錦鯉皰疹病毒病簡(jiǎn)述

段宏安，周 毅 ，徐 曄，姚燕林，丁 超，曹 潔，范廣宇，孟祥龍

（連云港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇連云港 222042）

錦鯉皰疹病毒病簡(jiǎn)述

段宏安，周 毅 ，徐 曄，姚燕林，丁 超，曹 潔，范廣宇，孟祥龍

（連云港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇連云港 222042）

錦鯉皰疹病毒病是一種危害嚴(yán)重，尚無有效治療方法的高致病性傳染病。本文匯集大量科研成果，從病原學(xué)、流行病學(xué)、病理學(xué)三個(gè)角度對(duì)該病毒的特性進(jìn)行簡(jiǎn)述，在此基礎(chǔ)上，推薦了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，提出了防控建議。

錦鯉皰疹病毒??；KHV；病原學(xué)；流行病學(xué)；病理學(xué)；預(yù)防與控制；檢測(cè)技術(shù)

錦鯉皰疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD）是由錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）感染鯉魚及錦鯉等變種而引起的一種高致病性急性傳染病。以色列和德國于1998年首次報(bào)道KHVD，英國1996年從大量死亡鯉魚組織樣本中檢測(cè)出KHV DNA，目前該病在世界范圍內(nèi)流行。其危害已引起世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）的高度關(guān)注。

1 病原學(xué)

1.1 分類

病原為異樣皰疹病毒科鯉皰疹病毒屬鯉皰疹病毒3型（CyHV-3）[1-2]，曾稱為鯉間質(zhì)性腎炎和鰓壞死病毒（CNGV）[3]，同屬還有鯉皰疹病毒1型（CyHV-1，鯉痘病毒、魚乳頭狀瘤病毒）和2型（CyHV-2，金魚造血器官壞死病毒）。KHV與CyHV-1和CyHV-2病毒部分基因組的序列密切相關(guān)，與斑點(diǎn)叉尾鮰病毒（IcHV-1）和蛙皰疹病毒（RaHV-1）距離較遠(yuǎn)[4]。

Aoki等[5]研究發(fā)現(xiàn)來自以色列、美國和日本的三株病毒在基因水平上高度相似，三株中以色列和美國株的關(guān)系更密切，這三株病毒可能來源于同一野生父本的2個(gè)譜系（J -日本譜系、U/I-以色列/美國譜系）。Kurita等[6]推測(cè)2個(gè)譜系存在遺傳差異，分別稱為歐洲（包括U和I基因型）和亞洲譜系（包括J基因型），歐洲譜系有7個(gè)變異型E1至E7，亞洲譜系只有2個(gè)變異型A1和A2[6]。對(duì)法國、荷蘭和波蘭KHV樣品研究發(fā)現(xiàn)，還存在第三譜系，據(jù)推測(cè)是隨錦鯉引入歐洲的[7]。印度尼西亞發(fā)現(xiàn)可能還有一個(gè)譜系[8]。

1.2 生物學(xué)特性

KHV具有典型的二十面體結(jié)構(gòu)，核衣殼直徑為100～110nm[3]，外被含病毒蛋白的脂質(zhì)囊膜，以及位于核衣殼與囊膜間的無定形蛋白層。病毒顆粒直徑167～200nm。

1.3 基因組結(jié)構(gòu)和功能

該病毒為線形雙股DNA病毒，基因組大小295kb[3]。DNA分子包括一個(gè)大的中央?yún)^(qū)及兩個(gè)22kb、分布在二端的重復(fù)區(qū)[9]。據(jù)推測(cè)病毒基因組含有156個(gè)開放性閱讀框（ORF），其中8個(gè)（ORF1～8）為末端重復(fù)序列，9個(gè)ORF具有內(nèi)含子。目前KHV大多數(shù)ORF未確定功能。Michel等[10]研究鑒定40種結(jié)構(gòu)蛋白，其中3種編碼衣殼蛋白、13種為囊膜蛋白、2種為皮層蛋白、22種是未定性的結(jié)構(gòu)蛋白。ORF81是研究較清楚者之一，編碼3型膜蛋白，位于病毒囊膜上。其表達(dá)產(chǎn)物據(jù)認(rèn)為是KHV最具免疫原性的膜蛋白之一。

1.4 病毒抵抗力

KHV在22℃池塘水中可存活4h，在糞便和池塘淤泥中可能存活較長(zhǎng)時(shí)間。病毒在60℃30 min或 35℃ 2d、pH低于3或高于11的條件下失活。并且易被氯仿、25%乙醚或0.1%的Triton X-100滅活[11-12]。病毒經(jīng)紫外線照射和50℃以上1min滅活。在15℃時(shí)，下列消毒劑作用可滅活病毒：200mg/L碘伏20min，60mg/L苯扎氯銨 20min，30%乙醇20min，次氯酸鈉200 mg/L 30s[13]。

2 流行病學(xué)

2.1 歷史及地理分布

以色列和德國于1998年首次報(bào)道KHVD，目前該病毒已傳播至奧地利、比利時(shí)、丹麥、法國、意大利、盧森堡、荷蘭、波蘭、瑞典、英國、中國香港、中國臺(tái)灣、印度尼西亞、日本、韓國、馬來西亞、新加坡和泰國。南非、加拿大和美國也曾報(bào)道過發(fā)生KHVD。據(jù)此推斷，可能有更多的國家或地區(qū)存在KHV。

2.2 易感動(dòng)物

KHV傳染性和毒力極強(qiáng)，宿主范圍小，僅感染鯉魚、錦鯉及其普通變種。一些雜交品種也可感染KHV[12]。所有階段的魚體都可能感染KHV。死亡率與養(yǎng)殖密度有關(guān)，網(wǎng)箱養(yǎng)殖死亡率為50%～80% ，最高可達(dá)100%。

2.3 季節(jié)性

該病主要受水溫影響，易發(fā)水溫為18℃～28℃，23℃～28℃容易引起暴發(fā)流行。魚可在較低水溫下感染但不表現(xiàn)臨床癥狀，恢復(fù)到容許水溫時(shí)則呈現(xiàn)典型的疾病特征和發(fā)生死亡現(xiàn)象[12]。

2.4 傳播方式和傳染源

KHV主要依靠水平傳播，但目前也不能排除垂直傳播[13]。KHVD 傳染源是臨床感染魚或養(yǎng)殖、野生魚中潛藏的病毒攜帶者，病毒通過糞便、尿液、鰓和皮膚粘液排出體外。

該病可通過接觸病魚，或者是被污染了的水體、底泥等傳播[12]。鰓壞死是該病的主要癥狀之一，在發(fā)病早期的鰓組織中就可檢測(cè)到病毒DNA。另有研究表明，鯉魚的皮膚是KHV的主要侵入途徑。KHV侵入魚體后，在腎臟中大量增殖[14]。

水溫是決定錦鯉皰疹病毒病發(fā)病的主要原因，23℃～25℃下病程發(fā)展迅速，但在低于23℃時(shí)病程稍慢。水溫不適宜時(shí)，易感品種感染病毒但不發(fā)病，與KHV暴發(fā)后幸存的魚共同成為疾病的傳播者。

3 病理學(xué)

3.1 臨床癥狀

發(fā)病魚離群、嗜睡，聚集在入水口或池塘邊，浮在水面大口呼吸。一些魚可能身體失衡，無方向感。有些魚可能躁動(dòng)不安，然后是不活躍期。皮膚蒼白或發(fā)紅，或質(zhì)地粗糙（砂紙樣），局部或全部上皮脫落，皮膚或鰓粘液分泌過度或不足，鰓蒼白。皮膚和鰭根部出血，以及鰭條糜爛[13]。魚眼凹陷，類似寄生蟲感染和細(xì)菌感染；出現(xiàn)癥狀后24～48h后開始死亡，至2～4d內(nèi)死亡率可迅速達(dá)80%～100%[11]

3.2 病理變化及發(fā)病機(jī)理

感染KHV后病魚最明顯的損傷是鰓、腎臟、肝臟和脾臟。鰓絲變?yōu)樯罴t色，鰓片減少，鰓結(jié)構(gòu)消失，鰓弓內(nèi)血管充血。病變以腎臟為重，腎臟充血、出血；腎小管周圍出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)、間質(zhì)性炎癥。管狀上皮細(xì)

胞輕微變性。肝胰臟腫大，呈灰白色；肝實(shí)質(zhì)炎性浸潤(rùn)或出血。脾臟變紫紅色，出血；腸道充血，腸系膜出血；局灶性腦膜和腦膜旁炎癥[12，15]。據(jù)認(rèn)為KHV發(fā)病機(jī)理是：病毒通過鰓進(jìn)入魚體后，在鰓或在腎臟大量增殖，上皮細(xì)胞壞死脫落，釋入水中的病毒再次感染健康鯉魚或錦鯉。

4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

4.1 樣品采集

《OIE水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》推薦優(yōu)先采集出現(xiàn)臨床癥狀的垂死或新近死亡魚[13]，將活魚或在無菌密封容器中單獨(dú)包裝的死魚盡快送到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，立即取內(nèi)臟樣品。整條魚或內(nèi)臟應(yīng)用冷藏容器或置于冰上快速送往實(shí)驗(yàn)室，避免冷凍。冷凍魚或內(nèi)臟、以及保存在80%～100%乙醇中的少量組織樣品，只適合于PCR等檢測(cè)方法。當(dāng)用PCR方法檢測(cè)臨床感染魚，特別是進(jìn)行病毒分離時(shí)，應(yīng)避免混樣，或最多2條魚混合為一個(gè)樣品。用PCR方法對(duì)臨床健康魚監(jiān)測(cè)時(shí)，最多每5條魚混合為一個(gè)樣品。

當(dāng)用PCR方法檢測(cè)臨床感染魚，特別是進(jìn)行病毒分離時(shí)，建議采集鰓、腎和脾組織。當(dāng)用PCR檢測(cè)亞臨床、外表健康魚，建議同時(shí)采集小腸（腸道）和腦。

4.2 病原檢測(cè)方法

4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)

OIE推薦的敏感細(xì)胞系目前有KF和CCB（錦鯉鰭條細(xì)胞系和鯉魚腦細(xì)胞系），組織病料接種KF或CCB后置于20℃～22℃培養(yǎng)14天，連傳2代。有報(bào)道5～7d后出現(xiàn)細(xì)胞病變，但有學(xué)者認(rèn)為KF對(duì)KHV不敏感。這兩種細(xì)胞系獲取較為困難。另外，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)并不像PCR方法敏感，因此認(rèn)為細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒并不是一種可靠的KHVD診斷方法。朱霞等[16-17]在國內(nèi)首次利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離到KHV，我國其他學(xué)者嘗試建立鯉魚或錦鯉原代或傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖KHV取得了成功。

4.2.2 分子生物學(xué)方法

4.2.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR是目前檢測(cè)KHV感染的較為常用且精確的方法。Gilad等[18]建立了區(qū)別KHV、CyHVIcHV-1的PCR方法。Ishioka T等[19]研究發(fā)現(xiàn)日本的分離株和他國毒株有相近關(guān)系。OIE[13]推薦的方法可以檢測(cè)亞臨床狀況的KHV病毒，使用2對(duì)引物，第1對(duì)是TK引物，第2對(duì)是經(jīng)過改進(jìn)的。Gilad等[20]建立了TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)KHV。

劉葒等[21]建立了nested- PCR方法，初步證實(shí)了2002年廣東進(jìn)口錦鯉暴發(fā)病的病原為KHV。烏日琴等[22]研究發(fā)現(xiàn)異硫氰酸胍抽提法、PQDS和PQDV引物對(duì)檢測(cè)KHV效果好。范萬紅等[23]建立了KHV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法.段宏安等[24-25]用2對(duì)引物對(duì)錦鯉KHV病例進(jìn)行了PCR+酶切檢測(cè)鑒定。還有一些中國學(xué)者建立了三種基因、熒光定量PCR等方法檢測(cè)KHV DNA。

PCR方法容易在已經(jīng)發(fā)病魚樣品中檢測(cè)出KHV陽性，對(duì)外表健康魚較難檢測(cè)出陽性，也就是無法檢測(cè)潛伏感染或攜帶者體內(nèi)病毒，很容易出現(xiàn)假陰性，操作不當(dāng)還可出現(xiàn)假陽性。

4.2.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

Gunimaladevi I等[26]和Soliman H等[27]建立了LAMP法，可在90min內(nèi)判定結(jié)果，并在產(chǎn)物中加入SYBR Green I，根據(jù)顏色變化判定結(jié)果。

除了上述方法外還有ELISA、電鏡及原位雜交技術(shù)等。劉亭岐[28]建立了檢測(cè)KHV抗體的間接ELISA方法。

5 預(yù)防和控制

到目前為止，對(duì)該病尚無切實(shí)有效的治療方法。以色列的科學(xué)家將KHV在KF細(xì)胞連續(xù)傳代，最終獲得了致病力很弱的KHV毒株，對(duì)KHV產(chǎn)生一定的抵抗力。攻克治療難關(guān)，研制安全有效的疫苗是未來發(fā)展的方向。

目前，應(yīng)采用綜合防制措施防控KHVD。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善和優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境；提高養(yǎng)殖種群和養(yǎng)殖群體的免疫力。加強(qiáng)產(chǎn)地檢疫，不從疫區(qū)引進(jìn)苗種。要求外來魚同本地魚隔離養(yǎng)殖，水體、器具也不應(yīng)混用。對(duì)新引進(jìn)的魚至少隔離30d。最好是了解鯉魚供貨方情況，在買魚時(shí)詢問他們是否有不明病因的病害損失，是否通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)KHV

病毒。在參加錦鯉鑒評(píng)大賽（展會(huì)）時(shí)，不要把不同來源的魚放在一起進(jìn)行品評(píng)；參賽（展）魚回場(chǎng)后要隔離檢疫至少三周。回場(chǎng)或新引進(jìn)錦鯉在隔離時(shí)，放幾條本地錦鯉進(jìn)去，看是否有發(fā)病，以此判斷是否會(huì)產(chǎn)生交叉感染。對(duì)已發(fā)病的池塘或地區(qū)首先進(jìn)行封鎖，禁止向外轉(zhuǎn)移動(dòng)物和器具，不外排池水。工具未經(jīng)消毒不在其它池使用。飼養(yǎng)人員要勤于清除發(fā)病死亡尸體，及時(shí)掩埋、銷毀。對(duì)發(fā)病魚類及時(shí)做出診斷，確立對(duì)策指導(dǎo)疾病防治和控制疫情流行。對(duì)錦鯉、鯉魚或觀賞魚進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)有疑似病例的養(yǎng)殖場(chǎng)要按照規(guī)定實(shí)施隔離監(jiān)管并做好防疫消毒工作，對(duì)確診病例要進(jìn)行深埋或銷毀等無害化處理措施。

[1] Haramoto E，Kitajima M，Katayama H，et al. Detection of koi herpesvirus DNA in river water in Japan[J]. J Fish Dis，2007，30：59-61.

[2] Waltzek T B，Kelly G O，Alfaro M E，et al. Phylogenetic relationships in the family Alloherpesviridae[J]. Dis Aquat Org，2009，84（3）：179-194.

[3] Ilouze M，Davidovich M，Diamant A，et al. The outbreak of carp disease caused by CyHV-3 as a model for new emerging viral diseases in aquaculture：a review[J]. Ecol Res，2011，26（5）：885-892.

[4] Waltzek T B，Kelley G O，Stone D M，et al. Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus（CyHV-3）in the family Herpesviridae[J]. J GenVirol，2005，86：1659-1667.

[5] Aoki T，Hirono I，Kurokawa K，et al. Genome sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of an emerging disease threatening koi and common carp worldwide[ J]. Virol，2007，81（10）：5058-5065.

[6] Kurita J，Yuasa K，Ito T，et al. Molecular epidemiology of koi herpesvirus[J]. Fish Pathology，2009，44（2）：59-66.

[7] Bigarre L，Baud M，Cabon J，et al. Differentiation between Cyprinid herpesvirus type-3 lineages using duplex PCR[J]. J Virol Methods ，2009，158：51-57.

[8] Sunarto A，Mccoll K A，Crane M S，et al. Isolation and characterization of koi herpesvirus（KHV）from Indonesia：identification of a new genetic lineage[J]. J Fish Dis，2011，34（2）：87-101.

[9] Rakus K，Ouyang P，Boutier M，et al.Cyprinid herpesvirus 3：an interesting virus for applied and fundamental research[J]. Vet Res. 2013，27：44-85.

[10] Michel B，Leroy B，Stalin Raj V，et al.The genome of cyprinid herpesvirus 3 encodes 40 proteins incorporated in mature virions[J]. J Gen Virol，2010，91（2）：452-462.

[11] Ilouze M，Dishon A，Kotler M. Characterization of a novel virus causing a lethal disease in carp and koi[J]. Microbiol Mol Biol Rev，2006，70（1）：147-156.

[12]朱霞，王好，李新偉，等.錦鯉皰疹病毒病的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2011（1）：106-110.

[13] OIE.Chapter 2.3.6.Koi herpesvirus disease. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2014.http：//www.oie. int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.3.06_ KHVD.pdf，2014.

[14] Hedrick R R，Gilad O，Yun S，et al. A herpesvirus associate with mass mortality of juvenile and adult koi，a strain of a common carp[J]. J Aquat Anim. Health，2000，12：44-57.

[15] Kielpinski M，Kempter J，Panicz R，et al.Detection of KHV in freshwater mussels and crustaceans from ponds with KHV history in common carp（Cyprinus carpio）[J]. Isr J Aquacult Bamid，2010，62（1）：28-37.

[16]朱霞，李新偉，王好，等.一株錦鯉皰疹病毒的分離與鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011（5）：340-343.

[17]朱霞.框鏡鯉原代細(xì)胞培養(yǎng)和錦鯉皰疹病毒的分離鑒定[D].吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[18] Gilad O，Yun S，Adkison M A，et al. Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen，koi herpesvirus，and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi[J]. J Gen Virol，2003，84：2661-2667.

[19] Ishioka T，Yoshizumi M，Izumi S，et al. Detection and sequence analysis of DNA polymerase and major envelope protein genes in koi herpesviruses derived from Cyprinus carpio in Gunma prefecture，Japan[J].Vet Microbiol，2005，110（1/ 2）：27-33.

[20]Gilad O，Yun S，F(xiàn)rancisco J，et al．Concentrations of a Koi herpesvirus（ KHV）in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR[J]. Diseases of aquatic organisms，2004，60（3）：179-187．

[21]劉葒，史秀杰，高隆英，等.進(jìn)口錦鯉暴發(fā)病病原的nested-PCR鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002（5）：414-418.

[22]烏日琴，劉中勇，黃寶春.PCR方法快速檢測(cè)錦鯉皰疹病毒基因[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2005（2）：6-8.

[23]范萬紅，劉葒，岳志芹，等.錦鯉皰疹病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007（5）：785-788，722.

[24]段宏安，張睿，徐曄，等.錦鯉皰疹病毒PCR檢測(cè)鑒定初報(bào)[C]//中國微生物學(xué)會(huì).2006中國微生物學(xué)會(huì)第九次全國會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集.北京：中國微生物學(xué)會(huì)，2006：1.

[25]段宏安，張睿，徐曄，等. 錦鯉皰疹病毒的PCR鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2008（11）：78-80.

[26] Gunimaladevi I，Kono T，Venugopal M N，et al.Detection of koi herpesvirus in common carp，Cyprinus carpioL by loop mediated isothermal amplification[J]．J Fish Dis，2004，27（10）：583-589．

[27]Soliman H，El-Matboull M．An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus（ KHV）infection by loop mediated isothermal amplification[J]. Virol J，2005，2：83．

[28]劉亭岐.錦鯉皰疹病毒抗體血清學(xué)檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

Koi Herpesvirus Disease

Duan Hongan ，Zhou Yi，Xu Ye，Yao Yanlin，Ding Chao，Cao Jie，F(xiàn)an Guangyu，Meng Xianglong
（Lianyungang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of P.R.China，Lianyungang，Jiangsu 222042）

Koi herpesvirus disease（KHVD）is a serious and highly infectious disease and there is still no effective treatment for it at home and abroad. In the paper，the characteristics of the virus were described based on research findings from its etiology，epidemiology and pathology. Laboratory test techniques were recommended and prevention and control measures were proposed.

Koi herpes virus；KHV；etiology；pathology；epidemiology；prevention and control；laboratory technology

S943

A

1005-944X（2015）06-0048-05

質(zhì)檢公益項(xiàng)目201310221