MDR1基因C3435T多態(tài)性對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤化療效果及血液學(xué)毒性的影響▲

黃谷瑜 柯 晴 譚曉虹 岑 洪

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院化療三科，南寧市 530021，E－mail:hgy420@qq．com)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤最常見(jiàn)的類型，是一組在臨床特征、預(yù)后等方面具有高度異質(zhì)性的腫瘤［1］。人類多藥耐藥基因1(multidrug resistance 1，MDR1)的產(chǎn)物P－糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)是一種 ATP 依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能將許多結(jié)構(gòu)不同的化合物逆向轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。MDR1 C3435T(rs1045642)位于26號(hào)外顯子，可影響P－gp的表達(dá)和活性［2］。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的MDR1基因過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致化療失敗的一個(gè)主要因素［3］。目前許多研究已證實(shí)MDR1基因C3435T多態(tài)性與多種腫瘤的預(yù)后及化療相關(guān)毒性有關(guān)。本研究旨在探討MDR1基因C3435T多態(tài)性對(duì)DLBCL患者的化療療效及化療相關(guān)血液學(xué)毒性的影響。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2008年1月至2013年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院初治的DLBCL患者117例，診斷均符合WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，臨床分期采用Ann－Arbor分期，患者均接受4周期以上的CHOP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、潑尼松)方案或R－CHOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、潑尼松)方案一線化療。117例患者中，116例有完整的血液學(xué)毒性資料，109例有一線化療療效評(píng)價(jià)資料，99例有詳細(xì)的隨訪資料?；颊吲R床資料見(jiàn)表1。

1．2 儀器和試劑 基因組DNA提取試劑盒TIANamp購(gòu)自北京天根公司;PCR擴(kuò)增引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;PCR擴(kuò)增試劑盒Premix Ex Taq及限制性內(nèi)切酶MboI購(gòu)自大連TaKaRa公司;PCR擴(kuò)增儀Biometra Tprofessional購(gòu)自德國(guó)Biometra公司;核酸染料GelRed購(gòu)自美國(guó)Biotium公司;凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio－Rad公司。1．3 MDR1基因C3435T多態(tài)性檢測(cè) 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR－RFLP)方法對(duì)多態(tài)性進(jìn)行分析。抽取患者外周靜脈血2 ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)管抗凝，參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分離基因組DNA。PCR 引 物 序 列 為 5'－TTGATGGCAAAGAAATAAAGC－3'和 5'－CTTACATTAGGCAGTGACTCG－3'。PCR 反應(yīng)體系是 25 μl:0．3 μg 基因組 DNA、上下游引物各0．3 μm、Premix Ex Taq 12．5 μl;反應(yīng)條件是:98℃ 變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復(fù)30 個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳、用GelRed染色，在紫外線下觀察，DNA條帶為包含MDR1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)的208 bp 的片段。酶切體系是 20 μl:1 μl MboI、2 μl PCR產(chǎn)物、1 μl 10×K緩沖液;反應(yīng)條件是37℃消化2 h。酶切產(chǎn)物用上述方法觀察DNA條帶。TT純合基因型可觀察到1條未消化的條帶(208 bp)，CT雜合基因型可觀察到208 bp、145 bp和63 bp 3條帶，CC純合基因型可觀察到145 bp和63 bp 2條帶。選擇部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證其分型結(jié)果。

1．4 治療方法 117例 DLBCL患者均采用一線的CHOP方案或R－CHOP方案化療，21 d為1周期，中位化療周期為6(4～8)周期。在治療期間每2周期進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，治療結(jié)束后2年內(nèi)每3個(gè)月進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，治療結(jié)束后3～5年每6個(gè)月評(píng)價(jià)療效(對(duì)于入組較晚的患者，以最后一次隨訪結(jié)果進(jìn)行分析)。

1．5 療效評(píng)價(jià)、生存分析及血液學(xué)毒性評(píng)價(jià) 療效評(píng)價(jià)參照非霍奇金淋巴瘤NCCN指南2012年第3版淋巴瘤緩解標(biāo)準(zhǔn)［5］，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)?？偩徑饴?ORR)為CR率和PR率之和。無(wú)進(jìn)展生存(PFS):是指從治療開(kāi)始到疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)，或者死亡的時(shí)間?？偵?OS):是

指從治療開(kāi)始到任何原因引起死亡的時(shí)間。血液學(xué)毒性評(píng)價(jià)參照WHO抗癌藥急性及亞急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［6］。嚴(yán)重的血液學(xué)毒性包括Ⅲ～Ⅳ級(jí)的白細(xì)胞減少、血小板減少以及貧血。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用IBM SPSS 22．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)(或Fisher精確概率法)。生存分析采用 Kaplan－Meier法，用Breslow(Generalized Wilcoxon)檢驗(yàn)比較PFS和OS有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 MDR1 C3435T等位基因的頻率 在117例DLBCL患者中，CC基因型47例(40．2%，47/117)，TT基因型17例(14．5%，17/117)，CT 基因型 53 例(45．3%，53/117)，C和T等位基因頻率分別是62．8%(147/234)和37．2%(87/234)。117例DLCBL患者的MDR1 C3435T的基因型分布符合Hardy－Weinberg平衡(P=0．743)。

2．2 MDR1 C3435T不同基因型患者的臨床資料比較

117例患者中，CC基因型47例，CT+TT基因型70例，CC基因型組與CT+TT基因型組患者性別、年齡、臨床分期、血清乳酸脫氫酶水平、結(jié)外器官侵犯數(shù)目、體能狀況評(píng)分和國(guó)際預(yù)后指數(shù)評(píng)分、化療方案比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0．05)，具有可比性。

表1 CC基因型組與CT+TT基因型組患者臨床資料比較(n，%)

2．3 MDR1 C3435T不同基因型組患者的療效比較 117例患者中，109例患者有一線化療療效評(píng)價(jià)資料，其中CC基因型44例，CT+TT基因型65例。治療后，CT+TT基因型組患者的ORR、CR率稍高于CC基因型組，但兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(u=1．129，P=0．129)。見(jiàn)表2。

表2 不同基因組患者臨床療效比較(n，%)

2．4 MDR1 C3435T不同基因型組患者的生存時(shí)間比較

117例患者中，99例患者有完整隨訪資料，中位隨訪時(shí)間為11．2月。99例患者中，CC基因型38例，CT+TT基因型61例。CT+TT基因型組患者的中位PFS時(shí)間為29．6個(gè)月，明顯長(zhǎng)于CC基因型組患者的17．7個(gè)月(χ2=5．363，P=0．021)，見(jiàn)圖 1。而兩組患者 OS 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0．005，P=0．942)，見(jiàn)圖 2。

圖1MDR1 C3435T各基因型DLBCL患者PFS曲線比較

圖2 MDR1 C3435T各基因型DLBCL患者OS曲線比較

2．5 MDR1 C3435T不同基因型組患者的血液學(xué)毒性比較 116例有完整的血液學(xué)毒性資料患者中，CC基因型46例，CT+TT基因型70例。經(jīng)化療后，CT+TT基因型組嚴(yán)重貧血、血小板減少和嚴(yán)重血小板減少發(fā)生率明顯低于CC基因型組患者(P＜0．05)。見(jiàn)表3。

表3 MDR1 C3435T不同基因型患者血液學(xué)毒性比較(n，%)

3 討論

近年來(lái)，隨著靶向藥物的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用以及化療方案的不斷完善，DLBCL患者的療效及預(yù)后大大提高。R－CHOP方案已確定為 DLBCL患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案［7］。盡管使用標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但仍有1/3的DLBCL患者最終發(fā)展為復(fù)發(fā)/難治性淋巴瘤［8］。

P－gp是MDR1基因的蛋白產(chǎn)物，又稱ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)子，具有廣泛的底物特異性，可轉(zhuǎn)運(yùn)多種化學(xué)成分，包括外源性物質(zhì)(如抗腫瘤藥物和細(xì)菌毒素)以及內(nèi)源性復(fù)合物，因此它可以保護(hù)機(jī)體不受侵害［9］。DLBCL化療方案中的主要藥物長(zhǎng)春新堿和阿霉素，則是P－gp的底物。

MDR1基因C3435T多態(tài)性是一種同義突變的單核苷酸多態(tài)性，即不產(chǎn)生編碼序列的改變。以往認(rèn)為MDR1基因C3435T同義突變是沉默的突變，但目前研究證實(shí)MDR1基因同義突變可能會(huì)影響其產(chǎn)物P－gp的表達(dá)及功能［10］。但尚不明確這種基因突變是否會(huì)影響化療的療效和毒性。Hoffmeyer等［2］對(duì)高加索人群十二指腸中P－gp的表達(dá)水平與MDR1基因C3435T多態(tài)性的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC型患者M(jìn)DR1表達(dá)水平比TT型患者高2倍，并且TT型患者血漿藥物含量最高。Illmer等［11］研究也證實(shí)，MDR1基因C3435T多態(tài)性可通過(guò)選擇性藥物轉(zhuǎn)運(yùn)等特殊機(jī)制影響急性髓細(xì)胞白血病患者的治療效果，并且CC型基因可能是疾病復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素。Jamroziak等［12］報(bào)告慢性淋巴細(xì)胞白血病患者細(xì)胞中P－gp的活性由MDR1 C3435T基因型決定，CC基因型患者P－gp活性最高，TT基因型最低，而P－gp對(duì)抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用，因此MDR1可影響化療療效。關(guān)于急性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤和乳腺癌的研究，也證實(shí)T攜帶者的OR率或OS優(yōu)于CC型患者［13－15］。然而，有一些研究得出不同的結(jié)論，如 Hu等［16］對(duì)中國(guó)DLBCL患者的研究結(jié)果表明，TT基因型患者的OS較短;Cizmarikova等［17］發(fā)現(xiàn)在基于蒽環(huán)類藥物化療的乳腺癌患者中，CC基因型患者的PFS和OS更長(zhǎng);還有研究證實(shí)MDR1基因mRNA的表達(dá)量在T基因攜帶者中比 C基因攜帶者高［18］，或認(rèn)為 MDR1基因C3435T多態(tài)性與急性髓細(xì)胞白血病患者的療效和預(yù)后無(wú)相關(guān)性［19－20］。

本研究結(jié)果顯示，MDR1基因 C3435T多態(tài)性與DLBCL患者的PFS和化療后血液學(xué)毒性有關(guān)聯(lián)，CT+TT基因型患者較CC基因型患者PFS長(zhǎng)，嚴(yán)重貧血、血小板減少和嚴(yán)重血小板減少的發(fā)生率低(P＜0．05)。本研究結(jié)果與部分學(xué)者的研究結(jié)果有所不同，如Erdelyi等［21］的研究發(fā)現(xiàn)TT基因型患者化療后更易于合并感染，但各基因型患者化療后嚴(yán)重白細(xì)胞減少發(fā)生率無(wú)差異;Tran等［22］報(bào)告，TT基因型患者化療后更易發(fā)生嚴(yán)重血液學(xué)毒性。還有的學(xué)者認(rèn)為MDR1基因C3435T多態(tài)性與化療后血液學(xué)毒性發(fā)生無(wú)顯著相關(guān)性［17，23］。造成這些研究結(jié)果差異的原因還不清楚，推測(cè)可能與研究對(duì)象種族、腫瘤病理類型、治療方案等因素有關(guān)。此外，上述研究大多是回顧性研究，研究的樣本量相對(duì)較小、隨訪時(shí)間相對(duì)較短，不足以達(dá)到充分的檢驗(yàn)效能。因此要得到明確結(jié)論，尚需前瞻性大樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，MDR1基因 C3435T多態(tài)性可能影響DLBCL患者的化療效果和血液學(xué)毒性。未來(lái)可通過(guò)研發(fā)靶向MDR1的藥物，減少腫瘤細(xì)胞耐藥發(fā)生，進(jìn)而提高DLBCL患者化療效果、減輕化療藥物毒性反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)基于基因多態(tài)性的個(gè)體化治療。

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