FST基因多態(tài)性與檳榔江水牛和德宏水牛繁殖性能的相關(guān)性研究

李素霞, 張 秀, 李 楊, 張 斌, 史憲偉, 余選富, 劉學(xué)洪*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省騰沖縣畜牧工作站，云南 騰沖 679100)

科學(xué)試驗(yàn)

FST基因多態(tài)性與檳榔江水牛和德宏水牛繁殖性能的相關(guān)性研究

李素霞1, 張 秀1, 李 楊1, 張 斌1, 史憲偉1, 余選富2, 劉學(xué)洪1*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省騰沖縣畜牧工作站，云南 騰沖 679100)

[目的]為了解水牛繁殖性能的分子基礎(chǔ)及建立檢測分子標(biāo)記,本研究分析卵泡抑素(FST)基因在檳榔江、德宏水牛中的多態(tài)性，并與繁殖性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。[方法]研究采用PCR擴(kuò)增及DNA測序方法，檢測水牛FST基因多態(tài)性，并分析該基因變異位點(diǎn)與繁殖性能的關(guān)系。[結(jié)果]在檳榔江、德宏水牛的FST基因序列共檢測到7個SNP位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)插入/缺失變異。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，除德宏水牛中SNP6偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)，其他SNP位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)。FST基因與檳榔、德宏水牛產(chǎn)犢和產(chǎn)犢率性狀相關(guān)不顯著，而當(dāng)兩個群體合并后，F(xiàn)ST基因有兩個變異位點(diǎn)與產(chǎn)犢率呈極顯著相關(guān)。[結(jié)論]FST基因在檳榔江、德宏水牛中存在較高基因變異性，F(xiàn)ST基因與水牛繁殖性狀的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

水牛；FST；多態(tài)性；繁殖性狀；關(guān)聯(lián)性

檳榔江水牛是迄今為止我國唯一的河流型水牛[1]，具有較高的產(chǎn)奶性能，德宏水牛屬于沼澤型水牛，具有較好的產(chǎn)肉性能[2]，兩者都是發(fā)展云南特色畜牧業(yè)的寶貴種質(zhì)資源。然而，檳榔江水牛群體整齊度較差，個體間生產(chǎn)性能差異較大，數(shù)選育程度較低的水牛類型[3]。德宏水牛雖凈肉率高、肉質(zhì)好，但存欄量已呈下降趨勢，并出現(xiàn)嚴(yán)重的品種退化現(xiàn)象[4]。

因此，繁殖力是影響其保種的重要因素之一，也是影響水牛業(yè)生產(chǎn)效率的重要因素之一。

卵泡抑素(Follistatin,FST)是一種廣泛存在的單鏈糖蛋白，在卵母細(xì)胞成熟過程中起重要作用[5]。目前尚無該基因與水牛產(chǎn)犢年齡、產(chǎn)犢率及繁殖性能相關(guān)性的報道。本研究以檳榔江、德宏水牛為試驗(yàn)動物，對檳榔江及德宏水牛FST基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，分析不同基因型與繁殖性能的關(guān)系，旨在尋找檳榔江水牛及德宏水牛與繁殖性能有關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)，為檳榔江水牛及德宏水牛選育、種質(zhì)資源的保護(hù)及有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)在云南省騰沖縣巴福樂檳榔江水牛良種發(fā)育有限公司采集了81頭檳榔江水牛樣品，在德宏州盈江縣采集了56頭德宏水牛樣品。采樣時詳細(xì)記錄檳榔江水牛和德宏水牛的毛色、母牛產(chǎn)犢年齡、產(chǎn)犢間隔、產(chǎn)犢數(shù)、產(chǎn)犢成活數(shù)、配種次數(shù)等生長發(fā)育及繁殖性狀相關(guān)資料。

血液樣品4℃低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存?zhèn)溆?。耳組織樣品浸泡于無水乙醇中于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用傳統(tǒng)的苯酚/氯仿和蛋白酶K標(biāo)準(zhǔn)法提法水?；蚪MDNA,TE緩沖液溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 根據(jù)NCBI上提供牛(Bostaurus)的FST全基因組序列(Gene bank登錄號：NC-007318.5)利用primer3在線設(shè)計(jì)引物并由上海生工生物工程公司合成。引物序列、PCR產(chǎn)物大小及擴(kuò)增區(qū)域見表1；PCR體系與條件見文獻(xiàn)[1]。

1.2.3 測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序，測序采用ABI3730xl測序儀及配套的BigDye Terminator試劑盒。

1.2.4 序列分析 采用Bioedit軟件查看測序質(zhì)量，利用DNAStar軟件包中的SeqMan對所測序列進(jìn)行自動排序，用SeqAlign程序?qū)π蟮男蛄羞M(jìn)行自動排序，確定FST基因變異位點(diǎn)的堿基、數(shù)量及位置。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

等位基因頻率、基因型頻率、χ2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的計(jì)算方法見參考文獻(xiàn)[6]。

關(guān)于繁殖性狀分析，本研究利用奶牛場DHI生產(chǎn)記錄的水牛產(chǎn)犢數(shù)、產(chǎn)犢年齡、平均產(chǎn)犢間隔數(shù)據(jù)，根據(jù)最小二乘法建立下列模型：$$Yijk=μ+Gi+Ej+Lk+eijk$$ 式中Yijk為第i個個體表型的記錄值；μ為群體平均值；Gi為第i個個體的基因效應(yīng)值；Ej為產(chǎn)犢強(qiáng)度效應(yīng)；Lk胎次的固定效應(yīng)；eijk為隨機(jī)誤差。根據(jù)以上線性模型，利用SAS9.0對繁殖性能數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。產(chǎn)犢率=產(chǎn)犢數(shù)/母牛實(shí)際年齡。

2 結(jié)果與分析

2.1 FST基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用本研究設(shè)計(jì)的水牛FST引物PCR擴(kuò)增檳榔江水牛和德宏水牛，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，產(chǎn)物片段大小與預(yù)期片段大小相符，特異性良好，可用于測序反應(yīng)。電泳檢測結(jié)果見圖1。

2.2 基因序列分析

為了檢測水牛FST基因多態(tài)性，本研究對特異性水?；蚪MDNA擴(kuò)增產(chǎn)物純化測序。通過對所有測序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)7個變異位點(diǎn)，所檢測的所有變異位點(diǎn)均為單核苷酸變異，所有變異位點(diǎn)主要以轉(zhuǎn)換、顛換為主，未發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失現(xiàn)象。其中外顯子2產(chǎn)生1處G668T突變，氨基酸分析表明，此處突變導(dǎo)致223位氨基酸甘氨酸變成纈氨酸。檢測到的所有SNP位點(diǎn)信息見表2。

注：E1(+112)表示SNP位點(diǎn)位于第1外顯子最后一個堿基下游112 bp處；E2(-114)表示此SNP位點(diǎn)位于第2外顯子第一堿基上游114 bp處；668/E2表示變異位點(diǎn)位于第2外顯子，編碼區(qū)668 bp處。以下同。

2.3 FST基因在檳榔江與德宏水牛中的基因頻率與基因型頻率

2.3.1 FST基因在檳榔江中的基因頻率與基因型頻率 本研究計(jì)算了FST基因7個SNP在檳榔江水牛群體中等位基因頻率和基因頻率。有5個SNP位點(diǎn)(1，2, 5, 6, 7)存在較高的變異頻率，其最小等位基因頻率高于0.05。所有7個SNP位點(diǎn)在檳榔江水牛均在于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)。FST基因7個SNP位點(diǎn)在檳榔江水牛群體中等位基因頻率和基因型頻率及哈代-溫伯格遺傳平衡計(jì)算結(jié)果見表3。

2.3.2 FST基因在德宏水牛中的基因頻率與基因型頻率 本研究計(jì)算了FST基因7個SNP在德宏水牛群體中等位基因頻率和基因型頻率。有6個SNP位點(diǎn)(1,2,3,5,6,7)存在較高的變異頻率，其最小等位基因頻率高于0.05。除SNP6外，其他6個SNP位點(diǎn)在德宏水牛均在于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)。FST基因7個SNP位點(diǎn)在德宏水牛群體中等位基因頻率和基因型頻率及哈代-溫伯格遺傳平衡計(jì)算結(jié)果見表4。

2.3.3 FST基因在2個水牛群體中的基因頻率與基因型頻率 本研究計(jì)算了FST基因7個SNP在檳榔江水牛和德宏水牛兩個群體中等位基因頻率和基因型頻率。有5個SNP位點(diǎn)(1，2，3，4，5，7)存在較高的變異頻率，其最小等位基因頻率高于0.05。除SNP6外，其他6個SNP位點(diǎn)在德宏水牛均在于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)。FST基因7個SNP位點(diǎn)在檳榔江水牛和德宏水牛兩個群體中等位基因頻率和基因型頻率及哈代-溫伯格遺傳平衡計(jì)算結(jié)果見表5。

2.4 FST基因與水牛繁殖性能的關(guān)系

運(yùn)用SAS9.0數(shù)據(jù)分析軟件，統(tǒng)計(jì)了FST基因7個變異位點(diǎn)不同基因型與水牛產(chǎn)犢年齡、產(chǎn)犢強(qiáng)度方差分析的顯著性檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析分為檳榔江水牛群體、德宏水牛群體以及兩個水牛合并群體的方差分析統(tǒng)計(jì)檢測，具體結(jié)果見表6，表7與表8。

3 討 論

FST在雌性動物中可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜的生長、排卵、刺激多卵泡發(fā)育等[7]。王春強(qiáng)等人研究表明適宜FST濃度可顯著提高牛受精卵的總卵裂率[8]。該基因在水牛上的研究不多，目前為止未見他人做過有關(guān)檳榔江水牛及德宏水牛FST基因的研究，因此無從比較。本實(shí)驗(yàn)通過對檳榔江水牛、德宏水牛FST基因序列進(jìn)行比較，共檢測到7個變異位點(diǎn)，其中共有1個外顯子變異，此變異為引起氨基酸改變的功能性變異。變異分析表明，檳榔江水牛、德宏水牛具有很高的基因變異性，且DNA變異均為單堿基(SNP)變異,未發(fā)現(xiàn)插入/缺失變異。利用χ2檢驗(yàn)檢測水牛FST基因全部7個變異位點(diǎn)的哈代-溫伯格遺傳平衡，結(jié)果顯示，除德宏水牛中SNP6偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)，其他SNP位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)。偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)的SNP是由于樣本數(shù)量有限所致，還是與選種選育引起的遺傳漂變有關(guān)有待于進(jìn)一步研究。

當(dāng)分別計(jì)算FST基因7個變異位點(diǎn)在檳榔江水牛群體、德宏水牛群體中與繁殖性能的相關(guān)性均不顯著后，將兩個群體合并，分析發(fā)現(xiàn)FST基因有兩個變異位點(diǎn)(E2(-114)和668/E2)與繁殖強(qiáng)度呈極顯著相關(guān)，p值分別為0.013，0.015。FST基因這兩個位點(diǎn)與水牛繁殖性能在兩個群體的互作關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。此次檢測的7個變異位點(diǎn)與繁殖性能的關(guān)系為提高檳榔江水牛、德宏水牛的繁殖性能做了很好的鋪墊，特別是與繁殖性能有相關(guān)性的變異位點(diǎn)可作為分子標(biāo)記應(yīng)用。

以上結(jié)果顯示，F(xiàn)ST基因可能是影響水牛繁殖性能的一個主要基因。然而，因?yàn)槲覀兝玫氖腔驕y序的方法，試驗(yàn)中檢測的個體數(shù)有限，基因變異與繁殖性能的相關(guān)性還需要建立遺傳標(biāo)記檢測方法在大群體中進(jìn)一步驗(yàn)證。水牛FST基因高度多態(tài)性為探索基因功能與水牛繁殖性能奠定了基礎(chǔ)。同時，本研究所檢測的7個變異位點(diǎn)可以整合到檳榔江水牛、德宏水牛的選育方案中，為建立繁殖性能標(biāo)記輔助選擇提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究首次以FST基因?yàn)閷ο?，對檳榔江水牛和德宏水牛的遺傳多樣性和繁殖性能關(guān)聯(lián)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FST基因多態(tài)性對水牛繁殖性狀的影響達(dá)到了顯著水平，因此,本研究認(rèn)為FST基因可以作為水牛繁殖性能分子標(biāo)記輔助選擇的候選基因。

[1] 季 敏，余長林，余選富，等.檳榔江水牛STAT5A基因多態(tài)性及MspI PCR-RFLP遺傳標(biāo)記的建立[J].中國牛業(yè)科學(xué)，2012，38(6)：12-18.

[2] 宋敏艷，高文春，羅在仁，等.德宏水牛及雜交后代FSH-β基因多態(tài)性與繁殖性能的關(guān)系[J].中國牛業(yè)科學(xué)，2013，39(5)：26-32.

[3] 苗永旺，李大林，章純熙.檳榔江水牛保種及選育利用策略[J].中國牛業(yè)科學(xué)，2012，38(1)：46-50.

[4] 尹正發(fā)，王維柱，陳德壽.德宏水牛的保種選育及利用[J].中國牛業(yè)科學(xué)，2010，36(2)：37-39.

[5] 田錦，李志敏，傅衍，等.抑制素、活化素和卵泡抑素研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(12)：77-81.

[6] 劉桂瓊，姜勛平，丁家桐.梅山豬ob基因多態(tài)性與繁殖性狀的相關(guān)性研究[J].中國畜牧雜志，2002，38(4)：15-16.

[7] 高立坤，葛仕豪，王樹迎.濟(jì)寧青山羊垂體促性腺激素的季節(jié)性變化[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，21(1)：180-182.

[8] 王春強(qiáng)，馬 寧.卵泡抑素對牛卵母細(xì)胞體外成熟及早期胚胎生長發(fā)育的影響[J].中國畜牧雜志，2011，47(15)：23-25.

Association of FST Polymorphism and Reproduction Traits in Binglangjiang and Dehong Water Buffalo Breeds

LI Su-xia1, ZHANG Xiu1, LI Yang1,ZHANG Bin1, SHI Xian-wei1, YU Xuan-fu2, LIU Xue-hong1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YunanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China; 2.AnimalHusbandryWorkStationofTengchongCounty,Tengchong,Yunnan679100,China)

【Objective】In order to understand molecular basis of reproduction and establish genetic markers in domestic water buffalo, FST gene polymorphism were investigated in Binglangjiang and Dehong water buffalos.【Method】Polymorphism of FST gene in Binglangjiang and Dehong buffalo were investigated by direct sequencing and PCR amplification, and association between SNPs and reproductive performance were analyzed. 【Result】Our results revealedthat total of 7SNPs were detected in FSTgenes. Except SNP6 in Dehong buffalo, all SNPs of FST gene in buffalo population were agreed with Hardy-Weinberg equilibrium by chi-square test.No associations were found between SNPs and reproduction traits, but two SNPs were highly significantly related to reproduction traits when the two groups combined. 【Conclusion】FST gene was of high polymorphism in both Binglangjiang and Dehong buffalo populations, so relationship with reproduction traits might be further investigated.

water buffalo;FSTgene;polymorphism; reproduction traits; association

2014-12-26 修改日期:2015-01-18

云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(云財(cái)教2013年160#)

李素霞(1989-)，女，山東菏澤人，在讀碩士研究生，主要從事動物遺傳育種與繁殖方面的研究。

*通訊作者：劉學(xué)洪(1956-)，男，云南昭通市人，碩士生導(dǎo)師。

S8-1

A

1001-9111(2015)02-0017-06