靶向微泡攜帶藥物聯(lián)合低頻超聲溶栓的研究進(jìn)展

阿麗米娜·阿文 穆玉明

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆烏魯木齊 830011

通過超聲溶栓可以追溯到1976 年，Trubestein等[1]證明了第一個(gè)通過體外低頻率超聲波能量可破壞血凝塊，促使其溶解。此項(xiàng)調(diào)查還顯示，這個(gè)系統(tǒng)有溶解外周動(dòng)脈血凝塊的潛力并廣泛用于動(dòng)物體內(nèi)溶栓實(shí)驗(yàn)。 后來，出現(xiàn)了4 個(gè)通過超聲溶栓的基本方法：①通過導(dǎo)管外部傳感器超聲溶栓；②經(jīng)皮超聲不添加藥物或微泡和超聲結(jié)合溶栓藥物和/或結(jié)合微泡共同溶栓；③通過導(dǎo)管結(jié)合超聲與靶向微泡；④經(jīng)皮低頻超聲與全身系統(tǒng)性（靜脈）藥結(jié)合增加超聲波溶栓的療效。

1 血栓溶栓治療的現(xiàn)狀

目前利用超聲聯(lián)合靶向微泡造影劑共同溶栓已被證實(shí)是一種快速溶解血栓的方法，其對(duì)預(yù)防急性冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈血栓形成均起了重要作用。

Nederhoed 等[2]通過制作豬急性周圍動(dòng)脈閉塞的模型驗(yàn)證了超聲聯(lián)合微泡溶解血栓是目前較好的溶栓方式。 微泡造影劑，尤其是聯(lián)合超聲的微泡造影劑在急性外周動(dòng)脈閉塞疾病的治療中，具有很好的溶栓前景[3-4]。 通過超聲聯(lián)合微泡造影劑共同作用，可進(jìn)一步增強(qiáng)遠(yuǎn)端小血管的溶栓效果[5-7]。 在超聲強(qiáng)度方面，體外低頻超聲，主要是通過加速纖溶酶對(duì)凝血塊的纖溶作用從而達(dá)到溶栓，此時(shí)再將粒徑為1～10 μm的微泡震蕩后聯(lián)合超聲溶栓，那么盡管在更高強(qiáng)度的超聲條件下也同樣能達(dá)到血栓及血凝塊的快速溶解[8]。因此1～10 μm 粒徑大小的微泡在治療下肢血栓的疾病中具有較好的溶栓效果。研究表明使用微泡增強(qiáng)溶栓時(shí)，選擇超聲頻率，主要考慮以下3 個(gè)因素：微泡的大小，這會(huì)影響其諧振頻率[8-9]；衰減頻率的增加，更高的頻率下限制了治療的深度；增加較低的頻率時(shí)就可以形成定波的機(jī)會(huì)[10-11]。 亦有研究證實(shí)微泡空化作用的閾值會(huì)隨頻率的增加而提高[12-15]。 因此合理的超聲頻率、微泡的粒徑大小以及溶栓的時(shí)間長短都是溶栓的關(guān)鍵因素，通過調(diào)整其中的條件，可使超聲聯(lián)合微泡起到共同作用從而提高血栓的快速和徹底溶解、達(dá)到預(yù)防血栓形成的目的。 Alexandrov 等[16]通過靶向超聲聯(lián)合微泡對(duì)豬的下肢血管栓塞模型進(jìn)行治療[17]，顯示豬和人的凝血和纖溶系統(tǒng)有著類似的組成成分[18]，即當(dāng)服用抗血小板藥物并聯(lián)合超聲微泡兩種不同的溶栓方法時(shí)， 對(duì)末端血管的溶栓效果結(jié)果顯示更好，能夠達(dá)到血栓的完全溶解。

2 超聲頻率的選擇

選擇超聲頻率，主要因素為：微泡的大小，這會(huì)影響其諧振頻率；衰減頻率的增加，更高的頻率下限制了治療的深度；增加較低的頻率時(shí)就可以形成定波的機(jī)會(huì)；除此還有微泡空化作用的閾值會(huì)隨頻率的增加而提高。過去的研究中有的采用“低”頻率（20～500 kHz），有的采用“高”頻率（MHz）的范圍[19]。 迄今為止大多數(shù)臨床和體內(nèi)研究中使用過的較高的超聲頻率，最常見范圍是TCD 設(shè)備中常規(guī)的1～2 MHz。 使用頻率較低的超聲具有通過體積較大的聲波作用來改進(jìn)的顱骨穿透力與定位的優(yōu)點(diǎn)。然而一定要慎重選擇照射參數(shù)以確保其安全，一個(gè)有名的臨床試驗(yàn)中使用了300 kHz的超聲（無微泡），因高發(fā)的顱內(nèi)出血情況被迫提前終止[21]。 后續(xù)的工作建議涉及血-腦屏障的破壞，這可能是由于使用超長、超寬主脈沖[20]造成多反射干擾或高于空化閾值的壓力形成定波，這兩者都可以通過改變照射的參數(shù)進(jìn)行補(bǔ)救[22]。

3 與溶栓有關(guān)的指標(biāo)

盡管經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療或藥物溶栓，遠(yuǎn)端微栓塞的現(xiàn)象仍有發(fā)生。使用超聲微泡溶栓治療是誘導(dǎo)微氣泡振蕩導(dǎo)致血塊破壞和恢復(fù)灌注的方法。微血管阻塞是一個(gè)復(fù)雜的多因素現(xiàn)象，包括微循環(huán)痙攣，血小板聚集和微血管血栓。

3.1 微血栓的形成

微血栓發(fā)生于微循環(huán)血管內(nèi)， 是一種透明血栓，由嗜酸性同質(zhì)性的纖維蛋白構(gòu)成， 是纖維素性血栓。血栓顆粒尺寸范圍從10 ～200 μm， 平均直徑為（17.3±3）μm。

3.2 影響溶栓的相關(guān)因素

3.2.1 組織因子（tissue factor，TF） TF 由凝血蛋白酶級(jí)聯(lián)細(xì)胞引發(fā)，參與止血，在血栓的形成過程中具有重要作用，在炎癥和細(xì)胞免疫反應(yīng)，組織中TF 的細(xì)胞分布尚未被描述。 TF 是在組織中選擇性表達(dá)，與細(xì)胞而不是細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)。在血管內(nèi)皮細(xì)胞和外周血細(xì)胞中可檢測。 TF 作為凝血途徑的起始因子[23-24]，也被名為血小板組織因子、 因子Ⅲ、 凝血活酶或cd142，它是一種蛋白，在內(nèi)皮組織和白細(xì)胞中存在，是啟動(dòng)凝血酶形成凝血酶原的必要因子，TF 作為外膜細(xì)胞，在細(xì)胞核平滑肌細(xì)胞參與了凝血途徑[25]。Golinp 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TFPI21 在動(dòng)脈粥樣硬化病變時(shí)表達(dá)會(huì)代償性增高。 Kong 等[27]研究證實(shí)，在離體實(shí)驗(yàn)中TFPI22 能抑制MMP22 活性。

3.2.2 P/T 比值 即血漿6-酮-前列腺素Flα（6-ketoprostaglandin1-α，6-keto-PGF1α） 與血栓素B2（thromboxane B-2，TXB-2）的比值。 P/T 比值升高易導(dǎo)致血小板聚集、血栓形成，促使動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病。出血、 損傷和內(nèi)毒素休克動(dòng)物血漿中TXB2 顯著增加，這與休克時(shí)肺循環(huán)阻力升高有關(guān)。 李小鷹等[28]的研究表明：在正常生理情況下6-leto- PGF1a 和TXB2 保持著一定的比例關(guān)系，P/T 比值變化可反映血管舒縮狀態(tài)和血小板聚集能力，二者平衡在維持正常組織灌注和血流通暢方面起重要作用一旦失衡就可能導(dǎo)致血小板黏附、聚集，微血管痙攣，微血栓形成、組織灌注不良等一系列病理改變。

3.2.3 P-選擇素（P-selectin） P-selectin 是常用的血小板活化指標(biāo)，其水平高低反映了血小板的活化程度，且敏感性、特異性均較高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，測定程序已標(biāo)準(zhǔn)化。有研究表明靜息血小板的α 顆粒膜上有少量P-選擇素表達(dá)。 Merten 等[29]的研究發(fā)現(xiàn)：GPⅡb/Ⅲa 受體復(fù)合物逐漸陷入或移入血小板小管系統(tǒng)，P-選擇素作為唯一的連接分子血小板表面僅留下大量的存在，它通過與相鄰血小板表面的硫脂類受體相結(jié)合， 使血小板連接形成大而穩(wěn)定的血小板血栓，因此P-選擇素可作為檢測早期動(dòng)脈血栓的靶標(biāo)， 在動(dòng)脈血栓形成過程中發(fā)揮了重要作用。

3.2.4 炎癥因子與血栓的關(guān)系 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 被認(rèn)為是導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征一個(gè)最主要的炎性介質(zhì)。 對(duì)于TNF-α 在急性缺血再灌注過程中的表達(dá)和作用的研究結(jié)果表明，肢體急性缺血再灌注后，TNF-α 的表達(dá)顯著增高，也與不少研究提示的腦缺血再灌注損傷后，TNF-α 達(dá)迅速增加一致[30]。 炎性反應(yīng)介導(dǎo)了肢體再灌注損傷，而中性粒細(xì)胞的聚集和浸潤及白細(xì)胞介素l（interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）等大量炎癥因子的釋放是炎性反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。

3.2.5 血管性假血友病因子（von Willbrand factor，vWF） vWF 是一種多聚體糖蛋白，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成、儲(chǔ)存（Weibel-Palade 小體）和釋放，亦有少量由血小板儲(chǔ)存（α 顆粒）和釋放。 它既可與小板膜糖蛋白 在血栓形成過程中發(fā)揮著重要作用， 它既可與小板膜糖蛋白GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ、GPⅡb/Ⅲa 結(jié)合，又可以和膠原介導(dǎo)血小板結(jié)合， 又可以和膠原介導(dǎo)血小板、黏附、聚集于受損的血管內(nèi)皮下組織，導(dǎo)致聚集于受損的血管內(nèi)皮下組織，導(dǎo)致栓形成，因此它可以作為血管內(nèi)皮受損的標(biāo)志物。

3.2.6 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） VEGF 屬于血小板源生長因子超家族重要成員，可由血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌， 具有生理和病理性血管增生和通透性調(diào)節(jié)作用。 Waltham 等[31]發(fā)現(xiàn)VEGF 和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）在大鼠的下腔靜脈自然溶解血栓中表達(dá)，在血栓的再通和機(jī)化中起了調(diào)節(jié)作用，并且VEGF 和bFGF 在下腔靜脈壁未見有表達(dá)， 血清中VEGF 和bFGF 水平變化不明顯。 靜脈注射VEGF 治療靜脈血栓研究表明，VEGF 可促進(jìn)管腔再通、血栓機(jī)化。

3.3 溶栓后的病理改變

研究表明，血栓溶解后，大栓子脫落造成下游微血管（30～150 μm）栓塞，用Masson 病理染色觀察其結(jié)果為動(dòng)脈微栓塞內(nèi)，可見團(tuán)塊狀、均質(zhì)、綠染的纖維蛋白結(jié)構(gòu)，其周邊散在紅色顆粒狀沉積的紅細(xì)胞。 徐亞麗等[32]通過制作股動(dòng)脈血栓，在不同條件下溶栓后，對(duì)末梢微循環(huán)內(nèi)微血栓進(jìn)行檢測：采集末梢血管標(biāo)本，用中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，將組織切成4 μm 厚的切片。 進(jìn)行HE 染色以觀察微血栓的形成。 微血栓指在小于150 μm 的微血管中，由血小板、纖維素和/或紅細(xì)胞組成，HE 染色呈粉紅色，單純的紅細(xì)胞堆積認(rèn)為是血管中殘留的血液，HE 染色呈點(diǎn)樣深紅色。同時(shí)取兩張切片進(jìn)行馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(lán)（改良Lendrum 法）染色，觀察冠脈微血管栓塞組成成分，纖維素呈鮮紅色，肌纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色，膠原纖維呈藍(lán)色，紅細(xì)胞呈黃色，陳舊的纖維素成紫藍(lán)色。

4 傳統(tǒng)的藥物溶栓與靶向微泡、尿激酶聯(lián)合超聲溶栓的現(xiàn)狀比較

近年來超聲微泡造影劑制備被不斷研發(fā)更新中，不同的血栓助溶研究多采用不同的超聲微泡，其血栓助溶效果也存在差異。 在體內(nèi)，微泡的性能是受其材料結(jié)構(gòu)、微泡粒徑和血液中的穩(wěn)定性影響的，也依次由許多參數(shù)，包含在微泡內(nèi)的氣體、外殼材質(zhì)和分布決定。 其中，微泡膜和內(nèi)核氣體與微泡粒徑及穩(wěn)定性密切相關(guān)，是影響血栓助溶作用的主要因素。

微泡的靶向性能夠增大血塊附近微泡的濃度，從而增大它的溶栓作用，與此同時(shí)增加微泡在血塊附近停留的時(shí)間。這樣可能能夠降低超聲的強(qiáng)度和微泡的劑量，以減少發(fā)生副作用的風(fēng)險(xiǎn)，并增加其安全性。采用微泡注射，在體外和體內(nèi)的相關(guān)研究表明，微泡通過攜帶或不攜帶溶栓藥，可協(xié)助血栓溶解，而且對(duì)周圍的微血管再灌注有作用。在短時(shí)間內(nèi)可提供增強(qiáng)了的造影；經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，連續(xù)給藥可以延長超聲造影增強(qiáng)的有效期，同時(shí)還可增強(qiáng)造影，已被應(yīng)用于一些超聲溶栓的臨床試驗(yàn)中。微泡增強(qiáng)超聲溶栓的另一個(gè)問題是如何使藥物和微泡運(yùn)輸?shù)窖鳒p少的區(qū)域。Culp等[33]關(guān)于低頻超聲下犬動(dòng)靜脈移植物的研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了微泡運(yùn)輸?shù)窖龎K的困難性，其中直接移植內(nèi)注射微泡往往比靜脈注射取得更多的再通。 Xie 等[34]研究了“引導(dǎo)圖像”超聲治療法，血凝塊在診斷性超聲中連續(xù)成像，并且只有當(dāng)微泡在缺血區(qū)域中被檢測到時(shí)才能觸發(fā)高強(qiáng)度的治療性脈沖。通過超聲聯(lián)合微泡溶栓可能會(huì)使血栓破碎成小塊，但如果碎片大于下游毛細(xì)血管的直徑，這就會(huì)增加二次栓塞的風(fēng)險(xiǎn)。血凝塊碎片的大小在很大程度上取決于超聲照射強(qiáng)度[35]。 有研究觀察到在不使用微泡或纖溶藥物的情況下，在體外用20 kHz 脈沖模式超聲處理人類血栓時(shí)，99%的血凝塊碎片都小于10 μm[34]。

4 結(jié)論與展望

綜上所述，微泡結(jié)合超聲溶栓是一個(gè)全新的研究領(lǐng)域，影響因素也較多，因此將攜帶溶栓藥物尿激酶的靶向微泡造影劑經(jīng)靜脈注射后，如能充分考慮到超聲的發(fā)射頻率、強(qiáng)度、時(shí)間，溶栓藥物的劑量等因素，不僅可以達(dá)到對(duì)靶向血管內(nèi)血栓的完全溶解，同時(shí)也能達(dá)到預(yù)防微循環(huán)的再栓塞。超聲聯(lián)合微泡溶栓的治療過程中，對(duì)相關(guān)參數(shù)最優(yōu)化，治療方案進(jìn)一步優(yōu)化及靶向微泡的合理應(yīng)用，會(huì)進(jìn)一步提高臨床溶栓治療的安全性和有效性。 因此，超聲聯(lián)合靶向微泡溶解血栓有望能快速提高目前溶栓治療的安全性和溶栓效率。

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