慢病毒介導(dǎo)的siRNA沉默hTERT基因?qū)m頸癌Caski細(xì)胞增殖和凋亡的影響▲

趙紅珂 莫凌昭

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，南寧市 530021，E-mail:153477241@qq．com)

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，全球?qū)m頸癌每年新發(fā)病例有49．15萬，其中我國約占30%，是嚴(yán)重危害我國婦女健康的“第一殺手”［1］。研究證實(shí)HPV感染特別是高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)性感染與99%以上宮頸癌的發(fā)生有著密切關(guān)系［2］。端粒酶主要由核心催化組分(hTERT、hTERC、P65)和輔助因子組分兩大部分組成［3］。hTERT在端粒酶中發(fā)揮重要的作用，大部分腫瘤細(xì)胞如子宮內(nèi)膜癌、大腸癌等［4］可檢測到大量hTERT，通過抑制細(xì)胞凋亡和維持端粒的長度而維持腫瘤細(xì)胞的繼續(xù)分裂、增殖。目前研究向腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入hTERT的反義鏈，使細(xì)胞凋亡或停止生長［5］。HPV16型人染色體端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及惡性表型的維持中起著至關(guān)重要的作用，因此它已成為宮頸癌基因治療的理想靶點(diǎn)之一。RNA干擾(RNAi)是新近發(fā)展起來的一種沉默基因表達(dá)的有效方法［6－7］。已有研究證實(shí)，化學(xué)合成的小干擾RNA能有效地抑制目的基因的表達(dá)，但作用持續(xù)時(shí)間短，而慢病毒siRNA干擾是一種簡單、高效、高特異性、高穩(wěn)定性的基因敲除替代工具［8－9］。本研究擬通過慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)來沉默宮頸癌Caski細(xì)胞hTERT基因的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞周期、凋亡及克隆能力的影響，探討其治療和預(yù)防宮頸癌的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1．1 材料 宮頸癌Caski細(xì)胞株、慢病毒LV3-shhTERT、LV3-shNC和Polybrene購于上海吉瑪公司;RPMI1640培養(yǎng)基、0．25%胰蛋白酶及胎牛血清均購自美國Gibco公司;PCR引物由上海生工公司合成;Trizol總RNA純化試劑購自Invitrogen公司;MX-3000P熒光定量PCR儀、EPICS XL流式細(xì)胞儀為BeckmanCouhe公司產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代:將人宮頸癌Caski細(xì)胞置于含15%胎牛血清及1%青霉素(或鏈霉素)的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃、80%濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代方法:PBS潤洗后，0．25%胰蛋白酶消化至輕拍細(xì)胞脫落;加2 ml完全培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)至15 ml離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液;細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸后，以1∶2的比例傳代。

1．2．2 慢病毒轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞:Caski細(xì)胞為HPV 16陽性的宮頸癌細(xì)胞株(上海吉瑪公司);LV3-shNC為無目基因的真核表達(dá)載體;LV3-shhTERT為HPV16 hTERT特異性siRNA表達(dá)載體。采用病毒介導(dǎo)法(反轉(zhuǎn)錄病毒)將空載LV3-shNC和LV3-shhTERT轉(zhuǎn)染宮頸癌Caski細(xì)胞，再用已確定篩選濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)液進(jìn)行抗性篩選，每周換液2～3次，觀察細(xì)胞生長情況，篩選14 d后將留下來的抗性克隆團(tuán)，分別命名為 NC-LV、anti-hTERT-LV。進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集抗性克隆形成后1周的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為NC組(空白組)、NC-LV組(陰性對(duì)照組)及anti-hTERT-LV組(干擾組)共3組。

1．2．3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HPV16 hTERT mRNA的表達(dá):采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為總cDNA。HPV16 hTERT目的基因引物:上游引物5'-CTCCCATTTCATCAGCAAGTTT-3'，下游引物 5'-CTTGGCTTTCAGGATGGAGTAG-3'。GAPDH內(nèi)對(duì)照引物:上游引物5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。擴(kuò)增條件如下:95℃ 30 s;40個(gè)循環(huán):95℃ 5 s，60℃ 34 s;95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，50℃ 30 s。利用2－△△Ct法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目標(biāo)基因mRNA模板的相對(duì)差異?！鰿t實(shí)驗(yàn)組=Ct(實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因)－Ct(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因);△Ct對(duì)照組=Ct(對(duì)照組目標(biāo)基因)－Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因)?！鳌鰿t=△Ct實(shí)驗(yàn)組－△Ct對(duì)照組。最后，計(jì)算目的基因模板水平比率:2－△△Ct=mRNA模板量的比值。

1．2．4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:制備3種細(xì)胞懸液，鋪6孔板，培養(yǎng)24 h。每組細(xì)胞設(shè)定3個(gè)孔，培養(yǎng)細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長期，當(dāng)達(dá)到80%融合后加入0．25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇，輕柔震蕩懸浮細(xì)胞，4℃固定24 h，第2天取出細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，將乙醇洗掉。離心機(jī)2 000 r/min，離心5 min，加入終濃度為50 mg/L的RNA酶，37℃反應(yīng)1 h，加入100 ml碘化丙啶，4℃下避光孵育20～30 min后在EPICS XL流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測分析。

1．2．5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:將對(duì)數(shù)生長期的3種細(xì)胞懸液以5×105/孔接種于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后用胰蛋白酶將細(xì)胞從6孔板中消化，2 000 r離心5 min;用4℃預(yù)冷的1×磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞兩次后，100 μl 1×Binding緩沖液重懸細(xì)胞，再加入10 μl AnnexinⅤ-PE混勻后，避光反應(yīng)，冰上孵育5～15 min后，每管加入380 μl 1×Binding緩沖液后再加入10 μl 7AAD染色液，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。(設(shè)3組空白調(diào)零孔:未感染病毒細(xì)胞 NC組、單染AnnexinV-PE組、單染7AAD組)。

1．2．6 細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn):為檢測hTERT基因沉默對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞克隆形成能力的影響，將對(duì)數(shù)生長期的NC，NC-LV和anti-hTERT-LV細(xì)胞，用0．25%胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，臺(tái)酚藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以300個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以“十”字方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞分散均勻，將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2周。每天于倒置顯微鏡下觀察克隆形成情況，當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液小心浸洗兩次，每孔加3 ml純甲醇固定15 min。棄去固定液，每孔加2 ml姬姆薩染液(1∶6倍稀釋)染色30 min，然后流水緩慢洗去染色液，空氣中干燥。在顯微鏡下觀察克隆大小，并計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞團(tuán)作為克隆計(jì)數(shù)，取平均克隆數(shù)計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=平均克隆數(shù)/每孔接種細(xì)胞數(shù)(200)×100%。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以(x±s)表示，采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 目的細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)測得Caski細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)MOI值為20，用嘌呤霉素篩選后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光率在95%以上(圖1－1、1－2)，達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1－1 流式細(xì)胞儀測定慢病毒感染后轉(zhuǎn)染率及嘌呤霉素篩選后感染率

圖1－2 為慢病毒感染Caski細(xì)胞后用嘌呤霉素曬選后的熒光及常光照片(×40倍)

2．2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測hTERT mRNA 3組細(xì)胞hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 324．613，P ＜ 0．001)。anti-hTERT-LV 組細(xì)胞的hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于NC組、NC-LV組(P 均 ＜0．05)。見表1。

表1 3組HPV16 hTERT mRNA和內(nèi)對(duì)照GAPDH的Ct值、△△Ct值比較

2．3 流式細(xì)胞儀檢測Caski細(xì)胞的細(xì)胞周期 3組G1期細(xì)胞比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=77．172，P＜0．001)。anti-hTERT-LV組G1期細(xì)胞比例明顯高于NC組和NC-LV組(P均＜0．05)。3組S期細(xì)胞比例比較差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義 (F=109．540，P ＜0．001)，anti-hTERT-LV組S期細(xì)胞比例明顯低于NC組和NC-LV組(P均＜0．05)。3組G2/M期細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1．365，P=0．417)。見表2。

表2 各組細(xì)胞周期比例比較(x ± s，%)

2．4 流式細(xì)胞儀檢測Caski細(xì)胞凋亡 3組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60．010，P ＜0．001)，anti-hTERT-LV組細(xì)胞凋亡率明顯高于NC組和NC-LV組(P均 ＜0．05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較(x ± s，%)

2．5 流式細(xì)胞儀檢測Caski細(xì)胞克隆數(shù) 3組細(xì)胞克隆數(shù)相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=176．836，P＜0．001)。anti-hTERT-LV 組 細(xì) 胞 克 隆 形 成 數(shù) 為(67．67 ±9．07)個(gè)，明顯低于 NC 組(184．33 ±16．99)個(gè)及 NC-LV 組(178．17±8．23)個(gè)(P 均 ＜0．05);NC-LV組細(xì)胞的克隆形成數(shù)與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。見圖2－1、2－2。

圖2－1 以上圖為標(biāo)準(zhǔn)選取的細(xì)胞團(tuán)塊作為計(jì)數(shù)范圍

圖2－2 Caski、NV-LV、Anti-hTERT-LV細(xì)胞分別平板克隆形成染色后照片

3 討論

端粒酶在正常組織被抑制且目前的檢測技術(shù)還無法檢測到，但在人類85% ～95%的腫瘤細(xì)胞、生殖細(xì)胞等可檢測到端粒酶的表達(dá)。端粒酶由端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白和hTERT 3個(gè)部分組成，其中hTERT是一種反轉(zhuǎn)錄酶，可維持端粒長度，位于人染色體5p15．33［10］。hTERT是端粒酶的限速酶，沉默或下調(diào)hTERT表達(dá)水平，可降低端粒酶活性、促進(jìn)細(xì)胞死亡和凋亡、抑制細(xì)胞生長。端粒酶與腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞衰老有密切關(guān)系［11－12］。Hahn 等［13］將靶向 hTERT 的短雙鏈核苷酸通過病毒載體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，最終發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡較對(duì)照組顯著增加。由此證實(shí)了hTERT在維持腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性和細(xì)胞增殖方面發(fā)揮著重要作用，因此以hTERT作為腫瘤治療的靶基因進(jìn)行研究極具意義。端粒酶中的hTERT為宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，它在宮頸癌致癌過程中的作用及機(jī)制引起了我們注意，為證明hTERT在宮頸癌發(fā)生過程中的作用，也為以后我們預(yù)防及治療宮頸癌提供強(qiáng)有力的證據(jù)。我們選擇了最常見的亞型HPV16端粒酶的限速酶hTERT作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制研究和RNA干擾的基因靶點(diǎn)，在分子生物學(xué)水平沉默hTERT基因，探討其在宮頸癌致癌過程中的作用。

關(guān)于研究基因治療宮頸癌的方法，早期曾應(yīng)用反義核酸和核酶等技術(shù)使hTERT基因的表達(dá)降低，但其缺乏特異性、抑制率低，且作用時(shí)間短暫，難以完全敲除或降解目的基因［14］，因此核酶和反義核酸方法的應(yīng)用受到較大的限制［15］。慢病毒載體是反轉(zhuǎn)錄病毒的一種用于基因治療的載體，是將人類免疫缺陷病毒進(jìn)行改良后發(fā)展起來的，失去了其傳染性能，安全性高。它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有較強(qiáng)的感染能力，且具有高轉(zhuǎn)基因效率，可整合入細(xì)胞并得到長期表達(dá)。構(gòu)建的siRNA慢病毒載體不僅可以替代瞬時(shí)表達(dá)載體擴(kuò)增使用，還可以感染那些傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑很難轉(zhuǎn)染進(jìn)去的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并整合后得到穩(wěn)定的長期表達(dá)。慢病毒siRNA干擾原理為將siRNA的反義核酸序列連接到表達(dá)載體當(dāng)中構(gòu)建表達(dá)克隆，將構(gòu)建好的克隆轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，其反義核苷酸可以與游離siRNA結(jié)合，使得siRNA表達(dá)量減少。這種具有高效、特異阻斷靶基因表達(dá)的作用，在功能基因組學(xué)中具有重要的地位［16］。

本研究利用前期構(gòu)建成功的HPV16 hTERT特異性siRNA表達(dá)載體［17］來轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞，觀察它對(duì)hTERT基因的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在抗性克隆形成后1周，即轉(zhuǎn)染后3周，hTERT siRNA表達(dá)載體能使 Caski細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)被明顯抑制，而空載體對(duì)hTERT mRNA的表達(dá)無明顯影響，說明HPV16 hTERT siRNA表達(dá)載體能特異高效地抑制Caski細(xì)胞hTERT基因的表達(dá)。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，anti-hTERT-LV組G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞減少;此結(jié)果提示，細(xì)胞增殖受阻，不能進(jìn)入S期，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)向非增殖細(xì)胞群，趨向靜止。轉(zhuǎn)染anti-hTERT-LV、NC-LV的陽性克隆及Caski組細(xì)胞的凋亡率分別為(36．45 ±5．39)%、(9．55 ±2．57)%、(8．75 ±3．75)%，由此可見我們構(gòu)建的HPV16 hTERT siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡率明顯提高，而NC-LV組的凋亡率并未增加，說明慢病毒是通過沉默hTERT基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的。細(xì)胞平板克隆結(jié)果顯示:anti-hTERT-LV組細(xì)胞的形成克隆能力明顯低于NC-LV和NC組細(xì)胞，提示本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的RNA干擾表達(dá)載體明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和克隆的形成。

綜上所述，以慢病毒介導(dǎo)的利用siRNA沉默hTERT感染宮頸癌 Caski細(xì)胞，可以高效地下調(diào)目的基因hTERT的表達(dá)，調(diào)控周期，促進(jìn)凋亡，有效抑制宮頸癌Caski細(xì)胞的增殖。這為HPV相關(guān)宮頸癌的基因治療提供了理論依據(jù);也為進(jìn)一步研究端粒酶活性下調(diào)對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響奠定了一定的基礎(chǔ)。

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