李斯特菌生物學(xué)特征與臨床相關(guān)性

焦 穎，張 巍

產(chǎn)單核 細(xì)胞李 斯特菌（Listeria monocytogenes），是一種環(huán)境致病菌，可以引起李斯特菌?。煌ǔＪ侨藗兪秤昧吮贿@種菌污染的食物而引起的［1］。根據(jù)美國疾病控制中心（CDC）報(bào)道2011年美國暴發(fā)因食用甜瓜而引起的李斯特菌感染，147例中有33例死亡，1例孕婦流產(chǎn)。與普通人相比，孕期婦女是高度危險(xiǎn)人群，一旦感染了李斯特菌可能會(huì)導(dǎo)致自然流產(chǎn)或早產(chǎn)，其新生兒可能發(fā)生血流感染及腦膜炎［2-3］。李斯特菌感染危險(xiǎn)對象還包括免疫力低下人群，年齡65～70歲人群也是感染高發(fā)人群。李斯特菌病有多種臨床表現(xiàn)形式，感染患者病死率很高。李斯特菌病在歐美等發(fā)達(dá)國家常有報(bào)道，美國每年大約有2 500例因感染產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌繼發(fā)嚴(yán)重的疾病，大約有500例死亡［4］，但在發(fā)展中國家尚未引起廣泛關(guān)注。本文主要目的是了解國內(nèi)外關(guān)于李斯特菌生物學(xué)特征的研究及與臨床的相關(guān)性。

1 李斯特菌生物學(xué)特性及流行病學(xué)特點(diǎn)

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌屬于李斯特菌屬，為細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陽性無芽孢桿菌。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌是重要的人獸共患病病原體，為其菌屬中唯一人類致病菌，可通過食用被污染的食物在人畜間傳播，1%～5%正常人及10%～20%屠宰場工作人員為無癥狀帶菌者，成為主要傳染源［5］?？芍氯祟惖哪X膜炎、血流感染、肺炎、急性胃腸炎、流產(chǎn)等疾病。

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌為需氧或兼性厭氧，感染后患者病死率高達(dá)30%［6］。該菌對各種應(yīng)激（低溫、高鹽、低pH、氧化應(yīng)激等）條件有很強(qiáng)的耐受性，進(jìn)一步增大了該菌的危害性［7］。此菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，可產(chǎn)生一種溶血性外毒素，對人類致病性強(qiáng)［8］。同時(shí)也是食品中常見的、公共衛(wèi)生學(xué)上重要的食源性病原菌。WHO 和FDA 于1986 年設(shè)立了李斯特菌研究中心，專門協(xié)調(diào)該菌的病原學(xué)、流行病學(xué)及臨床等研究工作［9］。該菌已被列為20世紀(jì)90年代四大食源性疾病致病菌之一［10］。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌廣泛分布在自然環(huán)境中，如土壤、污水、飼料、動(dòng)物、健康人及各種生食和即食食品中，包括生肉及熟肉制品、速凍米面食品、奶酪、蔬菜、沙拉和海產(chǎn)品等，目前至少42 種動(dòng)物22 種禽類已帶菌。近10余年來世界各地，特別是美國、法國、英國、西班牙和日本等發(fā)達(dá)國家因產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌污染食品而引起食源性疾病暴發(fā)日益增多［11］。我國到目前為止，雖未出現(xiàn)有關(guān)產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌引起食物中毒暴發(fā)流行的報(bào)道，但從國內(nèi)多篇調(diào)查報(bào)道了解，此菌多年來在我國豬、羊、雞、牛、兔等家禽家畜中有流行，并已經(jīng)報(bào)告的臨床散發(fā)病例有數(shù)十例。目前由產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌污染引起的食品中毒已受到世界各國的重視［12］。

高溫烹飪食物可殺滅李斯特菌，但隨著飲食習(xí)慣逐漸變化，食用生冷及半熟食的人群增多，致使李斯特菌感染率增高。感染后主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、上呼吸道感染、肺炎、腹瀉、血流感染、腦膜炎，甚至死亡。

2 李斯特菌的分型方法及流行病學(xué)特點(diǎn)

李斯特菌屬現(xiàn)在有6個(gè)種，分別是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌，英諾克李斯特菌，伊氏、格氏、莫氏、塞氏李斯特菌。其中伊氏李斯特菌又包括伊氏亞種和倫氏亞種；格氏李斯特菌包括格氏亞種和默氏亞種。目前，利用不同的培養(yǎng)基可以從菌落形態(tài)及顏色上來區(qū)分產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌與其他李斯特菌，從而達(dá)到對前者進(jìn)行快速的定性鑒定和定量計(jì)數(shù)；采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和脈沖場凝膠電泳（PFGE）方法可對其進(jìn)行獨(dú)立基因檢測及分子學(xué)分型［13-14］。

2.1 血清分型

血清分型是很多食源性微生物如沙門菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌等的經(jīng)典分型方法。該種方法已被應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。該法通過采用血清凝集試驗(yàn)，O 抗原采用玻片凝集法，鞭毛H 抗原采用試管凝集法，可將產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌分為16 個(gè)血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b和7?？乖Y(jié)構(gòu)與毒力無關(guān)，對人致病的主要為血清型4b，其次是1／2a 和1／2b，三者約占本病的90%；從食品中分離得到的血清型主要為1／2a（54.72%），1／2b（20.75%）和1／2c（18.87%），4b 血清型相對較少［15］。這幾種血清型均有較強(qiáng)的致病性，能引起嚴(yán)重的李斯特菌食源性疾病，危害身體健康。因此，應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的監(jiān)測力度，重點(diǎn)防治由上述幾種血清型菌株引起的食物中毒［16］。

對從食品中分離出的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌進(jìn)行分子學(xué)特征和潛在毒性研究，結(jié)果顯示，從食品中分離的88 株該菌中，42株血清型為1／2a或3a，23 株血清型為1／2b或3b，15 株血清型為1／2c或3c，6株血清型為4b、4d或4e，2株血清型為4a或4c。臨床李斯特菌病的患者中4b血清型占一半，但其在食品中的比例相對較低，這提示4b血清型可能在諸如宿主胃中這種不利條件下，耐受力更強(qiáng)或比1／2a、1／2b、1／2c型更易進(jìn)入宿主細(xì)胞［17］。

2.2 分子分型

PFGE如今已經(jīng)廣泛用于產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的分子流行病學(xué)和溯源性追蹤研究，是目前所有分型方法中最為可靠的一種。由于其分辨能力強(qiáng)、重復(fù)性好，成為分子分型方法的金標(biāo)準(zhǔn)［18］。通過細(xì)胞的裂解，菌體膠塊的制備及膠塊內(nèi)DNA 酶切等過程，利用PFGE 指紋圖譜獲得的李斯特菌的分子特征，可以從2 個(gè)途徑幫助流行病學(xué)調(diào)查：一是與暴發(fā)相關(guān)的地域和目前散在事件的相關(guān)性，二是流行病學(xué)專家把PFGE圖譜應(yīng)用于病例-對照研究中，以指導(dǎo)鑒定與食品相關(guān)的暴發(fā)事件。PFGE 可以將相同血清型的菌株分為不同帶型，說明PFGE 分型法比血清學(xué)分型法分辨力更高。PFGE 分型結(jié)果顯示，有5種主要的PFGE 基因型，Q 型（22.64%）；P型（15.09%）；L 型；J 型（11.32%）和H 基 因型［19］。

2.3 分子亞分型

傳統(tǒng)的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌分型方法有血清分型、噬菌體分型及多區(qū)帶酶電泳（MEE）等。血清分型對于產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌亞型的區(qū)分和流行病學(xué)調(diào)查相對不太靈敏。噬菌體分型雖然速度較快，但需要一套標(biāo)準(zhǔn)化的參考噬菌體以使不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性。噬菌體分型的標(biāo)準(zhǔn)化也是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@種方法本身就受到生物學(xué)變異和實(shí)驗(yàn)變異的影響。MEE 與分子亞分型相比辨別能力較弱。Wiedmann等［20］利用核糖體分型（riboty ping）和對hly 基因以及actA 基因進(jìn)行測序?qū)a(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌分為3個(gè)譜系（lineage）。研究還表明，譜系Ⅰ主要是人類分離株和暴發(fā)流行分離株，這個(gè)譜系包含1／2b、3b、4ab、4b、4d、4e和7血清型的菌株。譜系Ⅱ的大部分菌株屬于食品分離株，包括1／2a、1／2c、3a和3c血清型。在美國60%食品分離株屬于譜系Ⅱ，只有40%人群分離株和15%暴發(fā)流行株屬于譜系Ⅱ。譜系Ⅲ的菌株在人群臨床分離株中極為罕見，大約有15%動(dòng)物分離株屬于該譜系。譜系Ⅲ的菌株血清型大多為4a和4c。有研究表明產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌譜系Ⅲ的菌株對人的致病力降低，這預(yù)示著譜系Ⅲ能在進(jìn)化過程中獨(dú)立于譜系Ⅰ和譜系Ⅱ之外的分支。但利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分型發(fā)現(xiàn)，130株產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌分為2個(gè)譜系。因此，譜系Ⅲ在進(jìn)化樹上的位置還需進(jìn)一步探討。研究發(fā)現(xiàn)的這2個(gè)譜系菌株間的同源性為85%左右，說明這2個(gè)譜系是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌進(jìn)化過程中的不同分支。同一譜系內(nèi)的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌菌株同緣性較高［21］。

目前，國外產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌分子鑒定與分子亞分型技術(shù)已初步建立，但國內(nèi)類似的工作開展較少。分子亞分型是一種能快速鑒定產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的方法，通過建立一套以DNA 序列為基礎(chǔ)的分子亞分型體系，可以快速確定食品的污染來源，并為進(jìn)一步研究產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌群體遺傳學(xué)、流行病學(xué)及生態(tài)學(xué)奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)［22］。

臨床上結(jié)合以上分型方法可確定菌株是否為同一克隆，如新生兒李斯特菌感染時(shí)是否因?yàn)槟赣H感染李斯特菌后通過胎盤垂直傳播所致；同時(shí)李斯特菌感染流行時(shí)，結(jié)合以上分型方法確定是否為食源性或水源性，若同一地區(qū)所有發(fā)病患者分泌物培養(yǎng)出的李斯特菌與食物或水中檢出的李斯特菌為同一克隆時(shí)，則可說明此地區(qū)李斯特菌感染流行為被污染食物或飲用水導(dǎo)致。

血清型和PFGE2種分型方法相互不能替代，兩者從不同側(cè)面反映產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的分型特點(diǎn)。結(jié)合2種分型方法能更好地了解產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌各菌株之間的遺傳相關(guān)性及流行病學(xué)特征，促進(jìn)了對李斯特菌病流行的監(jiān)控和產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌污染源的追蹤［23］。鑒于PFGE 分型結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果密切相關(guān)，且前者比后者分辨力高，而后者比前者操作簡便穩(wěn)定。故建議在工作中，先對菌株進(jìn)行血清學(xué)分型，有相同或相近分型結(jié)果的菌株才進(jìn)一步做PFGE分型［24］。

3 李斯特菌毒力因子及其致病性

李斯特菌主要毒力因子為一個(gè)具有成孔蛋白特性的李斯特菌溶血素LLO、肌動(dòng)蛋白聚合蛋白和一個(gè)依賴鋅的金屬蛋白酶。LLO 是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的重要毒力因子，由hly 基因編碼。其相對分子質(zhì)量為60 000，屬于膽固醇依賴細(xì)胞溶素家族，參與產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌一級和次級吞噬小體的逃離［25］。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的致病性與LLO 密切相關(guān)，具有LLO 的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌有致病性，無LLO 則無致病性［26］。actA 與產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌基于肌動(dòng)蛋白的運(yùn)動(dòng)性有關(guān)，有研究表明，actA也參與產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的細(xì)胞黏附和侵襲。actA 缺失突變株因改變了硫酸乙酞肝素的識別功能，對鼠巨噬細(xì)胞IC-21和中國蒼鼠卵巢上皮細(xì)胞的黏附和侵襲力顯著降低。另外，無害李斯特菌中actA 的表達(dá)可促進(jìn)該細(xì)菌入侵到上皮細(xì)胞系中［27-28］。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌黏附與侵入宿主細(xì)胞的過程與內(nèi)化素A、B（inlAB）有關(guān)，而其在細(xì)胞內(nèi)增殖及細(xì)胞間擴(kuò)散能力則由毒力基因plcA、hly、mpl、actA、plcB 介導(dǎo)。PrfA（prfA）調(diào)控這些毒力因子，與plcA、hly、mpl、actA、plcB 構(gòu)成第一毒力島（LIPI-1）［29］。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌正常菌株感染細(xì)胞后，能裂解吞噬泡膜，使細(xì)菌進(jìn)入到宿主細(xì)胞胞質(zhì)中，而缺乏LLO 的突變體感染上皮細(xì)胞后滯留在吞噬泡內(nèi)。近年的研究表明LLO 是一個(gè)多功能的毒力因子，能引起宿主細(xì)胞諸多反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、黏膜細(xì)胞外滲作用、巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)、樹突狀細(xì)胞的凋亡、磷脂代謝及引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等［30］。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌能產(chǎn)生2 種磷脂酶C：磷脂酰肌磷脂酶C（PI-PLC）和寬范圍的磷脂酶C（PC-PLC）。plcA 基因編碼一個(gè)特異的作用于PI-PLC。plcB 基因編碼一個(gè)PC-PLC。目前的研究認(rèn)為，PI-PLC毒性相對較小，對細(xì)菌在細(xì)胞間擴(kuò)散作用不大，主要是協(xié)同PC-PLC 發(fā)揮作用。而PC-PLC的功能則較復(fù)雜，它使細(xì)菌從吞噬泡中逃逸出來，能破壞宿主細(xì)胞的信號通路，能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和化學(xué)因子的合成，還能通過二?；视?、神經(jīng)酰胺、肌醇磷酸鹽等調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡等。prfA 編碼PrfA 蛋白，是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌毒力基因簇上各種毒力基因的調(diào)節(jié)蛋白，直接檢測prfA 可以減少其他毒力基因突變或缺失所造成假陰性結(jié)果的概率。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，帶有hly、plcA、plcB 和prfA 毒力相關(guān)基因的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌均屬于致病株［31］。

人類感染李斯特菌后，臨床癥狀及預(yù)后差異較大，部分患者感染后只是帶菌狀態(tài)，而不發(fā)病，而有的患者感染后則合并血流感染、腦膜炎、甚至死亡。通過對毒力因子的檢測，可以在病原學(xué)角度對此病作出一定程度的解釋，病情的輕重除與機(jī)體免疫力有關(guān)外，與致病菌株毒力強(qiáng)弱、第一毒力島是否全部陽性及菌株逃逸均有一定程度的關(guān)聯(lián)。并且可在一定程度上主導(dǎo)臨床抗菌藥物治療力度及療程。

4 李斯特菌致病的免疫學(xué)機(jī)制

李斯特菌通過其各種毒力因子可在環(huán)境和食品中生存并繁殖，并可穿越胃腸道防御系統(tǒng)，跨越上皮細(xì)胞屏障，侵襲免疫系統(tǒng)細(xì)胞，并可全身擴(kuò)散，甚至可穿越血腦屏障和胎盤屏障。同時(shí)作為侵襲性胞內(nèi)菌，產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌可逃離宿主吞噬小體，在細(xì)胞質(zhì)中增殖，并將抗原呈遞給MHC-I類分子途徑，促進(jìn)抗原特異保護(hù)性CD8＋T 細(xì)胞的生成。而且產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌感染宿主的專職性抗原遞呈細(xì)胞（APC）后，可誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答和Th1細(xì)胞因子的分泌［32］。細(xì)菌被先天免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞內(nèi)吞后，細(xì)胞壁成分刺激巨噬細(xì)胞分泌激活NK 細(xì)胞的白介素（IL）-12，腫瘤壞死因子（TNF）-α和激活中性粒細(xì)胞和IL-1。激活的NK 細(xì)胞又可刺激干擾素（IFN）-γ的產(chǎn)生，而IFN-γ可促進(jìn)Tho大量生成，同時(shí)也可作用于巨噬細(xì)胞，上調(diào)其抗原加工過程，刺激IL-12 的分泌，并結(jié)合IFN-γ 激活Tho細(xì)胞為Th1 細(xì)胞，Thl細(xì)胞又可分泌IL-12、TNF 和IFN-γ。巨噬細(xì)胞激發(fā)一系列細(xì)胞因子分泌，最終也激活了先天性和獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答［33］。與感染易感性增加有關(guān)的一個(gè)重要細(xì)胞因子就是IL-10。有研究顯示，IL-10 產(chǎn)量增多可提高李斯特菌感染易感性；一旦炎性反應(yīng)被控制，IL-10對減緩炎性反應(yīng)有重要意義。由不同數(shù)量的T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10，其最重要的作用是抑制免疫系統(tǒng)的多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。近年的一些研究顯示，給予李斯特菌感染的小鼠IL-10 則會(huì)提高小鼠的易感性，若給予抗IL-10受體抗體的小鼠則對李斯特菌感染有持續(xù)的抵抗力。李斯特菌感染時(shí)IL-10 主要由CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞［34］、CD4＋CD25＋Foxp3＋T 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，與此同時(shí)巨噬細(xì)胞也產(chǎn)生IFN 和TNF，這2種細(xì)胞因子是感染時(shí)機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，會(huì)在感染時(shí)被IL-10 負(fù)調(diào)節(jié)。胞外菌的免疫應(yīng)答主要由產(chǎn)生中和抗體的B 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，而胞內(nèi)菌的免疫應(yīng)答則由識別專職性APC細(xì)胞表面MHC 分子中抗原的T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)。T 淋巴細(xì)胞由不同的亞群組成，包括識別吞噬體內(nèi)抗原的CD4＋T 淋巴細(xì)胞和識別細(xì)胞質(zhì)中抗原的CD8＋T 淋巴細(xì)胞。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌感染可引發(fā)以上2種不同的免疫應(yīng)答。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)增值的細(xì)菌，它的增值受到CD8＋、CD4＋T 淋巴細(xì)胞和分泌性IFN 等免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的影響［35］。

當(dāng)機(jī)體感染大量細(xì)菌時(shí)，這些免疫機(jī)制可能會(huì)被阻斷，或者沒有能力去有效控制感染的進(jìn)展。這種情況可能是由于細(xì)胞因子產(chǎn)生不足，及大量細(xì)菌毒素可以產(chǎn)生抑制性機(jī)制而致保護(hù)性免疫的下行性調(diào)節(jié)。感染早期，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括IL-12、IL-10。在鼠類感染李斯特菌的研究中，IL-10在保護(hù)性免疫反應(yīng)中起到抑制性作用，其機(jī)制如前所述。因此，這在一定程度上可以解釋高劑量感染李斯特菌小鼠致死的原因。

有研究顯示，給感染李斯特菌的小鼠注射抗IL-10特異性抗體可以短暫的減少細(xì)菌的負(fù)荷量，并且IL-10缺乏的小鼠對感染有更強(qiáng)的抵抗力［36］。另有研究顯示，在給新生小鼠注入產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌前18 h預(yù)防性的腹腔內(nèi)注射重組血清淀粉酶A（SAA）可以很大程度的減少李斯特菌的繁殖，激活巨噬細(xì)胞，并且不影響新生鼠的生長。PCR 技術(shù)顯示成年鼠在感染急性期時(shí)TNF、SAA1、SAA2表達(dá)均明顯高于新生小鼠，提示新生小鼠感染產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌急性期時(shí)預(yù)防性注射SAA 可以很大程度激活免疫應(yīng)答并減少細(xì)菌繁殖［37］。

但目前無論是抗IL-10抗體還是SAA 均尚未用于人類治療李斯特菌感染，目前國外大量研究尚停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。

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