兔魏氏梭菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

王友良（山東省臨沂市蘭山區(qū)義堂畜牧獸醫(yī)站 276000）

兔魏氏梭菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

王友良（山東省臨沂市蘭山區(qū)義堂畜牧獸醫(yī)站 276000）

魏氏梭菌病本病又稱產(chǎn)氣莢膜桿菌病是由A型魏氏梭菌產(chǎn)生外毒素引起的腸毒血癥，本病的發(fā)生無明顯季節(jié)性，除哺乳仔兔外，各種年齡、品種、性別的兔子均有易感性。以發(fā)病突然、急性腹瀉、排黑色水樣或帶血的膠凍樣、腥臭糞便、盲腸漿膜出血斑和胃粘膜出血、潰瘍?yōu)橹饕卣?。發(fā)病率和死亡率均較高。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來源

臨沂市蘭山區(qū)義堂鎮(zhèn)恒源養(yǎng)兔場發(fā)病死亡兔4只。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

普通肉湯培養(yǎng)基（購自青島高科園海博技術(shù)有限公司）、瓊脂粉（購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）、伊紅美藍(lán)瓊脂（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所北京中海生物科技有限公司）、麥康凱瓊脂（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所北京中海生物科技有限公司）。

1.1.3 藥敏試驗(yàn)紙片

藥敏試紙片（由臨沂大學(xué)獸醫(yī)預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.1.4 試驗(yàn)動物

10日齡雞胚6枚，2日齡雛雞6只，19～23g小白鼠6只，均由臨沂大學(xué)獸醫(yī)預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

SW-WJ-LCU潔凈工作臺、酒精燈、接種環(huán)、鑷子、培養(yǎng)皿、生化培養(yǎng)箱、試管、試管架、高壓鍋、顯微鏡、玻片、革蘭氏染色液、藥敏片、生化管、錐形瓶、玻璃棒、電熱爐、手術(shù)剪、廢物缸，1ml注射器、厭氧培養(yǎng)缸、燒杯、量筒、250ml錐形瓶、300ml錐形瓶等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 臨床診斷

急劇腹瀉?；疾⊥米畛醯募S便變形、變軟，很快轉(zhuǎn)為帶血的膠凍樣、黑色或褐色稀糞，有惡臭腥味，肛門周圍、后肢及尾部被稀糞污染；被毛粗亂，精神不振，拒食，脫水，無體溫變化，最后消瘦死亡。剖開腹腔后有特異腥臭味，胃內(nèi)充滿飼料，胃底粘膜脫落，可見大小不等的潰瘍。小腸充滿氣體，腸壁變薄，粘膜呈彌漫性出血?？漳c和回腸內(nèi)有大量的膠凍樣液體和氣體。盲腸和結(jié)腸內(nèi)充滿氣體和黑綠色稀糞便，有腐敗臭味。大腸內(nèi)充滿黑綠色稀糞，腥臭。肝臟稍腫、質(zhì)地變脆，膽囊腫大、充滿膽汁，脾呈深褐色，膀胱積有茶色尿液，肺充血、瘀血，心臟表面血管怒張，呈樹枝狀。

2.2 病原菌分離鑒定

2.2.1 各種培養(yǎng)基的制備

2.2.1.1 普通肉湯培養(yǎng)基制備

取一定比例的普通肉湯培養(yǎng)基加熱溶于水中并不斷攪拌至煮沸，煮沸1min后裝于三角燒瓶，于高壓鍋滅菌后分裝于試管中。

2.2.1.2 斜面培養(yǎng)基制備

取一定比例的胰蛋白胨大豆瓊脂于水中加熱煮沸至完全溶解，用高壓鍋滅菌后，分裝于試管中，將試管斜放，凝固后制成斜面培養(yǎng)基。

2.2.1.3 普通瓊脂培養(yǎng)基制備

取一定比例的胰蛋白胨大豆瓊脂于水中加熱煮沸至完全溶解，分裝于平板中，用高壓鍋滅菌后，冷卻待用。

2.2.1.4 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基制備

2.2.1.5 麥康凱培養(yǎng)基制備

取一定比例的麥康凱瓊脂于水中加熱煮沸至完全溶解，分裝于平板中，用高壓鍋滅菌后，冷卻待用。

2.2.1.6 血液瓊脂培養(yǎng)基制備

取一定比例的胰蛋白胨大豆瓊脂于水中加熱煮沸至完全溶解，用高壓鍋滅菌后冷卻至55℃左右，將適量兔血脫纖后加入其中混合均勻，分裝于平板中，冷卻待用。

2.2.1.7 半固體培養(yǎng)基制備

取適量瓊脂粉加熱溶于肉湯中至完全溶解，分裝于試管中，用高壓鍋滅菌后，冷卻待用。

2.2.2 涂片及染色

無菌操作用接種環(huán)在玻片上滴一滴生理鹽水，然后用滅菌接種環(huán)取病死兔的肝臟、腸粘膜或腸內(nèi)容物與生理鹽水混合進(jìn)行涂片，干燥、固定后進(jìn)行革蘭氏染色，然后用油鏡進(jìn)行觀察細(xì)菌形態(tài)及特點(diǎn)。然后將細(xì)菌接種于斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，無菌操作取培養(yǎng)的菌落進(jìn)行涂片，干燥、固定后進(jìn)行革蘭氏染色，用油鏡進(jìn)行檢查。

但在后工業(yè)化時代里，“真實(shí)”“記憶”逐漸變成了沉重的話題。伯格繼續(xù)寫道，到20世紀(jì)后半葉，歷史的審判已被所有人遺忘，后期資本主義國家由于對過去的恐懼和對未來的盲目，喪失了可信仰的正義和真實(shí)原則轉(zhuǎn)而成為投機(jī)主義者。這種投機(jī)的心態(tài)使得所有的事物都蔚為奇觀，就像電影里的場面。相機(jī)變成一種工具，表演的場面造就出一種我們所期望的“永恒現(xiàn)在式”。換句話說，記憶和真實(shí)不再是不可或缺和讓人期待的。攝影為我們卸下了記憶和真實(shí)的負(fù)擔(dān)，它像上帝一樣監(jiān)督著我們，同時也被我們所監(jiān)督。[8]57

2.2.3 分離培養(yǎng)與觀察

無菌操作用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)基上的菌落，分別在普通瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分區(qū)劃線。在生化培養(yǎng)箱中37℃恒溫24h后，觀察單個典型菌落的形態(tài)特點(diǎn)。

2.2.4 運(yùn)動性觀察

用滅菌的接種針取培養(yǎng)的純菌，在無菌環(huán)境下將接種針垂直刺入半固體培養(yǎng)基中，在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察細(xì)菌運(yùn)動情況。

2.2.5 生化試驗(yàn)

用滅菌的接種針取培養(yǎng)的純菌，接種在生化管內(nèi)，在生化培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。

2.3 動物致病性試驗(yàn)

2.3.1 雞胚接種

照蛋后畫出氣室及大血管的位置，酒精消毒后用大針在記號處鉆一小孔待用。用注射取24h肉湯培養(yǎng)的菌液0.3ml從小孔處注入雞胚尿囊腔中，用石蠟封孔后，將雞胚放入生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵化，3d后觀察結(jié)果。

2.3.2 雛雞接種

將雛雞分為試驗(yàn)組和對照組，每組3只。用注射器吸取24h肉湯培養(yǎng)的菌液0.5ml垂直注入試驗(yàn)組雛雞腹腔，對照組雛雞腹腔注射0.5ml滅菌的生理鹽水，將雛雞繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。

2.3.3 小白鼠接種

將小白鼠分為試驗(yàn)組和對照組，每組3只。用注射器吸取24h肉湯培養(yǎng)的菌液0.5ml垂直注入試驗(yàn)組雛雞腹腔，對照組雛雞腹腔注射0.5ml滅菌的生理鹽水，將雛雞繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。

2.4 藥敏試驗(yàn)

無菌操作用滅菌接種環(huán)取純培養(yǎng)物在盛有滅菌生理鹽水的試管中混勻，將菌液倒入普通瓊脂培養(yǎng)基中，晃勻后將菌液倒出。然后用滅菌的鑷子分別夾取不同的藥敏片放在培養(yǎng)基上（注意藥敏片之間距離相等并保持一定的距離），然后將培養(yǎng)基放在生化培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。

3 試驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 臨床診斷結(jié)果

根據(jù)臨床癥狀和病理剖檢變可初步確診該兔病由魏氏梭菌感染引起。

3.2 涂片染色結(jié)果

革蘭氏染色后，油鏡觀察為革蘭氏陽性的梭狀桿菌，菌體較大，單個存在或多個成簇存在，有的形成圓形或橢圓形的芽孢，位于中央或近端，呈梭狀，符合魏氏梭菌的形態(tài)特征。

3.3 分離培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)菌在肉湯中形成明顯渾濁，試管底部有云霧狀渾濁；在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，形成乳白色光滑圓形菌落；在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基不生長；在血液瓊脂平板上有灰白色、邊緣不整似鋸齒樣、表面光滑隆起、直徑約2～4mm的菌落，周圍有明顯的溶血環(huán)。符合魏氏梭菌的生長特性。

3.4 運(yùn)動性觀察結(jié)果

該菌在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察細(xì)菌沿穿刺線生長，說明該菌無鞭毛生長，符合魏氏梭菌的生長特征。

3.5 生化試驗(yàn)結(jié)果

本菌在厭氧條件下能分解乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能發(fā)酵甘露醇。符合魏氏梭菌的生化試驗(yàn)特性。

3.6 雞胚接種結(jié)果

經(jīng)尿囊腔接種雞胚死亡，剖檢雞胚腸道有出血變化。無菌操作用接種環(huán)在雞胚的腸粘膜取病料，革蘭氏染色后，在油鏡下觀察為魏氏梭菌。

3.7 雛雞接種結(jié)果

試驗(yàn)組雛雞腹腔接種12～24h死亡。死雛出現(xiàn)了急劇下痢，并混有血液，剖檢主要病理變化與自然感染的病例相似，腸道出血且肝臟腫大土黃色。無菌操作用接種環(huán)在死雛的腸粘膜取病料，革蘭氏染色后，在油鏡下觀察為魏氏梭菌。對照組雛雞正常。

3.8 小白鼠接種結(jié)果

試驗(yàn)組小白鼠腹腔接種12～24h死亡。死亡小白鼠出現(xiàn)了出血性下痢，剖檢主要病理變化為腸道充滿氣體高度腫脹。無菌操作用接種環(huán)在死亡小白鼠的腸粘膜取病料，革蘭氏染色后，在油鏡下觀察為魏氏梭菌。對照組小白鼠正常。

3.9 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株對氟苯尼考、頭孢菌素、慶大霉素等高度敏感，對紅霉素、新霉素、阿莫西林中度敏感，對青霉素、卡那霉素、土霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明產(chǎn)生了耐藥。

4 討論

（1）通過臨床診斷、病理剖檢及實(shí)驗(yàn)室診斷確定該分離菌株為魏氏梭菌，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，找出了對本菌的有效藥物，能夠及時防治疾病。

（2）通過對小白鼠、雞胚和雛雞的接種，可以判斷該分離菌株為致病菌。

（3）通過對細(xì)菌來源及生活環(huán)境的調(diào)查，得出該菌存在廣泛，對兔的感染主要是通過腐敗的食物而傳染，以及臟亂等含菌較多的環(huán)境，因此在日常養(yǎng)殖中，要做到飼喂安全營養(yǎng)的飼料并保持好環(huán)境衛(wèi)生，防止細(xì)菌的傳染傳播。

（4）正確的飼養(yǎng)可減少本病的發(fā)生；采用較低能量、較高纖維素的日糧可明顯減少腹瀉死亡率。一旦發(fā)現(xiàn)病兔或疑似病兔，應(yīng)立即隔離或淘汰。預(yù)防方法可用魏氏梭菌氫氧化鋁滅活菌苗，每只兔皮下注射2ml，7d后開始產(chǎn)生免疫力，免疫期4～6個月。

（5）本病常規(guī)治療，可內(nèi)服土霉素、四環(huán)素，均有一定的療效。但本次藥物敏感性試驗(yàn)該分離菌對氟苯尼考、頭孢菌素、慶大霉素高度敏感，兔在應(yīng)用氟苯尼考、頭孢菌素治療時應(yīng)嚴(yán)格掌握劑量，否則極易引起中毒，應(yīng)慎用。另外可用高免血清治療本病效果也較好。其方法是發(fā)現(xiàn)患病兔瀉痢后，視病兔大小，每只皮下注射高免血清5～10ml，每天1次，連用2～3d即可康復(fù)。