多糖基質(zhì)蛋白質(zhì)分子印跡聚合物研究進(jìn)展

駱薇,張迎慶

(湖北工業(yè)大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430068)

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多糖基質(zhì)蛋白質(zhì)分子印跡聚合物研究進(jìn)展

駱薇,張迎慶Δ

(湖北工業(yè)大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430068)

多糖基質(zhì)分子印跡材料具有良好的生物親和性、親水性和膠凝性，并能與模板蛋白形成弱相互作用，是得天獨(dú)厚的蛋白質(zhì)分子印跡聚合物材料。文章主要綜述了蛋白質(zhì)分子印跡方法、機(jī)理、蛋白質(zhì)分子印跡聚合物、多糖基質(zhì)的蛋白質(zhì)分子印跡的制備及印跡效果評(píng)價(jià)，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

蛋白質(zhì)；分子印跡；多糖；聚合物；效果評(píng)價(jià)

分子印跡技術(shù)是基于其印跡聚合物的高度親和性和特異選擇性，從而能夠識(shí)別特定分子的一種新型技術(shù)[1-2]。蛋白質(zhì)分子印跡聚合物具有對(duì)模板蛋白分子的選擇性識(shí)別能力，蛋白質(zhì)分子印跡技術(shù)在復(fù)雜生物大分子混合物的分離純化、抗體和受體模擬以及仿生傳感器等諸多領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。

1 蛋白質(zhì)分子印跡技術(shù)

1.1 分子印跡技術(shù) 分子印跡技術(shù)可以定義為通過特定模板導(dǎo)向的聚合物對(duì)特定物質(zhì)的重結(jié)合技術(shù)[4]。它通常涉及功能單體的共聚、與模板分子的交聯(lián)以及模板分子的去除過程[5]。當(dāng)模板分子(印跡分子)與聚合物單體接觸時(shí)會(huì)形成多重作用點(diǎn)，通過聚合過程這種作用就會(huì)被記憶下來，當(dāng)模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子空間構(gòu)型相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，這樣的空穴將對(duì)模板分子及其類似物具有選擇識(shí)別特性[6]。

迄今為止，分子印跡技術(shù)已經(jīng)在小分子如氨基酸、類固醇、碳水化合物、農(nóng)藥、藥物、染料、金屬離子等不同領(lǐng)域取得成功[7]。

1.2 蛋白質(zhì)分子印跡 現(xiàn)今對(duì)于小分子的印跡在很多領(lǐng)域都取得了成功，技術(shù)也相對(duì)成熟，但對(duì)于生物大分子特別是蛋白質(zhì)的分子印跡技術(shù)仍未有很大的進(jìn)展。現(xiàn)今蛋白質(zhì)分子印跡的方法有包埋法、表面印跡法和抗原決定基法，包埋法是最常用的方法。

與小分子印跡相比，蛋白質(zhì)分子印跡存在以下幾個(gè)難點(diǎn)：①蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜易失活，對(duì)聚合中的單體、交聯(lián)劑、引發(fā)方式以及識(shí)別體系有特殊要求。蛋白質(zhì)分子上帶有電荷或非極性基團(tuán)，易發(fā)生較嚴(yán)重的非特異性吸附；蛋白質(zhì)為水溶性分子，需要實(shí)現(xiàn)水相中聚合及識(shí)別，而水的極性很大程度地影響材料與蛋白質(zhì)分子之間的氫鍵作用，削弱了印跡效果。②難產(chǎn)生確定的識(shí)別位點(diǎn)。高交聯(lián)度可保證單體材料結(jié)合于模板周圍形成牢固的識(shí)別位點(diǎn)，然而，高交聯(lián)度會(huì)阻止蛋白質(zhì)大分子自由進(jìn)出聚合物網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致模板分子難以脫除，以及重結(jié)合過程中難以進(jìn)入印跡位點(diǎn)。同時(shí)，由于蛋白質(zhì)為非剛性的生物大分子，需要印跡材料兼有適宜的剛性和柔性，既能形成確定的識(shí)別位點(diǎn)，又能與蛋白質(zhì)分子柔性對(duì)接[8-9]。

因而，研究建立高效識(shí)別的蛋白質(zhì)分子印跡體系及對(duì)識(shí)別機(jī)理的探索極具挑戰(zhàn)，并對(duì)于推進(jìn)蛋白質(zhì)分子印跡技術(shù)在各領(lǐng)域廣泛深入的應(yīng)用具有重要意義。

2 蛋白質(zhì)分子印跡機(jī)理

深入系統(tǒng)的研究影響蛋白質(zhì)分子印跡選擇性識(shí)別效率的機(jī)理尚非常缺乏，最迫切需要解決的關(guān)鍵問題是：一方面需要減少非特異性吸附，因蛋白質(zhì)上帶有電荷或非極性基團(tuán)，易發(fā)生的較嚴(yán)重的非特異性吸附。另一方面需增強(qiáng)識(shí)別親和力，這對(duì)印跡材料提出了特別的要求。

Verheyen等[10]研究了目前主要的蛋白質(zhì)印跡基質(zhì)材料，包括最常用的單體丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸等，以及生物親和性好的生物分子如殼聚糖、環(huán)糊精、瓊脂糖等，經(jīng)結(jié)果的分析及重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)：?jiǎn)误w和模板間強(qiáng)靜電相互作用將導(dǎo)致非常高的非特異性結(jié)合，且至今無證據(jù)顯示，這種強(qiáng)靜電相互作用將有利于印跡效果的提高。另一方面也指出，不荷電的印跡基質(zhì)材料是否是更適宜的高親和印跡聚合物依然值得探索，因?yàn)樽匀唤缰?，抗原和抗體或者受體與其配體間的高親和力不僅來源于氫鍵作用，靜電作用和疏水作用也起著重要作用。模板蛋白和材料間的氫鍵作用雖具非特異性小的優(yōu)點(diǎn)，但作用力弱，尤其是水溶液中水的極性對(duì)其影響很大。如何增強(qiáng)結(jié)合親和力又成為一個(gè)大問題。近期的一系列研究也引起了人們的普遍關(guān)注。Haupt等[11]以胰蛋白酶為模板和模型酶，在制備胰蛋白酶印跡納米粒時(shí)，功能單體中含有基于其小分子抑制劑氨基苯甲脒的單體，印跡粒子表現(xiàn)出非常高的結(jié)合選擇性和親和能力。在此基礎(chǔ)上，Zhang等[11]構(gòu)建了含有苯甲脒的單體的核殼型印跡微球，不僅對(duì)模板胰蛋白酶分子有高親和性，而且由于酶與印跡口袋間強(qiáng)的長距離次級(jí)相互作用的形成，顯示出比小分子抑制劑高的抑制效果。Liu等[12]將金屬離子親和層析與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，在SiO2球表面固載Cu2+制備核殼型分子印跡微球，采用金屬離子作為印跡蛋白質(zhì)的錨合位點(diǎn)，極大提高了模板蛋白的洗脫效率與重結(jié)合能力，同時(shí)也為增強(qiáng)模板蛋白與印跡材料間親和力提供了新的機(jī)理。

3 蛋白質(zhì)分子印跡聚合物

分子印跡聚合物材料是能夠識(shí)別特定目標(biāo)分子并能使其從一個(gè)復(fù)雜混合物中特異地分離出來的高分子材料[13]。丙烯酰胺是最常見的化學(xué)印跡功能單體，常與N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺共聚形成聚合物，現(xiàn)已有的蛋白質(zhì)分子印跡大多是用丙烯酰胺作為聚合物材料。另外，3-氨基苯基硼酸、甲基丙烯酸-2-(二甲基氨基)乙酯、4-(乙烯基)芐基亞氨基乙酰乙酸銅和硅烷化試劑如(APTES)和正硅酸乙酯(TEOS)等都能作為聚合物材料[14]。

目前國內(nèi)外報(bào)道的蛋白質(zhì)分子印跡方法主要圍繞著蛋白質(zhì)模板分子在材料中的傳質(zhì)問題展開。在傳統(tǒng)的整體聚合印跡法中，整個(gè)蛋白質(zhì)分子固定在聚合物骨架中，經(jīng)粉碎后洗脫模板蛋白形成三維印跡孔穴，該法不可避免地會(huì)有一定量的模板蛋白殘留于材料內(nèi)部無法洗脫，并存在吸附慢的問題。表面印跡法在聚合物的表面或近表面構(gòu)造模板蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，包括各種蛋白質(zhì)分子印跡膜和表面印跡微球。該法方便了蛋白質(zhì)分子的洗脫和結(jié)合，使分子印跡技術(shù)由3D走向2D[15-18]。近年來發(fā)展的納米結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子印跡材料進(jìn)一步從微米減少至納米(亞微米)尺度，包括印跡納米絲、納米粒、核-殼印跡納米球等，大大提高了表面積，可顯著提高特異吸附容量，進(jìn)一步提高模板蛋白的傳質(zhì)速度[19-22]。另有抗原決定簇印跡，不用整個(gè)蛋白質(zhì)分子為模板，而以抗原蛋白質(zhì)能被抗體識(shí)別的一小段多肽為模板分子進(jìn)行印跡，材料通過對(duì)多肽的識(shí)別而結(jié)合抗原蛋白，多肽模板價(jià)廉易得，且避免了以整個(gè)蛋白質(zhì)為模板的印跡傳質(zhì)問題，但該法識(shí)別效果有待提高，且對(duì)識(shí)別位點(diǎn)尚不清楚的蛋白不適用[23-24]。

4 多糖基質(zhì)蛋白質(zhì)分子印跡聚合物

多糖基質(zhì)的印跡材料有更好的生物相容性，優(yōu)良的親水性和膠凝性，對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子的印跡有著優(yōu)越的天然條件。和抗體相比，多糖基質(zhì)的分子印跡材料容易尋找，價(jià)格更加便宜，并且儲(chǔ)存和運(yùn)輸也更加方便。多糖類具有易于化學(xué)改性的特點(diǎn)，可以通過表面接枝的方法連接上其他的功能基團(tuán)，如殼聚糖和蛋白質(zhì)有著天然的相容性，并且有著巨大的吸附量，它可以直接作為功能單體也可以作為載體進(jìn)行包埋。同時(shí)多糖基質(zhì)材料可與模板分子形成氫鍵弱相互作用，減少非特異性吸附，獲得對(duì)模板蛋白的高選擇性識(shí)別?，F(xiàn)今研究較多的是殼聚糖，另外，瓊脂糖、淀粉、葡聚糖等也都可以作為天然聚合物。所以，對(duì)天然印跡聚合物的研究和開發(fā)也是今后蛋白質(zhì)分子印跡的主要研究方向。

4.1 二糖表面蛋白質(zhì)分子印跡聚合物 有文獻(xiàn)報(bào)道[25]將蛋白質(zhì)吸附在親水的、分子級(jí)平坦的云母表面，然后將一個(gè)二糖類分子薄層覆蓋在吸附的蛋白質(zhì)上。一經(jīng)干燥，該糖層便通過大量的氫鍵與蛋白質(zhì)絡(luò)合。隨后將一個(gè)平坦的含氟聚合物薄膜通過發(fā)光放電等離子體與糖分子交聯(lián)而沉積。接著去除云母并溶解蛋白質(zhì)，最終形成一種多糖覆蓋的、具有蛋白質(zhì)形狀的納米凹坑。該方法表現(xiàn)出較好的選擇性識(shí)別效果。

4.2 殼聚糖基質(zhì)蛋白質(zhì)分子印跡聚合物 Li等[26]利用殼聚糖作為功能單體制備出多糖基質(zhì)的牛血清白蛋白表面分子印跡。他們將高度交聯(lián)的殼聚糖制成微球，加入牛血清白蛋白后，通過亞胺鍵共價(jià)固定在殼聚糖表面的功能基團(tuán)上，經(jīng)模板洗脫后得到能夠特異性吸附牛血清白蛋白的殼聚糖微球固定模板。

Yang等[27]用一種簡(jiǎn)單的方法制備出能夠分離溶菌酶的殼聚糖分子印跡。他們將殼聚糖修飾上醛基，以便于蛋白質(zhì)能夠很好地固定在殼聚糖表面，然后通過溶膠-凝膠法引入2種有機(jī)硅氧烷，最后洗脫模板，得到殼聚糖印跡。經(jīng)過吸附實(shí)驗(yàn)表明，該分子印跡的吸附容量可以達(dá)到15.89 mg/g，并且在混合蛋白溶液中，也能夠?qū)θ芫副憩F(xiàn)出很高的選擇性。

關(guān)懷民等還用殼聚糖制備出血紅蛋白分子印跡。將殼聚糖進(jìn)行改性，制備出羧甲基殼聚糖-甲基丙烯酸縮水甘油酯衍生物作為功能單體，再以血紅蛋白為模板分子，制備出能識(shí)別血紅蛋白的分子印跡聚合物。將制得的印跡分子及非印跡分子分別在聚苯乙烯微孔板上進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該制備出的印跡分子不僅具有很高的對(duì)血紅蛋白的吸附性，而且在和血紅蛋白結(jié)構(gòu)相似物溶菌酶的吸附對(duì)比上發(fā)現(xiàn)其具有高度的識(shí)別特異性[28]。

Wang等[29]用修飾了氨基苯硼酸的殼聚糖作為功能單體，制備出牛血清白蛋白分子印跡。通過平衡吸附實(shí)驗(yàn)以及高效液相進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果表明，制備出的殼聚糖分子印跡具有對(duì)模板分子的高度親和性，并且其吸附可逆性好，即使在惡劣的流動(dòng)相環(huán)境下，依然可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行很好的分離。

4.3 淀粉基質(zhì)蛋白質(zhì)分子印跡聚合物 王紅飛等[30]將淀粉進(jìn)行改性后得到的羧甲基淀粉-氨基苯酚偶聯(lián)物作為功能單體，牛血清白蛋白為模板，2者混合后攪拌1 h使其混合均勻，然后在過氧化氫和過氧化酶的作用下發(fā)生凝膠化反應(yīng)，得到分子印跡凝膠，用相同的方法制得非印跡凝膠。再分別用2%十二烷基磺酸鈉-乙酸溶液進(jìn)行洗滌直至在紫外278 nm處無吸收峰為止，最后再用大量水洗去殘余的洗脫液。經(jīng)吸附實(shí)驗(yàn)表明，印跡和非印跡凝膠均對(duì)牛血清白蛋白有一定的吸附作用，但印跡凝膠的吸附容量是非印跡凝膠的2倍。另外，作者用干酪素作為對(duì)照檢驗(yàn)該分子印跡的選擇性，結(jié)果表明，該分子印跡對(duì)牛血清白蛋白的吸附量遠(yuǎn)大于對(duì)干酪素的吸附量，并且識(shí)別的能力與模板分子的用量成正比。

4.4 瓊脂糖基質(zhì)蛋白質(zhì)分子印跡聚合物 Lin等[31]制備出能夠識(shí)別牛血清白蛋白和血紅蛋白的瓊脂糖凝膠膜。他們將瓊脂糖用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)后制成薄膜，然后將模板蛋白印跡在瓊脂糖凝膠膜表面。經(jīng)吸附實(shí)驗(yàn)表明，分別與未經(jīng)印跡的瓊脂糖膜相比較，印跡了牛血清白蛋白的瓊脂糖薄膜的吸附容量是未經(jīng)印跡薄膜的3.77～5.72倍，而血紅蛋白印跡膜則是1.31～2.18倍，并且牛血清蛋白印跡膜的選擇性要高于血紅蛋白印跡膜。

4.5 其他 有文獻(xiàn)報(bào)道了一種新型的蛋白質(zhì)分子印跡聚合物，將β-環(huán)糊精和丙烯酰胺同時(shí)作為功能單體，β-環(huán)糊精的加入提供了親水表面和疏水腔，使蛋白質(zhì)通過氫鍵相互作用和疏水作用更好的進(jìn)行模板自組裝。實(shí)驗(yàn)證明，這種印跡聚合物有效的分離了混合物中的溶菌酶，顯示了其高效的選擇性[32]。

5 展望

由于分子印跡綁定親和能力的選擇性、容量以及其同質(zhì)性，分子印跡聚合物還不能提供一個(gè)完全替代生物分子的能力[33]。然而，他們潛在的用于分離和傳感應(yīng)用的功能是很清楚的，考慮到他們的低成本和穩(wěn)定性，分子印跡的前景可以預(yù)期在不久的未來。而就目前的國內(nèi)外研究可知，天然材料作為分子印跡的功能單體具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，多糖大分子鏈上具有許多可供反應(yīng)的功能性基團(tuán)(如-OH，-NH2等)，它們可直接與二異氰酸酯、環(huán)氧氯丙烷、戊二醛等進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)制得所需聚合物；同時(shí)利用這些基團(tuán)，還易于對(duì)所得聚合物進(jìn)行多種化學(xué)修飾；以多糖為基本原料制得的印跡聚合物，具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，特別適合用作生物功能材料；多糖來源廣泛、可再生，由其制得的分子印跡聚合物成本相對(duì)較低。

另外，納米分子印跡在現(xiàn)如今的研究中成為一個(gè)越來越重要的領(lǐng)域，它研究了分子印跡潛在的應(yīng)用，如生物傳感器、固相萃取和生物檢測(cè)等。納米分子印跡優(yōu)于傳統(tǒng)的分子印跡聚合物，是因?yàn)榧{米分子印跡聚合物擁有更高的結(jié)合能力，其更大的比表面積對(duì)目標(biāo)物有更大的選擇性和親和性，并且具有對(duì)水的高度兼容性。納米分子印跡聚合物的制備方法主要有沉淀聚合法、微乳液聚合法以及核殼型表面嫁接法等。雖然納米級(jí)分子印跡的制備并非一件容易的工作，但是對(duì)它的研究必然是大勢(shì)所趨[34]。

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(編校：王儼儼)

Research progress of polysaccharide-based protein molecular imprinting polymers

LUO Wei,ZHANG Ying-qingΔ

(Food and Pharmaceutical Engineering College, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

The polysaccharide-based protein molecular imprinting polymers have good biological compatibility, hydrophilic and gelling property, and can form weak interaction with template proteins, are the unique protein molecularly imprinted polymer materials.The method and mechanism of the protein molecularly imprinting, the protein molecularly imprinted polymers, the preparation and evaluation of imprinting effects of polysaccharide-based protein molecular imprinting polymers and its application prospect have been reviewed in this paper.

protein; molecularly imprin; polysaccharides; polymers; effects evaluation

駱薇，女，碩士在讀，研究方向：生物制藥，E-mail：willluowei@163.com；張迎慶，通訊作者，女，博士，教授，研究方向：生物制藥，E-mail：yingqingzhang@163.com。

Q53

A

1005-1678(2015)02-0177-04