、慶大霉素、鏈霉素、氯霉素的免疫芯片技術(shù)，通過系列優(yōu)化和篩選試驗(yàn)條件，使檢測(cè)靈敏度、穩(wěn)定性及信號(hào)強(qiáng)度都有了顯著提高。同時(shí)與ELISA方法和液相色譜法比較，結(jié)果表明芯片技術(shù)的靈敏度較其他兩種方法高，且操作簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)范圍分別為：泰樂菌素0.026～400ng/mL、慶大霉素 0.4～25.6ng/mL、四環(huán)素 0.05～781.25ng/mL、鏈霉素 0.08～1 250ng/mL、氯霉素0.5～7812.5ng/mL，大大降低牛奶中干擾因子對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，為檢測(cè)試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。免疫芯片技術(shù)降低檢測(cè)的操作步驟，其快速、高通量等特點(diǎn)適合大規(guī)模檢驗(yàn)工作。李周敏、許丹科等[12]采用間接免疫法，在固定有慶大霉素抗原的芯片內(nèi)加入單克隆抗體及納米銀標(biāo)記二抗及銀增強(qiáng)劑顯色劑，實(shí)現(xiàn)了牛奶中慶大霉素可視化蛋白芯片檢測(cè)，該法使慶大霉素的檢測(cè)范圍為0.1～200 ng/mL。Poller等通過研究較優(yōu)的芯片表面化學(xué)處理方法，能夠快速靈敏檢測(cè)牛奶中恩諾沙星的殘留量。

2.2 激素類藥物殘留檢測(cè)

激素類藥物包括皮質(zhì)激素、孕激素、雌激素及β-受體激動(dòng)劑等能調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的代謝活動(dòng)，對(duì)動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖活動(dòng)產(chǎn)生影響的一類藥物。激素類藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留，危及食品衛(wèi)生安全和人類健康。世界各國(guó)對(duì)動(dòng)物源性食品中激素類獸藥的控制越來越嚴(yán)格，對(duì)其檢測(cè)方法也有了更高的要求?？藗愄亓_及萊克多巴胺均可促進(jìn)豬體生長(zhǎng)，減少脂肪含量，提高瘦肉率，因藥效顯著、價(jià)格便宜而大劑量使用在飼料中，一旦食入人體，引起急性中毒，給人類帶來嚴(yán)重危害。

劉天龍等[13]建立了一種方便、穩(wěn)定的檢測(cè)牛奶中頭孢氨芐和萊克多巴胺的免疫芯片技術(shù)，通過對(duì)頭孢氨芐和萊克多巴胺合成抗原包被條件和單克隆抗體的稀釋條件進(jìn)行優(yōu)化，使其對(duì)頭孢氨芐和萊克多巴胺的檢測(cè)限分別為20.59 ng/mL和23.51 ng/mL，處理方法比液相色譜、質(zhì)譜法簡(jiǎn)單、快速。孫來玉、尹莉等[14]建立瘦肉精克倫特羅殘留檢測(cè)免疫芯片方法，通過微陣列技術(shù)將克倫特羅與硝酸纖維素膜結(jié)合，封閉硝酸纖維膜后加待測(cè)樣品和標(biāo)記品，借助標(biāo)記品的發(fā)光強(qiáng)度來測(cè)定鹽酸克倫特羅的濃度，使鹽酸克倫特羅殘留檢測(cè)限為0.10 ng/mL，定量限為0.3 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.5～16.0 ng/mL，該方法具有很高的特異性，未發(fā)現(xiàn)與沙丁胺醇、特布他林、萊克多巴胺、塞曼特羅、酚間羥異丙腎上腺素、異丙腎上腺素等構(gòu)效類似物發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3 磺胺類藥物殘留檢測(cè)

磺胺類藥物是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物，主要通過口服、創(chuàng)傷及飼料添加劑而殘留在動(dòng)物源性食品中，能抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌及少數(shù)陰性菌的生長(zhǎng)繁殖[15]。在近幾十年來，動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量超標(biāo)現(xiàn)象十分嚴(yán)重，多在豬、牛、禽等動(dòng)物源性食品中發(fā)生，農(nóng)業(yè)部235號(hào)令規(guī)定動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物最高限量為100 μg/kg。陳愛亮等[16]設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)便快速的樣品制備方法，能夠從組織樣品同時(shí)提取多種殘留獸藥。該系統(tǒng)可用于畜禽食品中磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、鏈霉素、雙氫鏈霉素、恩諾沙星以及氯霉素的定量檢測(cè)，證明免疫芯片在藥物殘留檢測(cè)中靈敏度、準(zhǔn)確度及交叉反應(yīng)滿足了獸藥殘留檢測(cè)的要求。郭志紅等[17]應(yīng)用蛋白免疫芯片技術(shù)檢測(cè)了豬、雞組織中的鹽酸克倫特羅、鏈霉素、磺胺二甲嘧啶、恩諾沙星的殘留量，并與ELISA法、色譜法和微生物檢測(cè)法做比較，結(jié)果表明蛋白芯片檢測(cè)前處理方法簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果確實(shí)可靠。

免疫芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了獸藥的多殘留檢測(cè)，顯示出并行性和高通量性，集成化和自動(dòng)化，適合大量樣品檢測(cè)，因此成為藥物殘留檢測(cè)發(fā)展的一種趨勢(shì)。它不僅局限于一類藥物的檢測(cè)，也可同時(shí)檢測(cè)多類藥物，顯示出高通量多元檢測(cè)分析的特點(diǎn)。Liu等[18]基于間接競(jìng)爭(zhēng)法的免疫學(xué)檢測(cè)原理，改進(jìn)了免疫芯片抗體固定的方法，實(shí)現(xiàn)了可一次檢測(cè)4 種獸藥（氯霉素、克倫特羅、雌二醇和泰樂菌素）和 3 種農(nóng)藥（阿特拉津、吡蟲啉和甲萘威）的殘留量，比ELISA方法具有更高的靈敏度和可靠性，檢測(cè)方便、快捷、節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間及成本。

3 前景展望

免疫芯片技術(shù)的飛速發(fā)展為人們提供了良好的檢測(cè)手段，而其也存在一些缺點(diǎn)，如芯片需經(jīng)操作復(fù)雜、成本較高的醛基化修飾、瓊脂糖凝膠等工藝，因此限制了免疫芯片的應(yīng)用范圍。發(fā)展安全、健康、和諧的可持續(xù)發(fā)展畜禽養(yǎng)殖業(yè)是當(dāng)代人們前進(jìn)的方向，隨著人們對(duì)食品安全的關(guān)注及要求日益提升，合格的動(dòng)物源性食品是人類健康的重要保證。建立特異性好、靈敏度高的檢測(cè)方法才能滿足當(dāng)前快速準(zhǔn)確檢測(cè)的要求。免疫芯片技術(shù)因其自身的特點(diǎn)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域具有較大的發(fā)展?jié)摿Γ蔀楦咄繖z測(cè)技術(shù)的主體[19]，為獸藥殘留監(jiān)測(cè)提供了可靠的依據(jù)及檢測(cè)手段。

免疫芯片不僅限于獸藥殘留方面的檢測(cè)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究、基因表達(dá)篩選、自身抗體疾病診斷及生物分子間相互作用等方面也有應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外諸多生物公司（美國(guó)Affmetrix、PerkinElmer公司，中國(guó)北京博奧生物芯片有限公司、上海博德基因開發(fā)有限公司等）已將蛋白免疫芯片應(yīng)用于食品安全檢測(cè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深入研究，并開發(fā)出檢測(cè)試劑盒等商業(yè)化產(chǎn)品。免疫芯片技術(shù)將會(huì)繼續(xù)被廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)研究及實(shí)踐領(lǐng)域，隨著新材料、新技術(shù)的發(fā)展和投入，免疫芯片技術(shù)也會(huì)越來越完善，在生物和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中發(fā)揮其最大的作用。

Application of Immunochips in Veterinary Drug Residue Detection

Qu Xinqin，Ling Hongli，Jiang Yihai，Zhao Ming
（Qingdao Vland Biological Products Co. Ltd，Qingdao，Shandong 266114）

Immunochip is a multiple analytical technique of high throughput，high sensitivity and high specificity with rapid development in recent years and has aroused wide attention in variousfields. The principle of immunochip technology，characteristics and application in the veterinary drug residues detection were described in this paper in an attempt to promote its application in biological research and practicalfield.

immunochip；veterinary drug residue；detection

S859.79 文獻(xiàn)識(shí)別碼：A

1005-944X（2015）10-0021-04

青島市國(guó)際合作項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：13-1-4-272-hz）

課題名稱：動(dòng)物源性疫病高通量快速檢測(cè)免疫芯片的研制與開發(fā)

凌紅麗

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白雅娟）